鄭瑞生，鄒菊琴，金興玨，李 露，，王丹妮，，蘇昆輪，林松丁

（1泉州師范學(xué)院 福建省海洋藻類活性物質(zhì)制備與功能開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 福建泉州 362002 2安記食品股份有限公司 福建泉州 362000 3福建正港食品有限公司 福建泉州 362013）

鮑魚屬單殼軟體動(dòng)物，含有豐富的蛋白質(zhì)，味道鮮美，是中國傳統(tǒng)的名貴食材，位居四大海味之首。即食鮑魚因食用方便，營養(yǎng)美味而深受廣大消費(fèi)者的喜愛。然而，鮑魚易受環(huán)境微生物污染，加工過程殺菌不徹底等因素影響，容易導(dǎo)致即食鮑魚在貯藏過程發(fā)生黑變、惡臭、脹袋、流汁及軟化等腐敗現(xiàn)象，縮短產(chǎn)品的保質(zhì)期[1]。有研究認(rèn)為大多數(shù)情況下食品中只有部分微生物參與腐敗過程[2]。Dalgaard[3]提出特定腐敗菌（Specific spoilage organism，SSO）的概念，在相同地理?xiàng)l件下，同類型水產(chǎn)品中只有一種或幾種微生物以腐敗菌形式出現(xiàn)，甚至特定腐敗菌可能只有1 種[4]，而且隨著棲息水域、種類、捕獲方式、季節(jié)、加工環(huán)境和貯藏條件的不同，其特定腐敗菌也不同[5]。

即食鮑魚在貯藏過程中，優(yōu)勢腐敗菌降解鮑魚蛋白質(zhì)和脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)，產(chǎn)生一些腐敗物質(zhì)，如胺、吲哚、硫醇、有機(jī)酸等，導(dǎo)致鮑魚在感官上發(fā)生明顯的變化[6]。通過某些生化指標(biāo)可以有效判斷鮑魚產(chǎn)品的特性。如：揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）是判斷水產(chǎn)品鮮度的重要指標(biāo)，在酶和細(xì)菌的作用下，使蛋白質(zhì)分解而產(chǎn)生具有揮發(fā)性的氨氮等堿性化合物；pH 值的高、低也是評(píng)判水產(chǎn)品酸敗程度的指標(biāo)，腐敗酸敗的水產(chǎn)品pH 值偏低，味道刺鼻；酚類化合物會(huì)在多酚氧化酶（PPO）的作用下氧化成醌類化合物，發(fā)生黑變現(xiàn)象等[7]。

據(jù)本課題組前期研究即食鮑魚加工過程殘留菌的變化結(jié)果[8]，篩選合適的培養(yǎng)基、分離出即食鮑魚特定腐敗菌，采用16S rDNA 和細(xì)菌生化鑒定試劑盒進(jìn)行鑒定。然后，將SSO 接種于即食鮑魚中，研究即食鮑魚黑變、流汁、軟化、酸敗、脹袋等腐敗成因。進(jìn)一步驗(yàn)證導(dǎo)致即食鮑魚腐敗的SSO，有針對性地采取控制措施，減緩即食鮑魚腐敗變質(zhì)，確保食品質(zhì)量安全。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

皺紋盤鮑（Haliotis discus hannai），泉州市某水產(chǎn)批發(fā)市場。

甘露醇卵黃多黏菌素瓊脂基礎(chǔ)（MYP）、多黏菌素B、胰酪胨大豆羊血瓊脂基礎(chǔ)（TSSB）、脫纖維羊血、酪蛋白瓊脂、3%H2O2、硫酸錳營養(yǎng)瓊脂、0.5%堿性復(fù)紅、革蘭氏染色液試劑盒、蠟樣芽孢桿菌生化鑒定試劑盒，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒，生工生物工程（上海）股份有限公司。

營養(yǎng)瓊脂（NA）、營養(yǎng)肉湯（NB）培養(yǎng)基，杭州微生物有限公司；鹽酸、氯化鈉，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；高氯酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉，上海金鹿化工有限公司；領(lǐng)苯二酚，阿拉??；L-脯氨酸，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。以上化學(xué)試劑均為分析純級(jí)。

