缺血性腦卒中是威脅人類健康的主要疾病，具有高致死率、高致殘率、高復(fù)發(fā)率等特點，而且其發(fā)病率仍在上升[1-3]。腦缺血損傷被認(rèn)為是缺血性腦卒中最基本的一個復(fù)雜發(fā)病機制，涉及多種生命活動，如神經(jīng)元凋亡[4]、星形膠質(zhì)細(xì)胞活化[5]、促炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激[6]，腦缺血導(dǎo)致局部血液阻塞，大量缺氧、缺糖從而造成大腦損傷。盡管目前對腦缺血損傷的治療有了長足的進展，但對于大量的腦缺血病人來說，其治療效果仍不理想，究其原因主要是因為對病理過程缺乏清晰的認(rèn)識。因此，闡明缺血性腦卒中的分子機制對于腦缺血損傷的有效治療具有重要意義。

microRNAs(miRNAs)是一種短的非編碼RNA，常見于轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因的表達，主要與靶向信使RNA的3′-非翻譯區(qū)結(jié)合，從而達到調(diào)節(jié)細(xì)胞的活動[6]?，F(xiàn)有研究表明miR-19a-3p是miR-17-92的一個重要組成部分，與肺癌、胃癌、乳腺癌、肝細(xì)胞癌等疾病的發(fā)生有關(guān)。此外，miR-19a-3p在膠質(zhì)瘤細(xì)胞和星形細(xì)胞膠質(zhì)瘤組織中過表達，并與膠質(zhì)瘤病人的惡性程度密切相關(guān)，是膠質(zhì)瘤發(fā)生的重要因素之一。更重要的是，miR-17-92簇在小鼠神經(jīng)前體細(xì)胞中表達上調(diào)，miR-17-92無論是在培養(yǎng)的缺血神經(jīng)前體細(xì)胞中還是在缺血動物的心室下區(qū)的過度表達都明顯促進了細(xì)胞的增殖，而miR-17-92、miR-18a和miR-19a-3p單個成分的抑制，阻礙了細(xì)胞增殖并增強細(xì)胞死亡[7]，miR-19a-3p在腦缺血損傷中的作用機制尚不確切。因此，本研究觀察大鼠體內(nèi)腦缺血神經(jīng)元損傷模型(I/R)和體外缺氧缺糖細(xì)胞模型(OGD)中miR-19a-3p在腦缺血損傷中的作用，以此闡明作用機制。

1 材料與方法

1.1 神經(jīng)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的分離培養(yǎng) 神經(jīng)細(xì)胞：從新生sprague-dawley(SD)大鼠身上分離到原代神經(jīng)元細(xì)胞。用0.125%胰蛋白酶消化海馬組織10 min，分離離心后，將獲得的神經(jīng)元細(xì)胞接種于6孔板上，作用12 h。細(xì)胞維持在含2%B27、1%谷氨酰胺和阿糖胞苷的神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基，于37 ℃下5% 的二氧化碳環(huán)境中培養(yǎng)。為了建立OGD模型，神經(jīng)元需在37 ℃、5%二氧化碳脫氧無糖Hanks平衡鹽溶液中培養(yǎng)。95% 氮氣處理24 h，然后在常溫條件下培養(yǎng)即可。

星形膠質(zhì)細(xì)胞：從新生SD大鼠中分離出原代星形膠質(zhì)細(xì)胞。新皮質(zhì)解剖后用0.09%胰蛋白酶處理25 min；獲得的單個細(xì)胞離心接種于經(jīng)聚d-賴氨酸(sigma-aldrich)處理的6孔板中；用Eagle′s Minimal Essential培養(yǎng)基，10% FBS、21 mmol/L葡萄糖和10% EGF(Gibco，USA)37 ℃和5%二氧化碳培養(yǎng)皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞。

1.2 大鼠缺血性腦卒中模型的建立 隨機抽取6只正常飼養(yǎng)大鼠，(8～10)周齡，體質(zhì)量(200±12)g，作為對照組；同時抽取6只正常建模缺血性腦卒中模型成年雄性SD大鼠，(8～10)周齡，體質(zhì)量(200±12)g，作為I/R模型組。I/R模型由廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院進行腦動脈阻塞建立而來，合格證號為SCXK2018-0008。所有大鼠均用濃度為100 mg/kg的戊巴比妥鈉麻醉。右側(cè)頸內(nèi)動脈、大腦中動脈尼龍線結(jié)扎90 min，自由活動24 h后處死，并提取細(xì)胞按照1.1中描述方式處理后，分為OGD模型組及正常培養(yǎng)的空白對照組備用。

