沈聰 劉爽 王春霞 嚴(yán)雪梅 代金霞

（1. 寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，銀川 750021；2. 寧夏環(huán)境科學(xué)研究院，銀川 750004）

近幾十年來(lái)，隨著原油工業(yè)的迅速擴(kuò)張，大量原油在開采、煉制和運(yùn)輸過(guò)程中的泄漏風(fēng)險(xiǎn)也成比例增加，對(duì)土壤和海洋環(huán)境構(gòu)成了嚴(yán)重威脅［1］。僅陸地運(yùn)輸產(chǎn)生的原油泄漏就造成了約10%的土壤污染［2］。石油的主要成分具有較大毒性，污染物進(jìn)入土壤后難以去除，長(zhǎng)期污染會(huì)引起土壤生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而損害作物生長(zhǎng)并導(dǎo)致土地生產(chǎn)力急劇下降［3］。污染物還會(huì)隨著徑流進(jìn)入周圍的流域和地下水，對(duì)人類健康和生態(tài)系統(tǒng)功能具有廣泛的負(fù)面影響。切實(shí)有效地解決石油污染土壤的修復(fù)問(wèn)題，己成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)［4］。

目前，微生物修復(fù)作為一種環(huán)境友好、經(jīng)濟(jì)有效的技術(shù)，成為了有較大發(fā)展?jié)摿蛻?yīng)用前景的修復(fù)技術(shù)，是當(dāng)前治理石油污染土壤最為有效的途徑之一［5］。向石油污染土壤中投加環(huán)境適應(yīng)強(qiáng)、降解效能高的菌種或菌群是提高生物修復(fù)效率的主要手段［6］。因此，篩選高效石油降解菌株以研制新型土壤修復(fù)劑是微生物修復(fù)的關(guān)鍵。作為最大的微生物資源庫(kù)，土壤也是石油降解菌的重要來(lái)源之一。迄今為止，已報(bào)道的能夠降解石油的土壤微生物已有200多種，其中假單胞菌屬（Pseudomonas）［7］、紅球菌屬（Rhodococcus）［8］、微桿菌屬（Microbacte- rium）［9］、芽孢桿菌屬（Bacillus）［10］、產(chǎn)堿桿菌屬（Alcaligenes）［11］等都是常被分離篩選出的石油降解菌群。但細(xì)菌的降解能力會(huì)受到石油烴性質(zhì)、菌體自身特性及降解環(huán)境的影響，由于異源細(xì)菌缺乏適應(yīng)性，在新環(huán)境中添加異源細(xì)菌作為生物強(qiáng)化劑的修復(fù)效果并不顯著［12］。因此，廣泛開展從原油污染土壤的土著微生物中篩選環(huán)境適應(yīng)強(qiáng)、降解效能高的菌種并優(yōu)選其作為生物強(qiáng)化劑的應(yīng)用，可有效地促進(jìn)石油污染土壤的生物修復(fù)效率。本研究從寧夏鹽池縣油田開發(fā)區(qū)原油污染土壤中分離篩選石油降解菌株，結(jié)合菌株的形態(tài)、生理特征及16S rRNA序列分析對(duì)其進(jìn)行初步鑒定，通過(guò)菌株的交互作用和降解特性分析，構(gòu)建高效的石油降解菌群，研究其對(duì)原油污染土壤的修復(fù)效果，以期為鹽池地區(qū)石油污染土壤的微生物修復(fù)提供高效菌源和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤來(lái)源 供試土壤：土壤樣品采集于寧夏鹽池縣大水坑牛毛井村采油三廠附近。共設(shè)置4個(gè)樣地，每個(gè)樣地按照五點(diǎn)取樣法，去除表層土后取2 cm-10 cm處污染土壤0.5 kg左右，將每個(gè)樣地的5份土樣混勻裝入無(wú)菌袋中帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

1.1.2 主要培養(yǎng)基 富集培養(yǎng)基：K2HPO40.8 g；NaH2PO40.4 g；NaCl 0.2 g；CaCl20.1 g；MgSO4·7H2O 0.2 g；NH4Cl 2.0 g；適量原油；蒸餾水1 000 mL；pH 7.0-7.2；121℃滅菌20 min。

