王轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)，陰懷清2，師 睿

缺氧缺血性腦病(HIE)是一種新生兒常見的腦損傷疾病，死亡率高，易長期致殘如智力低下、腦癱、癲癇發(fā)作和學習障礙[1]，嚴重者造成極大的家庭、社會負擔，臨床上對該病缺乏有效的治療。依達拉奉在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用，被認為是治療腦梗死等缺血性疾病有效的藥物，但依達拉奉是否可應用于治療新生兒HIE尚少見報道。因此，本實驗通過建立缺氧缺血性腦損傷模型，觀察依達拉奉干預后腦組織中神經(jīng)細胞凋亡半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)和缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)表達的變化，探討依達拉奉腦保護的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與分組 由山西醫(yī)科大學實驗中心提供7日齡SD新生大鼠108只，雌雄不限，平均體質(zhì)量15 g。隨機分為A組、B組、C組，每組36只。各組再根據(jù)處死時間6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、5 d分為6個亞組，每個亞組6只。

1.2 試劑與藥品的配制 一抗(兔抗鼠HIF-1α、Caspase-3)和二抗(即用型SABC試劑盒)及原位末端標記法(TUNEL)細胞凋亡試劑盒(購自武漢博士德生物技術有限公司)。規(guī)格5 mL/10 mg的依達拉奉注射液，用生理鹽水(體積比1∶4)稀釋為0.3 mg/L。

1.3 缺氧缺血性腦損傷(HIBD)模型制備與干預方法 參照Rice等[2]方法制備HIBD模型。A組為假手術組，動物只切開頸部皮膚并游離出左頸總動脈后直接縫合皮膚，不進行結扎和缺氧處理；B組為HIBD模型組；C組在HIBD模型的基礎上給予腹腔注射依達拉奉4 mg/kg，間隔24 h給藥1次，直至處死。造模后各組動物放入飼養(yǎng)籠中母乳喂養(yǎng)至相應時間。

1.4 標本留取 各組分別于造模后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、5 d處死，斷頭取腦，10%甲醛室溫固定24 h后留取視交叉中點前后4～5 mm的腦組織，脫水，石蠟包埋，形成實驗所需組織。

1.5 蘇木精-伊紅(HE)染色、免疫組織化學法及TUNEL檢測 石蠟包埋，冠狀位切片，行HE染色，觀察細胞形態(tài)及結構變化；免疫組化法檢測Caspase-3和HIF-1α的表達；TUNEL法檢測神經(jīng)細胞凋亡。Caspase-3陽性染色信號定位于細胞質(zhì)，染色為棕黃色顆粒，HIF-1α陽性染色信號定位于細胞核和(或)細胞質(zhì)，染色呈棕黃色顆粒。

1.6 圖像采集及數(shù)據(jù)收集 應用美國Aperio公司Scansaope數(shù)字病理掃描系統(tǒng)，經(jīng)計算機掃描、取圖，統(tǒng)計出陽性細胞數(shù)/高倍視野(×400)，取平均值。計數(shù)大腦皮層凋亡細胞，計算凋亡率(%)，即凋亡指數(shù)(AI)，取平均值。

2 結 果

2.1 神經(jīng)行為改變情況 A組新生大鼠無異常神經(jīng)行為變化，B組造模后全部發(fā)生不同程度的行為異常改變，主要表現(xiàn)為：躁動不安，活動增加，頭部和軀體的持續(xù)顫抖；后逐漸由興奮轉(zhuǎn)為抑制，活動明顯減少，出現(xiàn)嗜睡，少數(shù)出現(xiàn)驚厥。C組異常表現(xiàn)不如B組明顯。

2.2 腦組織病理變化 A組各個時間點腦組織解剖層次清晰，神經(jīng)細胞排列整齊，形態(tài)正常，核深染，核仁清楚，無神經(jīng)細胞缺失；B組、C組均見大腦組織神經(jīng)細胞變少、變形，結構混亂，細胞核縮小、溶解、破碎，符合凋亡的形態(tài)改變；但與C組同一時刻相比，B組的變化更為明顯。詳見圖1。

圖1 各組大鼠大腦皮層腦組織病理圖(×400)

2.3 大腦皮層HIF-1α的表達情況 免疫組織化學染色結果顯示，腦組織HIF-1α陽性細胞主要分布于大腦皮層及海馬，胞核或胞漿呈棕黃色。HIF-1α的表達在A組各時間點基本維持在一個水平；在缺氧6 h開始增強，12 h達高峰，后逐漸下降。C組各時間點HIF-1α的表達水平較B組均明顯下降，但高于A組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表1、圖2。

