范紅霞

諸城興貿(mào)玉米開發(fā)有限公司 山東諸城 262200

1 黃曲霉毒素的危害

黃曲霉毒素對人和讀物健康的危害均與黃曲霉毒素抑制蛋白質(zhì)的合成有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，黃曲霉毒素具有很強(qiáng)的致癌性、致突變性和致畸性，能使魚類、禽類、家畜和靈長類動物誘發(fā)實驗性肝癌，只要病變?yōu)楦闻K出血、壞死、膽管增生、肝硬化等。經(jīng)大量的流行病學(xué)調(diào)查證實，黃曲霉毒素的高攝入量和人類肝癌的發(fā)病率密切相關(guān)。

2 玉米加工副產(chǎn)品黃曲霉毒素檢測方法綜述

目前黃曲霉毒素檢測常用的方法如下幾種：

2.1 薄層層析法（TLC）

TLC法是針對不同的樣品，用適宜的提取溶劑將霉菌毒素從樣品中提取出來，經(jīng)柱層析凈化，再在薄層板上層析展開、分離，利用霉菌毒素的熒光性，根據(jù)熒光斑點的強(qiáng)弱與標(biāo)準(zhǔn)比較測定其最低含量。

2.2 色譜法

色譜法包括薄層色譜，氣相色譜、液相色譜等，一直是最重要的霉菌毒素的化學(xué)分析方法?，F(xiàn)在比較普遍的霉菌毒素的分析方法還是液相色譜法，包括液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)。

2.3 熒光光度法（IAC/SAB）

試樣經(jīng)過甲醛水提取，提取液經(jīng)過過濾、稀釋后，濾液經(jīng)過含有AFT特殊抗體的免疫親和柱凈化。此抗體對AFT具有專一識別能力。AFT鍵合在分離柱中的抗體上。用蒸餾水將免疫親和柱上雜質(zhì)除去，以甲醇通過分離柱洗脫。加顯色劑于專用的熒光劑測定樣品中法AFT含量。

2.4 酶聯(lián)免疫法（ELISA）

ELISA法也是近年來研究出來的一種較為新穎的方法。是將抗體抗元反應(yīng)的特異性和酶與底物顯色反應(yīng)的高效催化作用有機(jī)結(jié)合而成的免疫分析技術(shù)。樣品中的黃曲霉毒素B1與定量特異抗體反應(yīng)，多余的游離抗體與固相包被抗原結(jié)合，加入酶標(biāo)記物和底物后顯色，與標(biāo)準(zhǔn)線比較計算含量。

在這里我主要是研究黃曲霉毒素B1的ELISA方法。

3 實驗部分

3.1 ELISA檢測玉米副產(chǎn)品中黃曲霉毒素B1

3.1.1 設(shè)備與試劑

酶標(biāo)儀（MK3芬蘭雷勃公司），高速萬能粉碎機(jī)（天津泰斯特），回旋式振蕩器（HY-5），微量移液管（芬蘭雷勃公司），分析天平（AL204型，量程10mg-210g，梅特勒.托利多公司），醫(yī)用離心機(jī)（江蘇欣康醫(yī)療），量筒25ML，三角瓶100mL，移液管25ML，離心管10ML，定性濾紙，，ELISE測試試劑盒（上海千慕生物技術(shù)有限公司）甲醇（AR級國藥試劑公司），NaCl（AR級）

3.1.2 樣品采集

本實驗所用樣品系于2021年3月17日從車間所取，根據(jù)國家取樣標(biāo)準(zhǔn)在，采集有代表性的樣品。

參照有關(guān)文件的方法進(jìn)行樣品制備，將樣品粉碎后過篩，充分混合。取蛋白粉、噴漿玉米皮、胚芽餅各5克于100ml的容量瓶中，并添加1gNaCl，25ML70%甲醇水溶液，充分震蕩3分鐘；取10ML濾液以3500xg離心5分鐘，收集上清液。即為待測樣。

3.1.3 ELISA檢測步驟

試劑的準(zhǔn)備。從冰箱中取出黃曲霉毒素B1酶聯(lián)免疫試劑盒，平衡至室溫，并在室溫下保持至少1小時。

分析步驟：①預(yù)先安排好實驗流程，記錄好每個標(biāo)準(zhǔn)品/樣品的位置；②添加100ul酶耦合劑到每個預(yù)混合孔；③添加50ulAFB1系列標(biāo)準(zhǔn)溶液（0ppb，1ppb，5ppb，20ppb，40ppb）和樣品到相應(yīng)的預(yù)混孔；④用微量移液槍，混合每個預(yù)混合孔中的內(nèi)容物，立即將100ul轉(zhuǎn)移到相應(yīng)的抗黃曲霉毒素B1抗體包被的微孔中；⑤于室溫孵育10分鐘；⑥洗板孵育結(jié)束后倒掉孔中的液體、用稀釋后的稀釋液填滿微孔，倒掉微孔中的液體，重復(fù)清洗三次；將微孔板倒扣在濾紙上并輕輕敲打，清除殘留的液滴；⑦發(fā)展添加100ul發(fā)展液到每個微孔中，徹底混合幾秒鐘；⑧室溫條件下孵育5分鐘；⑨添加50ul終止液到每個微孔中，并徹底混合幾秒中；10、在450nm處測定吸光度值，在15分鐘內(nèi)度數(shù)[1]。

4 結(jié)果與分析

將每個標(biāo)準(zhǔn)品/樣品的吸光度值圖一標(biāo)準(zhǔn)0（B0）的吸光度并乘以100、因此，最大結(jié)合（B0）等于100%，吸光度值以百分比表示；標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值（或樣品）/零標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值×100=B/B0（%）根據(jù)每個標(biāo)準(zhǔn)品的B/B0值和黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品濃度繪制曲線；將每個樣品的B/B0值插入校準(zhǔn)曲線中得到相應(yīng)濃度。標(biāo)準(zhǔn)品濃度已經(jīng)考慮了樣品稀釋因子，對于所做樣品，如果提取物稀釋5倍，則將所得濃度值乘以5[2]。

5 標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖1 Aflatoxin B1（PPb）

6 結(jié)果評估

樣品序號 ID 吸光度值（mean）（CV）B/B0（%）計算（ppb） *= ppb（%）1 蛋白粉 1.187 0.0 78.8 1.3 5.0 6.7 2 噴漿玉米皮 0.925 0.0 61.4 3.3 5.0 16.4 3 胚芽餅 1.085 0.0 72 2.0 5.0 9.9 4 蛋白粉 1.116 0.0 74.1 1.8 5.0 8.8 5 噴漿玉米皮 0.712 0.0 47.3 6 5.0 30.0 6 胚芽餅 0.484 0.0 32.1 11.8 5.0 58.8

根據(jù)試劑盒給定的參數(shù)，所測樣品均在數(shù)據(jù)要求的范圍內(nèi)，本次實驗結(jié)果有效。

由于原料的不同，所測得的數(shù)據(jù)會得出不同的結(jié)果。