1.2 設(shè)備與儀器

XHF-D 型高速分散器（內(nèi)切式勻漿機(jī)）、15-07 型勻質(zhì)器，寧波新芝生物科技股份有限公司；SHP-150 型生化培養(yǎng)箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；GHP-9080 型隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；BXM-30R 型立式蒸汽滅菌器、BSD-YX2200 型搖床，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；Sup G6R 型Supcre 系列菌落計(jì)數(shù)/篩選/抑菌圈測量聯(lián)用儀，杭州迅數(shù)科技有限公司；GL-20G-H 型高速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；UV-120 型紫外-可見分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；STARTER3100 型實(shí)驗(yàn)室pH 計(jì)，上海奧豪斯儀器有限公司；K9840 型自動(dòng)凱氏定氮儀，濟(jì)南海能儀器有限公司；ADCI 系列全自動(dòng)色差計(jì)，北京辰泰克儀器技術(shù)有限公司。

1.3 即食鮑魚加工工藝流程

鮮活鮑魚→開殼、取肉→清洗、瀝干→調(diào)味→腌制→高溫烘烤→低溫冷卻→真空包裝→成品冷藏。

1.4 特定腐敗菌的分離、純化、鑒定

根據(jù)本課題前期DGGE 研究結(jié)果，參照GB 4789.14-2014[9]方法，利用MYP 選擇性培養(yǎng)基【甘露醇卵黃多黏菌素瓊脂基礎(chǔ)（MYP）+多黏菌素B+卵黃】對即食鮑魚特定腐敗菌進(jìn)行分離、純化，最終形成單一菌落，利用16S rDNA 進(jìn)行鑒定。

1.4.1 特定腐敗菌16S rDNA 鑒定 按“Ezup 柱式細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒”操作步驟提取鮑魚細(xì)菌總DNA。通用引物：27F-AGTTTGATCMTG GCTCAG；1492R-GGTTACCTTGTTACGACTT，長度1 500 bp 左右。PCR 反應(yīng)體系：0.5 μL Template（基因組DNA 20～50 ng/μL），2.5 μL 10×Buffer（含Mg2+），1 μL dNTP（各2.5 mmol/L），0.2 μL Taq 酶，0.5 μL 27F，0.5 μL 1492R，加 雙 蒸H2O 至25 μL，PCR 反應(yīng)條件：在94 ℃下進(jìn)行5 min 預(yù)變性，隨后循環(huán)擴(kuò)增30 個(gè)循環(huán)（包括94 ℃變性45 s，55℃退火45 s，72 ℃延伸60s），最后在72 ℃下延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定后回收純化，由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序，將拼接后的測序結(jié)果輸入https：//www.ncbi.nlm.nih.gov，利用BLAST 軟件，將測定得到的基因序列與Genbank 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對分析，并進(jìn)行同源相似性比較。

1.4.2 特定腐敗菌的生化鑒定

1）生化鑒定 參照“DBI-07 蠟樣芽孢桿菌干制生化鑒定試劑盒”進(jìn)行操作。

2）溶血試驗(yàn) 挑取純培養(yǎng)的單個(gè)可疑菌落接種于TSSB 瓊脂平板上，35 ℃培養(yǎng)24 h。

3）蛋白質(zhì)毒素晶體檢測試驗(yàn) 挑取單個(gè)可疑菌落接種于硫酸錳營養(yǎng)瓊脂平板上，30 ℃培養(yǎng)3 d，挑取單菌落于載玻片上，干燥，固定。加甲醇作用30 s 后傾去，再通過火焰干燥，滴0.5%堿性復(fù)紅，放火焰上加熱1～2 min，移去火焰。更換染色液，再次加溫染色30 s，傾去染液用無菌水沖洗、晾干后鏡檢。