表1 各組HIF-1α在不同時間點的陽性細胞數(shù)表達比較(±s) 單位：個

圖2 各組大鼠腦組織大腦皮層不同時間點HIF-1α表達情況(DAB×400)

2.4 大腦皮層Caspase-3的表達情況 免疫組織化學染色結果顯示，腦組織Caspase-3陽性細胞主要分布于大腦皮層及海馬，胞漿呈棕黃色。Csapase-3的表達在A組各時間點大致維持在一個水平。C組各時間點Caspase-3的表達水平較B組均明顯下降，仍高于A組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表2、圖3。

表2 各組Caspase-3在不同時間點的陽性細胞數(shù)表達比較(±s) 單位：個

圖3 各組大鼠腦組織大腦皮層不同時間點Caspase-3表達情況(×400)

2.5 大腦皮層凋亡細胞的表達情況 A組大腦皮層偶見或無凋亡細胞，B組6 h后可見神經(jīng)細胞凋亡，之后逐漸增加，5 d達到峰值，C組各時間大腦皮層凋亡神經(jīng)細胞較B組少，但仍高于A組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表3、圖4。

表3 各組不同時間點大腦皮層神經(jīng)細胞凋亡指數(shù)比較(±s) 單位：%

圖4 各組大鼠腦組織大腦皮層不同時間點神經(jīng)細胞凋亡情況(×400)

3 討 論

依達拉奉是一種自由基清除劑，具有親脂基團和高血腦屏障通透性，在保護運動神經(jīng)元免受氧化應激介導的神經(jīng)變性中起著潛在的作用。它能抑制腦自由基引發(fā)的延遲神經(jīng)元死亡[3]，減輕磷脂膜中多不飽和脂肪酸氧化所致的神經(jīng)元凋亡[4]，并通過減少血管內(nèi)皮細胞的損傷從而減輕缺血性腦膜疾病引起的神經(jīng)元損傷[5]。 各種動物模型研究表明，依達拉奉具有神經(jīng)保護作用[6]，依達拉奉能保護神經(jīng)干細胞免受輻射誘導引起的細胞凋亡，并能通過抑制腦損傷中的相關有害分子來治療腦梗死[7]。 Zhang等[8]研究表明，依達拉奉可以改善急性腦梗死病人的神經(jīng)功能障礙。此外，它對各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病也有影響。

HIF是一種轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)節(jié)細胞對缺氧的反應方面似乎很重要。HIF-1活性取決于HIF-1α的表達水平。在常氧條件下，HIF-1α表達保持在較低水平，但缺氧顯著誘導其表達。HIF-1α誘導各種轉(zhuǎn)錄程序，其中包括低氧條件下的多能性因子。 在缺氧缺血期間HIF-1α在神經(jīng)元中的作用存在爭議，認為同時具有促進死亡和抗凋亡的雙重作用。 有研究顯示，通過使用來自成年小鼠HIF-1α敲除的腦細胞，發(fā)現(xiàn)HIF-1α主要促進急性低氧環(huán)境中的凋亡；相反，HIF-1α在新生大鼠中度缺氧再灌注腦卒中模型具有神經(jīng)保護作用[9]。有研究顯示，HIF-1α通過影響促凋亡因子表達，參與新生大鼠缺氧缺血性腦損傷的進程，抑制自身表達，減少神經(jīng)細胞凋亡，減輕腦損傷[10]。在HIE的發(fā)病過程中，凋亡是遲發(fā)性神經(jīng)損傷的主要死亡形式。細胞凋亡是一系列導致Caspase激活和細胞解體的程序性事件，其中Caspase-3在細胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導通路中處于核心位置[11]。有研究表明，腦缺血時HIF-1α不僅能通過調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax 來抑制Caspase-3，還能通過血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)機制、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)通路及ERK信號通路來調(diào)控Caspase-3的活性，從而抑制Caspase級聯(lián)放大反應，最終減少神經(jīng)細胞損傷[12-13]。

本實驗發(fā)現(xiàn)對照組Caspase-3與HIF-1α不表達或者僅有少量表達，HIBD后Caspase-3與HIF-1α明顯增加，推斷Caspase-3與HIF-1α參與了缺氧缺血腦損傷的發(fā)生；建立新生大鼠HIBD模型并給予依達拉奉干預，顯示依達拉奉治療組各時間點腦組織Caspase-3與HIF-1α表達水平較HIBD組均明顯降低，且凋亡細胞明顯減少，此外，治療組各時間點腦組織病理變化較HIBD組輕，說明依達拉奉在一定程度上通過抑制腦組織中Caspase-3與HIF-1α的表達而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。