隨著生活節(jié)奏的加快及老齡化社會的到來，冠心病危險因素發(fā)病率呈上升趨勢，冠心病流行日益嚴峻。我國心血管病患病率持續(xù)上升，目前，冠心病病人約有1 100萬例，心肌梗死是最嚴重的心血管疾病之一，2016年城市死亡率為58.69/10萬，農村為74.72/10萬[1]。預計我國未來將新增2 100萬人急性冠狀動脈事件，可造成700萬人心源性死亡[2]。心肌梗死是冠狀動脈內不穩(wěn)定的粥樣硬化斑塊破裂引起的血栓性阻塞，又因急性心肌缺血可致心肌損傷或壞死。臨床典型表現(xiàn)為心前區(qū)壓榨性疼痛，伴大汗及瀕死感等。2014年專家共識中指出：心肌梗死為本虛標實之證，標實包括寒凝、氣滯、血瘀、痰濁[3]，血瘀為標實之首，占33.42%，氣滯血瘀證為心肌梗死主要的證型之一[4]，中醫(yī)治則當以行氣活血祛瘀為主，兼顧他癥。

丹參味苦，微寒，善治血分，活血祛瘀，可用于胸痹心痛，有“一味丹參，功同四物”之說。川芎辛溫行散走竄，入血走氣，功善行氣活血，通經止痛，走而不守，治血瘀氣滯閉阻等諸痛，譽為“血中之氣藥”?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，丹參具有抗心肌缺血、抑制左心室肥厚、擴張血管及抗動脈粥樣硬化、抗血栓、改善微循環(huán)和促進組織的修復與再生等作用[5]。川芎可以抑制氧自由基釋放、有效改善心肌缺血、調節(jié)心律、擴張血管、增加冠狀動脈血流量[6]。丹參-川芎是臨床常用配伍藥對，已是中醫(yī)臨床活血化瘀類方劑和制劑的核心配伍[7]。二者相輔相成，共奏活血化瘀、通心養(yǎng)脈之功，可以增加心肌供血，輔助心肌梗死治療，改善預后。目前，已開發(fā)多種疏通心脈的中成藥(包含丹參、川芎)，如：腦心通膠囊、血栓心脈寧片，治療冠心病臨床效果顯著[8-9]。網絡藥理學是中藥研究的熱門方法之一，通過多個數據庫的數據整合以及軟件建模，獲得藥物活性成分、靶標、疾病等信息；以構建分子網絡展示藥物與疾病的關系。從整體角度探索藥物與疾病間的關聯(lián)性，強調從“單靶標”向“網絡靶標”研究模式轉變[10]。

關于丹參、川芎單味藥的藥理、藥效研究較多，但關于丹參-川芎作為藥對聯(lián)合網絡藥理學技術探究藥效機制的報道較少。本研究通過網絡藥理學技術，構建“藥物-成分-靶點-疾病”網絡，探索丹參-川芎藥物活性成分、潛在治療靶點和作用機制，闡述丹參-川芎治療心肌梗死的科學內涵，為行氣活血代表藥對丹參-川芎的臨床應用和科研提供參考依據。

1 資料與方法

1.1 丹參-川芎治療心肌梗死的網絡藥理學研究思路(見圖1)

圖1 研究思路示意圖

1.2 中藥活性成分及作用靶點篩選 利用中藥系統(tǒng)藥理學數據庫和分析平臺(TCMSP)，設置口服生物利用度(OB)>30%、類藥性(OL)>0.18作為篩選條件[11]，分別以“丹參”“川芎”為關鍵檢索詞，獲得2味藥物的有效活性成分及對應的靶點信息，并利用UniProt數據庫(http： //www.uniprot.org)中的UniProtKB搜索，對靶點進行標準化處理，設置背景為“Homo sapiens”，得到所有靶點的“official gene symbol”。

1.3 疾病靶點篩選 運用GeneCards數據庫(http：//www.genecards.org/)和OMIM數據庫(http：//www.omim.org/)，以“myocardial infarction”為檢索詞，獲得心肌梗死相關的疾病靶點。

1.4 生成交集靶點 將丹參、川芎的有效化合物對應的靶點與疾病靶點進行交集，并去重處理，生成交集靶點。將交集靶點導入至Venny 2.1.0 (http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/Index.html)，通過在線工具繪制交集靶點的韋恩圖，確定交集靶點的靶向關系。