1.5 特定腐敗菌接種于即食鮑魚的研究

1.5.1 特定腐敗菌的接種試驗(yàn) 取即食鮑魚置于超凈臺(tái)，用紫外殺菌1 h，期間用無菌鑷子翻面1次，即為無菌即食鮑魚。取35 ℃培養(yǎng)18～20 h 的特定腐敗菌用NB 稀釋至105～106CFU/mL，取1 μL該菌懸液，用無菌注射器注射到（30±5）g 的即食鮑魚表面，用無菌包裝袋包裝，放置于35 ℃培養(yǎng)箱中貯藏18 d。每隔3 d 取樣進(jìn)行各項(xiàng)理化指標(biāo)檢測。

1.5.2 pH 值的測定 稱取5 g 鮑肉試樣（精確至0.01 g），加蒸餾水45 mL，絞碎，搖勻，取懸浮液于50 mL 燒杯中（分置2 杯），用酸度計(jì)測定pH 值。1.5.3 TVB-N 的測定 參照《食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》（GB 5009.228-2016）[10]方法測定。

1.5.4 汁液流失率的測定

汁液流失率（%）=（貯藏前鮑魚質(zhì)量－貯藏后鮑魚質(zhì)量）/貯藏前鮑魚質(zhì)量×100

1.5.5 菌落總數(shù)的測定 菌落總數(shù)的測定參照GB 4789.2-2016[11]規(guī)定的方法進(jìn)行測定。

1.5.6 PPO 的測定 參考林婷[12]的方法并稍作修改，10 g 鮑魚加入0.067 mol/L 磷酸鈉緩沖液（pH 7.2 左右）25 mL 進(jìn)行均質(zhì)。將濾液8 000 r/min 離心30～40 min。取0.8 mL 的上清液，加入0.5 mol/L 鄰苯二酚和L-脯氨酸各0.4 mL，再加入0.067 mol/L 磷酸鈉緩沖（pH 7.2）4.4 mL，混勻，于37 ℃水浴10 min，測定530 nm 波長處的OD 值。

1.5.7 亨特白度值的測定 取鮑魚腹足部位，運(yùn)用ADCI 系列全自動(dòng)測色色差計(jì)進(jìn)行白度測定，測9 次取平均值。

1.5.8 感官指標(biāo)的判斷 采用描述性評(píng)價(jià)法[13]分析即食鮑魚感官變化，主要判斷指標(biāo)有：組織形態(tài)是否富有彈性，有無流汁；色澤富有光澤，是否出現(xiàn)黑變；是否存在固有的烘烤香味，有無酸敗或其它異味產(chǎn)生；有無脹袋；汁液流失現(xiàn)象是否嚴(yán)重等。

1.6 數(shù)據(jù)分析

用Excel 軟件繪圖和數(shù)據(jù)處理，用SPSS 評(píng)判

顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 即食鮑魚特定腐敗菌的分離、純化、鑒定結(jié)果

2.1.1 16 S rDNA 鑒定即食鮑魚特定腐敗菌 本課題組前期研究即食鮑魚加工過程菌群的變化，分析出腐敗即食鮑魚的優(yōu)勢腐敗菌。選取最亮的條帶，比對出相應(yīng)的疑似菌株，利用MYP 培養(yǎng)基對即食鮑魚殘留腐敗菌進(jìn)行分離、純化，提取該腐敗菌的DNA，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，得到重復(fù)性好且穩(wěn)定、清晰的特異性條帶，片段長度在1 500 bp 左右，見圖1。

圖1 特定腐敗菌16S rDNA 的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoresis of 16S rDNA amplified products of SSO PCR

PCR 產(chǎn)物經(jīng)純化后進(jìn)行核苷酸序列分析，將獲得的有效序列提交到NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/），通過Blast 程序與GenBank 數(shù)據(jù)庫中已知序列進(jìn)行相似性比對。分離到的菌株序列與GenBank 中最接近細(xì)菌的同源性達(dá)到100%，初步確定該細(xì)菌為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus），見表1。

