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        玉米加工副產(chǎn)品黃曲霉毒素的檢測

        2021-08-13 08:56:54范紅霞
        商品與質(zhì)量 2021年30期
        關(guān)鍵詞:噴漿黃曲霉微孔

        范紅霞

        諸城興貿(mào)玉米開發(fā)有限公司 山東諸城 262200

        1 黃曲霉毒素的危害

        黃曲霉毒素對人和讀物健康的危害均與黃曲霉毒素抑制蛋白質(zhì)的合成有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),黃曲霉毒素具有很強(qiáng)的致癌性、致突變性和致畸性,能使魚類、禽類、家畜和靈長類動物誘發(fā)實(shí)驗(yàn)性肝癌,只要病變?yōu)楦闻K出血、壞死、膽管增生、肝硬化等。經(jīng)大量的流行病學(xué)調(diào)查證實(shí),黃曲霉毒素的高攝入量和人類肝癌的發(fā)病率密切相關(guān)。

        2 玉米加工副產(chǎn)品黃曲霉毒素檢測方法綜述

        目前黃曲霉毒素檢測常用的方法如下幾種:

        2.1 薄層層析法(TLC)

        TLC法是針對不同的樣品,用適宜的提取溶劑將霉菌毒素從樣品中提取出來,經(jīng)柱層析凈化,再在薄層板上層析展開、分離,利用霉菌毒素的熒光性,根據(jù)熒光斑點(diǎn)的強(qiáng)弱與標(biāo)準(zhǔn)比較測定其最低含量。

        2.2 色譜法

        色譜法包括薄層色譜,氣相色譜、液相色譜等,一直是最重要的霉菌毒素的化學(xué)分析方法。現(xiàn)在比較普遍的霉菌毒素的分析方法還是液相色譜法,包括液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)。

        2.3 熒光光度法(IAC/SAB)

        試樣經(jīng)過甲醛水提取,提取液經(jīng)過過濾、稀釋后,濾液經(jīng)過含有AFT特殊抗體的免疫親和柱凈化。此抗體對AFT具有專一識別能力。AFT鍵合在分離柱中的抗體上。用蒸餾水將免疫親和柱上雜質(zhì)除去,以甲醇通過分離柱洗脫。加顯色劑于專用的熒光劑測定樣品中法AFT含量。

        2.4 酶聯(lián)免疫法(ELISA)

        ELISA法也是近年來研究出來的一種較為新穎的方法。是將抗體抗元反應(yīng)的特異性和酶與底物顯色反應(yīng)的高效催化作用有機(jī)結(jié)合而成的免疫分析技術(shù)。樣品中的黃曲霉毒素B1與定量特異抗體反應(yīng),多余的游離抗體與固相包被抗原結(jié)合,加入酶標(biāo)記物和底物后顯色,與標(biāo)準(zhǔn)線比較計(jì)算含量。

        在這里我主要是研究黃曲霉毒素B1的ELISA方法。

        3 實(shí)驗(yàn)部分

        3.1 ELISA檢測玉米副產(chǎn)品中黃曲霉毒素B1

        3.1.1 設(shè)備與試劑

        酶標(biāo)儀(MK3芬蘭雷勃公司),高速萬能粉碎機(jī)(天津泰斯特),回旋式振蕩器(HY-5),微量移液管(芬蘭雷勃公司),分析天平(AL204型,量程10mg-210g,梅特勒.托利多公司),醫(yī)用離心機(jī)(江蘇欣康醫(yī)療),量筒25ML,三角瓶100mL,移液管25ML,離心管10ML,定性濾紙,,ELISE測試試劑盒(上海千慕生物技術(shù)有限公司)甲醇(AR級國藥試劑公司),NaCl(AR級)

        3.1.2 樣品采集

        本實(shí)驗(yàn)所用樣品系于2021年3月17日從車間所取,根據(jù)國家取樣標(biāo)準(zhǔn)在,采集有代表性的樣品。

        參照有關(guān)文件的方法進(jìn)行樣品制備,將樣品粉碎后過篩,充分混合。取蛋白粉、噴漿玉米皮、胚芽餅各5克于100ml的容量瓶中,并添加1gNaCl,25ML70%甲醇水溶液,充分震蕩3分鐘;取10ML濾液以3500xg離心5分鐘,收集上清液。即為待測樣。

        3.1.3 ELISA檢測步驟

        試劑的準(zhǔn)備。從冰箱中取出黃曲霉毒素B1酶聯(lián)免疫試劑盒,平衡至室溫,并在室溫下保持至少1小時(shí)。

        分析步驟:①預(yù)先安排好實(shí)驗(yàn)流程,記錄好每個標(biāo)準(zhǔn)品/樣品的位置;②添加100ul酶耦合劑到每個預(yù)混合孔;③添加50ulAFB1系列標(biāo)準(zhǔn)溶液(0ppb,1ppb,5ppb,20ppb,40ppb)和樣品到相應(yīng)的預(yù)混孔;④用微量移液槍,混合每個預(yù)混合孔中的內(nèi)容物,立即將100ul轉(zhuǎn)移到相應(yīng)的抗黃曲霉毒素B1抗體包被的微孔中;⑤于室溫孵育10分鐘;⑥洗板孵育結(jié)束后倒掉孔中的液體、用稀釋后的稀釋液填滿微孔,倒掉微孔中的液體,重復(fù)清洗三次;將微孔板倒扣在濾紙上并輕輕敲打,清除殘留的液滴;⑦發(fā)展添加100ul發(fā)展液到每個微孔中,徹底混合幾秒鐘;⑧室溫條件下孵育5分鐘;⑨添加50ul終止液到每個微孔中,并徹底混合幾秒中;10、在450nm處測定吸光度值,在15分鐘內(nèi)度數(shù)[1]。

        4 結(jié)果與分析

        將每個標(biāo)準(zhǔn)品/樣品的吸光度值圖一標(biāo)準(zhǔn)0(B0)的吸光度并乘以100、因此,最大結(jié)合(B0)等于100%,吸光度值以百分比表示;標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值(或樣品)/零標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值×100=B/B0(%)根據(jù)每個標(biāo)準(zhǔn)品的B/B0值和黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品濃度繪制曲線;將每個樣品的B/B0值插入校準(zhǔn)曲線中得到相應(yīng)濃度。標(biāo)準(zhǔn)品濃度已經(jīng)考慮了樣品稀釋因子,對于所做樣品,如果提取物稀釋5倍,則將所得濃度值乘以5[2]。

        5 標(biāo)準(zhǔn)曲線

        圖1 Aflatoxin B1(PPb)

        6 結(jié)果評估

        樣品序號 ID 吸光度值(mean)(CV)B/B0(%)計(jì)算(ppb) *= ppb(%)1 蛋白粉 1.187 0.0 78.8 1.3 5.0 6.7 2 噴漿玉米皮 0.925 0.0 61.4 3.3 5.0 16.4 3 胚芽餅 1.085 0.0 72 2.0 5.0 9.9 4 蛋白粉 1.116 0.0 74.1 1.8 5.0 8.8 5 噴漿玉米皮 0.712 0.0 47.3 6 5.0 30.0 6 胚芽餅 0.484 0.0 32.1 11.8 5.0 58.8

        根據(jù)試劑盒給定的參數(shù),所測樣品均在數(shù)據(jù)要求的范圍內(nèi),本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效。

        由于原料的不同,所測得的數(shù)據(jù)會得出不同的結(jié)果。

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