1.3 葡萄糖代謝變化測定 用葡萄糖攝取比色分析試劑盒評估葡萄糖的攝取和乳酸的產(chǎn)生。乳酸比色測定試劑盒為Sigma Aldrich，USA提供。

1.4 蛋白表達檢測(Western blot) 使用RIPA裂解緩沖液(Beyotime，上海，中國)分離總提取蛋白，并使用BCA試劑盒(Beyotime)進行檢測。20 μg蛋白質(zhì)通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行分離。隨后使用LDHA(1∶1 000，Abcam，美國)、PKM2(1∶1 000，Abcam)、HK2(1∶1 000，Abcam)、Glut1(1∶1 000，Abcam)、PDK1(1∶1 000，Abcam)、Bim(1∶1 000，Abcam)、Bax(1∶1 000，Abcam)、caspase-9(1∶500，Abcam)、ADIPOR2(1∶1 000，Abcam)和GAPDH(1∶1 000，Beyotime)作為一級抗體，GAPDH作為對照進行檢測。

1.5 TUNEL染色 使用TUNEL凋亡檢測試劑盒(Beyotime)對細(xì)胞凋亡進行檢測。TUNEL染色后，用DAPI孵育細(xì)胞，使用熒光顯微鏡(Fluoview FV1000，Olympus，日本)成像，并在5個隨機場下計數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 miR-19a-3p在神經(jīng)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達 神經(jīng)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞對于缺血性腦卒中是兩個重要的組成部分，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-19a-3p在神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達是不同的，miR-19a-3p在神經(jīng)元細(xì)胞中的表達水平低于星形膠質(zhì)細(xì)胞(P<0.01)。詳見圖1。I/R大鼠體內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞以及體外培養(yǎng)的OGD神經(jīng)元細(xì)胞，miR-19a-3p表達上調(diào)(P<0.01)。詳見圖2、圖3。表明miR-19a-3p可能參與或直接導(dǎo)致了缺血性腦卒中。

與神經(jīng)元細(xì)胞比較，＊P<0.01。

與對照組比較，＊P<0.01。

與對照組比較,＊P<0.01。

2.2 I/R與OGD模型中糖代謝的抑制 缺血性腦卒中可導(dǎo)致細(xì)胞能量的喪失進而促使細(xì)胞死亡。檢測I/R與OGD模型中糖酵解酶相關(guān)因子LDHA、PKM2、 HK2、 Glut1 和 PDK1的表達水平，同時檢測葡萄糖攝取和乳酸的產(chǎn)生情況。I/R大鼠模型中，糖酵解酶相關(guān)因子LDHA、 PKM2、 HK2、 Glut1 和 PDK1表達水平低于對照組(P<0.01)；葡萄糖的吸收水平和乳酸生成水平也低于對照組(P<0.01)?？梢姳ＷC葡萄糖代謝有助于改善缺血性腦損傷。詳見圖4～圖6。

與對照組比較，＊P<0.01。

與對照組比較，＊P<0.01。

與對照組比較，＊P<0.01。

2.3 OGD模型中的細(xì)胞凋亡 用Tunel和Western Blot檢測OGD模型中誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白。細(xì)胞凋亡標(biāo)記物Bax、Bim和Caspase-9在OGD神經(jīng)元中被檢測到表達上調(diào)，但對照組中未檢測到(P<0.01)。詳見圖7。

與對照組比較，＊P<0.01。

2.4 miR-19a-3p通過靶向脂聯(lián)素受體2抑制葡萄糖攝取并促進神經(jīng)元凋亡 為了探究miR-19a-3p表達與葡萄糖代謝的關(guān)系，將miR-19a-3p或抑制劑轉(zhuǎn)染到OGD模型組，與對照組神經(jīng)元細(xì)胞同時培養(yǎng)進行對照，觀察其凋亡情況。實驗發(fā)現(xiàn)當(dāng)miR-19a-3p轉(zhuǎn)染后，糖酵解酶的表達、葡萄糖攝取和乳酸生成均降低(P<0.01)。詳見圖8～圖10。