表1 特定腐敗菌的鑒定結(jié)果Table 1 Identification results of SSO

2.1.2 生化鑒定特定腐敗菌 利用DBI-07 生化鑒定試劑盒對SSO 進(jìn)行生化鑒定，鑒定結(jié)果如表2所示。

根據(jù)分離純化出的SSO 進(jìn)行生化鑒定，由表2可知，動(dòng)力性、溶菌酶耐性、葡萄糖利用、V-P、硝酸鹽還原、明膠液化、檸檬酸鹽利用、過氧化氫酶和溶血試驗(yàn)均呈陽性；甘露醇產(chǎn)酸和蛋白質(zhì)毒素晶體反應(yīng)均呈陰性；符合GB 4789.14-2014[9]中蠟樣芽孢桿菌的生化特征，確定分離出的腐敗菌為蠟樣芽孢桿菌。

表2 特定腐敗菌各項(xiàng)生化鑒定結(jié)果判斷Table 2 Results of biochemical identification of SSO

2.2 SSO 接種于即食鮑魚后的理化指標(biāo)變化

用蠟樣芽孢桿菌接種于經(jīng)滅菌的即食鮑魚，將接種與未接種的即食鮑魚放置在37 ℃培養(yǎng)，每隔3 d 檢測染菌鮑魚（接種）及自然腐敗鮑魚（未接種）的各項(xiàng)理化指標(biāo)，詳見表3。

表3 鮑魚的各項(xiàng)指標(biāo)比較Table 3 Comparison of various indexes of abalone

2.2.1 pH 值的變化 如表3所示，貯藏期間染菌鮑魚的pH 值低于自然腐敗鮑魚，差異達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。即食鮑魚初始pH 值為6.62，貯藏前9 d，染菌和自然腐敗鮑魚的pH 值均呈先下降后上升的趨勢，第9 天達(dá)到最大值6.27 和6.52。這是由于在蠟樣芽孢桿菌的作用下，鮑魚蛋白分解成含氮化合物，有氨態(tài)氮及甲胺、尸胺等，導(dǎo)致pH值上升。隨后腐敗菌降解糖類化合物、脂肪等進(jìn)一步分解產(chǎn)生有機(jī)酸，如甲酸、乙酸、丙酮酸等，形成酸敗氣味，導(dǎo)致pH 值下降[14]。

2.2.2 TVB-N 的變化 如表3所示，貯藏期間TVB-N 值基本呈上升趨勢，且染菌鮑魚的TVB-N高于自然腐敗鮑魚，差異達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）。即食鮑魚初始TVB-N 為9.04 mg/100 g，貯藏第18 天時(shí)，自然腐敗鮑魚與染菌鮑魚分別達(dá)到最大值91.84，362.32 mg/100 g，嚴(yán)重超過國家標(biāo)準(zhǔn)值[15]，可見，蠟樣芽孢桿菌能分解鮑魚蛋白產(chǎn)生胺類化合物，甚至是吲哚及硫醇等含氮含硫物質(zhì)；同時(shí)蠟樣芽孢桿菌能利用鮑魚中的糖類物質(zhì)發(fā)生降解，產(chǎn)生有機(jī)酸、丙酮酸等化合物，同時(shí)產(chǎn)生H2S、CO2等惡臭氣味，形成脹袋現(xiàn)象[16]。

2.2.3 汁液流失率的變化 如表3所示，鮑魚汁液流失率的變化均呈升高趨勢，且染菌鮑魚的汁液流失率高于自然腐敗鮑魚（P＜0.01），主要由于蠟樣芽孢桿菌能分泌蛋白酶（胞外酶），分解動(dòng)物蛋白（明膠）生成小分子物質(zhì)，出現(xiàn)液化現(xiàn)象，加劇即食鮑魚汁液流失。

2.2.4 菌落總數(shù)的變化 如表3所示，菌落總數(shù)呈先上升后下降的趨勢。即食鮑魚的初始菌落為2.04 lg（CFU/g），染菌鮑魚在第3 天達(dá)到最大值6.63 lg（CFU/g）；自然腐敗鮑魚在第6 天達(dá)到最大值5.64 lg（CFU/g）。隨后逐漸降低，自然腐敗鮑魚下降更為明顯，染菌鮑魚的菌落總數(shù)顯著高于自然腐敗鮑魚（P＜0.01）。主要由于受密閉包裝環(huán)境影響，好氧微生物生產(chǎn)被抑制，雖出現(xiàn)下降趨勢，但兩者均超過國家標(biāo)準(zhǔn)[17]?？梢娤灅友挎邨U菌加快了即食鮑魚的腐敗菌的滋生。