1.5 交集靶蛋白相互作用(PPI)網絡的構建與拓撲分析 運用STRING數據庫，導入交集靶點蛋白，限定物種為“homo sapiens”，設置最低相互作用閾值為“medium confidence”為0.7，隱藏網絡中未連接的節(jié)點，其余參數保持默認設置，蛋白質交互關系的結果以TSV格式導出。將TSV格式轉化為csv格式，并導入Cytoscape 3.7.2軟件中，進行“network analyzer”拓撲分析，按照“degree”“betweenness centraliy”篩選出20個關鍵靶點信息。網絡圖以PNG格式下載，其中網絡連線的粗細代表相互作用的強弱，靶點的自由度值表示相互作用的靶點個數。

1.6 活性成分與關鍵靶點的網絡構建 將篩選出來的20個關鍵靶點與對應的活性成分導入Cytoscape 3.7.2軟件中，形成可視化的“活性成分-關鍵靶點-疾病”關系網絡圖。網絡中的節(jié)點為藥物的活性成分或關鍵靶點，邊代表二者的相互關系。

1.7 基因本體(GO)生物過程富集分析與京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析 將中藥有效成分的靶點與疾病靶點的交集靶點，導入DAVID6.8數據平臺(http：//david.nciferf.gov/)進行GO分析及KEGG通路分析，富集結果下載并轉化為csv格式。設定P<0.01，KEGG通路分析結果，再參照KEGG數據庫(https：//www.kegg.jp/)進行在線查驗富集通路結果，利用ImageGP在線繪圖平臺(http：//www.ehbio.com/ImageGP/)，繪制KEGG通路氣泡圖，以氣泡圖的形式輸出。

2 結 果

2.1 中藥有效活性成分及對應的靶點篩選 根據TCMSP平臺，以OB和DL的界定值，本研究納入72個活性成分，其中丹參和川芎的活性成分分別為65個、7個；根據OB值列舉前10個(見表1)。對上述化合物進行靶點篩選，并經Uniprot數據庫將預測靶點蛋白轉換為基因名，共有197個。

表1 丹參-川芎藥對中OB值居前10位的化合物基本信息

2.2 疾病靶點及交集靶點篩選 通過GeneCards數據庫、OMIM數據庫，篩選出心肌梗死相關的靶點2 923個。疾病靶點與丹參、川芎活性成分靶點交集后，獲得靶點91個，三者的共同靶點有23個。將疾病靶點與中藥化合物靶點導入至Venny 2.1.0，在線工具繪制交集靶點的韋恩圖(見圖2)。

圖2 丹參、川芎有效成分與心肌梗死的交集靶點

2.3 PPI網絡的構建及關鍵靶點篩選 將丹參-川芎藥對治療心肌梗死的潛在作用靶蛋白導入至STRING數據庫，進行PPI網絡構建(見圖3)。該網絡中有節(jié)點83個、邊420條，其中紫色線代表經過實驗驗證的蛋白間相互作用，淺藍色線代表從數據庫中獲得的蛋白間相互作用。將TSV格式轉化為csv格式，并導入Cytoscape 3.7.2軟件中，進行“network analyzer”拓撲分析，按照“degree”“betweenness centraliy”篩選出20個關鍵靶點信息。分析PPI網絡中拓撲學參數，以自由度按降序排列，篩選出前20位的靶蛋白，自由度越大，說明靶點與更多的靶標存在靶向關系，在網絡中作用越重要；其中自由度最大的靶點為TP53，其自由度值為35(見表2)。

圖3 丹參-川芎藥對治療心肌梗死的靶蛋白相互作用網絡圖

表2 20個關鍵靶點信息

2.4 “藥物-活性成分-關鍵靶點-疾病”的網絡構建 使用Cytoscape 3.7.2軟件，構建活性成分-疾病的關鍵靶點網絡關系(見圖4)，該網絡中節(jié)點數為79個、邊數201條。

2.5 GO生物學過程分析 將91個基因靶點進行GO生物學過程分析，利用DAVID6.8數據庫平臺，設定顯著性程度P<0.01，篩選273個富集結果。按照P值大小升序排列，選取前20位功能信息以部分展示(見表3)。丹參-川芎藥對治療心肌梗死的作用靶點與多個生物學過程相關，基因功能主要富集在藥物反應、調控細胞增殖、調控凋亡過程、調節(jié)一氧化氮生物合成過程、調控RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄和衰老等。

2.6 KEGG通路分析 將91個基因靶點進行KEGG通路分析，利用DAVID6.8數據庫平臺，設定顯著性程度P<0.01，篩選出70條，按照P值大小升序排列，選取前20條通路信息以部分展示(見圖5)，其中主要富集在PI3K-Akt信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、HIF-1信號通路、T細胞受體信號通路等信號通路。說明丹參-川芎藥對可通過多條信號通路，協(xié)同發(fā)揮作用。

(續(xù)表)