無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基：NaCl 10.0 g；NH4Cl 0.5 g；KH2PO40.5 g；K2HPO41.0 g；MgSO4·7H2O 0.5 g；CaCl20.02 g；KCl 0.1 g；FeCl2·4H2O 0.02 g；蒸餾水1 000 mL，微量元素1 mL，pH 7.5。

分離培養(yǎng)基：無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基1 000 mL，原油3.0 g，瓊脂18.0 g-20.0 g，121℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 石油降解菌的分離純化和富集篩選 分離培養(yǎng)基篩選石油降解菌：稱取10.0 g油污土壤加入到已滅菌的90 mL蒸餾水中，在28℃、150 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)1 h，靜置30 min，將上清液梯度稀釋至10-2-10-4后，各取0.1 mL涂布于分離平板上，每個(gè)梯度設(shè)置3個(gè)重復(fù)，在28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d-7 d，挑取單菌落在分離平板上劃線純化3-4次，直至獲得單一菌落。

石油降解菌的富集篩選：稱取5.0 g油污土壤加入到100 mL含1%石油的富集培養(yǎng)基中，28℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)7 d，按5%的接種量將富集液轉(zhuǎn)接在含有3%石油的富集培養(yǎng)基中，在相同條件下培養(yǎng)7 d，再次按5%的接種量轉(zhuǎn)接于含有5%石油的富集培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)7 d，進(jìn)行富集馴化。將以上富集液吸取梯度稀釋后涂于LB平板上，28℃培養(yǎng)2 d-3 d，根據(jù)菌落形態(tài)進(jìn)行劃線純化，直至得到單一菌株。

1.2.2 石油降解菌的鑒定 菌株的生理生化特征測(cè)定：對(duì)純化的菌株進(jìn)行革蘭氏染色、硝酸鹽還原、淀粉水解、明膠實(shí)驗(yàn)、VP實(shí)驗(yàn)、甲基紅實(shí)驗(yàn)和過(guò)氧化氫酶等生理生化特征進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［13］，結(jié)合菌體和菌落形態(tài)對(duì)菌株進(jìn)行初步鑒定。

菌株的分子鑒定：將純化后的菌株接種于LB培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，取1 mL菌懸液，采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（DP302，北京天根）提取菌株的總DNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后，用細(xì)菌16S rRNA基因通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′） 和1492R（5′-CGGTTACCTTGTTACGACTTC-3′）對(duì)菌株的16S rRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)束后 PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后，委托上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果利用eZtaxon網(wǎng)站（https：//www.ezbiocloud.net/）進(jìn)行同源性搜索，獲得相近的相關(guān)菌株的16S rRNA序列，對(duì)各菌株的分類地位進(jìn)行分析，并將篩選獲得的16S rRNA基因序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得序列登錄號(hào)。

1.2.3 菌株產(chǎn)表面活性劑能力測(cè)定 將活化后的菌株接種到含有1%石油的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，28℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)48 h后，將培養(yǎng)液于4℃，10 000 r/min離心15 min，取上清。同時(shí)，在干凈的培養(yǎng)皿中加入20 mL蒸餾水，滴加100 μL預(yù)熱至50℃的石油，靜置，待水面形成均勻油膜后，取100 μL發(fā)酵上清液加于油膜中心，中心油膜被擠向四周形成排油圈，形成穩(wěn)定的排油圈后測(cè)定其直徑，每處理3次重復(fù)［14］。

1.2.4 菌株對(duì)原油降解率的測(cè)定 根據(jù)菌株形成排油圈的大小，挑選具備較強(qiáng)的產(chǎn)表面活性劑能力的菌株，制成OD600為1.20±0.05的菌懸液，取500 μL接種至含3%原油的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)14 d后采用重量法分別測(cè)定原油殘余含量并計(jì)算降解率。以不接菌的含原油無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液為對(duì)照，每個(gè)菌株做3次重復(fù)。