2.2.5 PPO 變化情況 如表3所示，貯藏期間PPO 吸光度變化趨勢基本一致，呈上升趨勢。即食鮑魚初始PPO 的OD530nm為0.270，貯藏第18 天，染菌鮑魚達(dá)0.732，自然腐敗鮑魚為0.611。且染菌鮑魚的PPO 活性高于自然腐敗鮑魚（P＜0.01）。由于即食鮑魚中的酚類化合物會(huì)在多酚氧化酶（PPO）的作用下氧化成醌類，形成黑變現(xiàn)象[18-19]，導(dǎo)致PPO 吸光度值一直呈上升趨勢?？梢?，蠟樣芽孢桿菌促進(jìn)即食鮑魚發(fā)生黑變現(xiàn)象。

2.2.6 亨特白度變化情況 貯藏期間，鮑魚的亨特白度值基本呈上升趨勢。自然腐敗鮑魚的亨特白度一直高于染菌鮑魚，這是由于染菌鮑魚的PPO 含量較高，促使鮑魚發(fā)生黑變。貯藏時(shí)間越長，染菌鮑魚黑變越顯著。

2.2.7 感官指標(biāo)變化情況 貯藏期間2 種鮑魚的感官評(píng)價(jià)均呈下降趨勢，染菌鮑魚的感官指標(biāo)明顯低于自然腐敗鮑魚。染菌鮑魚在第3 天時(shí)就出現(xiàn)明顯軟化、漲袋、汁液流失現(xiàn)象：貯藏第9 天，染菌鮑魚出現(xiàn)極其刺鼻的味道，組織軟化嚴(yán)重，鮑肉黑變明顯。而自然腐敗鮑魚感官變化相對緩慢。由此可見，蠟樣芽孢桿菌加劇鮑魚的腐敗變質(zhì)，尤其是組織形態(tài)軟化、黑變、流汁現(xiàn)象更為嚴(yán)重。

3 結(jié)論

根據(jù)DGGE 技術(shù)分析結(jié)果，利用16S rDNA技術(shù)和細(xì)菌生化鑒定試劑盒對即食鮑魚分離出的優(yōu)勢腐敗菌進(jìn)行鑒定，確定即食鮑魚的SSO 為蠟樣芽孢桿菌。通過接種蠟樣芽孢桿菌試驗(yàn)，對比天然腐敗鮑魚與染菌鮑魚的理化指標(biāo)，結(jié)果表明：在貯藏過程中，染菌鮑魚的pH 值、TVB-N、汁液流失率、菌落總數(shù)、亨特白度、PPO 活性等指標(biāo)均比自然腐敗鮑魚劣化更為嚴(yán)重。結(jié)合感官評(píng)價(jià)，染菌鮑魚出現(xiàn)明顯漲袋、汁液流失及黑變現(xiàn)象，甚至出現(xiàn)極其刺鼻的氣味，組織軟化嚴(yán)重。而自然腐敗鮑魚感官變化相對緩慢。由此可見，蠟樣芽孢桿菌加快即食鮑魚中蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪和酚類化合物等營養(yǎng)物質(zhì)的分解，產(chǎn)生腐敗性物質(zhì)，縮短了即食鮑魚的貯藏時(shí)間，促使即食鮑魚產(chǎn)生黑變、惡臭、脹袋、流汁及軟化等腐敗變質(zhì)現(xiàn)象。

本研究利用蠟樣芽孢桿菌接種于即食鮑魚，對其致腐能力進(jìn)行綜合分析，進(jìn)一步驗(yàn)證了蠟樣芽孢桿菌作為真空包裝即食鮑魚特定腐敗菌的可能性。因此，有必要針對蠟樣芽孢桿菌采取有效的控制措施防止其滋生，延長即食鮑魚的貨架期。