圖5 丹參-川芎治療心肌梗死作用靶點參與的信號通路富集信息氣泡圖

3 討 論

心肌梗死歸屬中醫(yī)學“真心痛”“胸痹”范疇。真心痛多由于年老機體漸變，過于勞倦、情志過度、飲食肥甘厚膩等引起，致痰瘀漸生，相互膠結，心脈阻滯，心系受損，不通則通[12-13]；其典型臨床表現(xiàn)為胸骨后或心前區(qū)劇烈疼痛，甚至胸痛徹背、背痛徹心，病死率高[14]，正如《靈樞·厥病》所言：“真心痛，手足青至節(jié)，心痛甚，旦發(fā)夕死，夕發(fā)旦死”。心肌梗死的中醫(yī)學病因病機多歸納為本虛標實，標實以血瘀、痰濁、寒凝、氣滯多見，其中“瘀阻血脈”往往貫穿于冠心病發(fā)病的整個過程，“瘀滯內結之血”表現(xiàn)為血液流變性異常、血栓形成及冠狀動脈管腔狹窄[15]。“氣為血帥”，心肌梗死治以活血祛瘀，行氣以祛血分之滯，臨床中丹參、川芎相伍為常用藥對。

丹參-川芎共同活性成分主要有木犀草素、丹參酮ⅡA、丹參新酮、隱丹參酮等。有研究表明，木犀草素通過絲裂原活化蛋白激酶/NF-κB通路，可減輕缺血誘導的心肌炎性反應[16]。丹參酮ⅡA是丹參重要的脂溶性成分之一，可以調控Notch信號通路，減輕心肌缺血/再灌注損傷，同時參與調節(jié)血脂、增加鈣離子內流、抗血小板聚集、降低血液黏稠度、保護心肌、擴張冠狀動脈、清除氧自由基、抗氧化等多種藥理作用[17-19]。丹參新酮能夠抑制膠原GPVI信號通路的部分關鍵蛋白的磷酸化水平，主要包含PLCγ2/PKC/MAPK和PI3K/Akt/GSK3β信號通路以及αⅡbβ3介導的Src-FAK信號分子，抑制血小板膜表面 p-selectin 表達和ATP釋放，從而抑制血小板的釋放功能，達到抗血栓形成[20]。隱丹參酮可以通過抑制STAT3緩解1型糖尿病大鼠的心肌纖維化[21]，抑制鈣超載、增加內皮型一氧化氮合酶(eNOS)磷酸化，增加一氧化氮(NO)含量，擴張血管，以降低心肌缺血損傷[22-23]。

通過構建交集靶基因PPI網絡，獲得PPI網絡核心靶基因，其中TP53、AKT1、JUN、IL6、CCND1和PTGS2等。GO生物學過程富集分析主要集中在藥物反應、調控細胞增殖、調控凋亡過程、調節(jié)一氧化氮生物合成過程、調控RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄和衰老等。這些基本生物過程及功能體現(xiàn)在丹參-川芎活性成分調節(jié)對應靶基因和具體通路過程上。關于KEGG通路富集，主要包括PI3K-Akt信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、HIF-1信號通路、細胞凋亡等信號通路。PI3K/Akt是調節(jié)心臟功能的一條重要的信號轉導通路，參與心肌細胞凋亡、重構心室，誘導炎癥細胞的聚集促進炎癥反應，加速動脈粥樣硬化的進展[24-26]。HIF-1α是HIF-1信號通路中重要的核轉錄因子，也是PI3K-Akt的下游分子，涉及血管收縮控制、血管新生、紅細胞生成、細胞增殖和存活、能量代謝、細胞凋亡等過程[27-28]。腫瘤壞死因子通路中的TNF-α通過釋放血小板源性生長因子，致使血小板數量增多，促進血栓形成；并且可提高心肌細胞間黏附分子的表達，增加心肌細胞和中性粒細胞的黏附作用，導致心肌細胞死亡和心肌功能障礙，進一步加重炎癥反應[29-30]。丹參、川芎二者合用，符合行氣活血的治則，達到祛心脈瘀滯作用。丹參、川芎可以通過以多成分、多靶點協(xié)同調控，發(fā)揮對心肌梗死的治療作用。

本研究基于分子網絡技術驗證了丹參-川芎治療心肌梗死的理論依據，期待為丹參-川芎作為善行氣活血之常用配伍應用于心肌梗死治療?；诰W絡藥理學分析得到的活性成分與靶基因存在相關性，但不能明確活性成分對靶基因調控關系及藥物、靶標、疾病之間的作用強度差異。中藥的活性成分與靶基因相互作用是通過計算機模擬獲得，仍需要后期進一步實驗驗證。