與對照組比較，＊P<0.01。

與對照組比較，＊P<0.01。

與對照組比較，＊P<0.01。

2.5 脂聯(lián)素受體2介導(dǎo)miR-19a-3p在腦缺血損傷中的作用機制 在缺血性腦卒中時，脂聯(lián)素受體2是miR-19a-3p的功能效應(yīng)器，盡管實驗結(jié)果表明了脂聯(lián)素受體2是miR-19a-3p的真正靶點，但此并不意味著miR-19a-3p在I/R損傷中的致病作用為脂聯(lián)素受體2介導(dǎo)的。為了確定這一點，用帶有靶點脂聯(lián)素受體2的siRNA，單獨或帶有miR-19a-3p抑制劑去轉(zhuǎn)染OGD神經(jīng)元。脂聯(lián)素受體2在對照組中沉默，而與miR-19a抑制劑共轉(zhuǎn)染則減輕了葡萄糖攝取和乳酸的產(chǎn)生(見圖11、圖12)，miR-19a-3p介導(dǎo)的缺血性腦損傷至少部分是由于脂聯(lián)素受體2的下調(diào)所引起的。

與對照組比較，＊P<0.01。

與對照組比較，＊P<0.01。

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，miR-19a-3p在I/R和ODG模型中有著較高的表達，進一步實驗表明，miR-19a-3p的抑制有效緩解了I/R/OGD誘導(dǎo)的糖酵解酶表達、葡萄糖攝取和乳酸生成，同時可通過靶向脂聯(lián)素受體2調(diào)節(jié)神經(jīng)元凋亡。因此，miR-19a-3p升高在腦缺血損傷發(fā)病中起著重要的作用。

星形膠質(zhì)細(xì)胞被認(rèn)為是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中數(shù)量最多的細(xì)胞，與神經(jīng)元相互作用以維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)環(huán)境的穩(wěn)定性。腦缺血后星形膠質(zhì)細(xì)胞增生、代謝儲備增強，神經(jīng)元凋亡延遲。miRNA異常表達水平與腦缺血受傷模型相關(guān)[8]。miR-19a-3p被發(fā)現(xiàn)于各種癌癥，尤其是星形細(xì)胞瘤，通常呈現(xiàn)過度表達水平[9]。此外，它的過度表達發(fā)生在培養(yǎng)的神經(jīng)缺血中祖細(xì)胞和促進細(xì)胞增殖[10]，這意味著miR-19a-3p具有發(fā)揮神經(jīng)細(xì)胞功能調(diào)節(jié)的作用。本研究觀察到miR-19a-3p在星形膠質(zhì)細(xì)胞中高表達，在神經(jīng)元中低表達，提示miR-19a-3p可能對神經(jīng)受損功能具有保護作用。

在腦缺血期間，由于完全停止缺血核心區(qū)的葡萄糖和氧氣供應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞遭受不可逆轉(zhuǎn)的損傷。因此，改善糖代謝和控制神經(jīng)細(xì)胞凋亡對改善腦缺血損傷具有重要意義。盡管本研究結(jié)果沒有顯示出具體的特異下游效應(yīng)器，但miR-19a-3p的修飾卻影響著糖酵解酶和神經(jīng)元凋亡過程。

ADIPOR2編碼脂聯(lián)素受體2，與心血管疾病、脂肪肝、糖尿病、糖尿病腎病和骨代謝紊亂有關(guān)。在每一種致病條件下，ADIPOR2的過度表達都能改善疾病的進程。ADIPOR2過表達和缺血性中風(fēng)之間的相關(guān)性也已經(jīng)被證實[11]。本實驗證實了這些發(fā)現(xiàn)，并強調(diào)了檢驗腺病毒介導(dǎo)的ADIPOR2在腦缺血損傷的體內(nèi)外模型中過表達將是一種可行的治療干預(yù)措施。最近有報道表明，在腦缺血腦損傷代謝中，星形膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞-神經(jīng)元會相互作用，星形膠質(zhì)細(xì)胞有待進一步研究。此外，miR-19a-3p的其他靶點作用也需進一步研究。