降解率/%=（對(duì)照原油質(zhì)量-處理原油質(zhì)量）/對(duì)照原油質(zhì)量×100%

1.2.5 高效石油降解菌對(duì)污染土壤的修復(fù)作用 采用濾紙片法檢測(cè)菌株之間的拮抗性。選取互不拮抗且降解能力最強(qiáng)的2株菌，調(diào)整菌株OD600=1.00±0.05，將兩個(gè)菌株按照體積比1∶1混合形成復(fù)合菌群。分別將兩個(gè)單一菌及復(fù)合菌按照2%的總接菌量接種于LB培養(yǎng)液中，28℃，150 r/min，恒溫培養(yǎng)一定時(shí)間后棄去上清液，菌體洗滌2次后加無(wú)菌水制成OD600為1.40±0.05的液體菌劑。將原油污染土壤自然風(fēng)干后，碾碎混勻過(guò)2 mm篩，分裝于規(guī)格為40 cm×27 cm×15 cm的塑料花盆中，每盆加4.0 kg。在第0天和第30天在將制好的單一菌劑和復(fù)合菌劑分別按10%的接種量接種于裝有石油污染土壤的塑料盆中，攪拌均勻，以不加菌劑的土壤為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)期間，各組樣品土壤含水率維持在15%-20%，每3 d翻耕一次，增加土壤透氣性。覆土90 d后測(cè)定污染土壤中總石油含量。

2 結(jié)果

2.1 石油降解菌的分離及其多樣性

2.1.1 菌株的生理生化特征 通過(guò)對(duì)菌株進(jìn)行分離和富集培養(yǎng)，共分離出石油降解菌25株，其中5株菌分離自含5%石油的富集培養(yǎng)基。在富集培養(yǎng)過(guò)程中，上層的原油被降解為大小不一的乳化顆粒，表明土壤中的石油降解菌能夠利用高濃度的石油為碳源和能源進(jìn)行生長(zhǎng)和繁殖，產(chǎn)生的代謝物導(dǎo)致原油成分被破壞，疏水性降低，從而形成乳化顆粒。分離的菌株在LB平板上大多形成乳白色或淺黃色、濕潤(rùn)或干燥的菌落。生理生化特征測(cè)定結(jié)果表明，18個(gè)菌株為革蘭氏陽(yáng)性菌，革蘭氏陰性菌有7株，多數(shù)菌株硝酸鹽還原和H2O2酶反應(yīng)陽(yáng)性，V.P反應(yīng)陰性，各菌株的特征，如表1所示。

表1 菌落形態(tài)和菌株的生理生化特征Table 1 Colony morphology and physiological and biochemical characteristics of strains

2.1.2 菌株的16S rRNA基因序列分析 通過(guò)對(duì)獲得的石油降解菌的16S rRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增，獲得大小約為1 500 bp左右的目的片段，部分菌株的PCR電泳圖，如圖1所示。

圖1 部分菌株16S rRNA基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig. 1 16S rRNA gene electrophoresis diagram of partial strains

將所測(cè)序列與eZtaxon網(wǎng)站已有的模式菌株進(jìn)行同源分析，結(jié)果表明分離的菌株分別隸屬于12個(gè)屬，多樣性非常豐富。結(jié)合菌株生理生化特征進(jìn)行鑒定，其中隸屬于鏈霉菌屬（Streptomyces）和假單胞菌屬（Pseudomonas）的菌株分別有6株，為優(yōu)勢(shì)菌屬；3株為紅球菌屬（Rhodococcus）；2株為芽孢桿菌屬（Bacillus）；其余8個(gè)屬各有1株，包括微桿菌屬（Microbacterium）和類諾卡氏菌屬（Nocardioides）等常見的石油降解菌。將菌株的16S rRNA基因序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得序列登錄號(hào)（表2）。

表2 菌株16S rDNA序列比對(duì)結(jié)果及登錄號(hào)Table 2 Strain 16S rDNA sequence comparison results and registration numbers

2.2 高效石油降解菌的篩選

表面活性劑有降低表面張力的作用，可使均勻鋪展的石油膜發(fā)生外排作用。通過(guò)對(duì)污染土壤中的石油降解菌進(jìn)行富集培養(yǎng)，有降解作用的菌株可以利用石油作為唯一碳源和能源進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物導(dǎo)致原油成分被破壞，疏水性降低，使得培養(yǎng)液上層油膜分散，在液面聚集成小油粒。通過(guò)對(duì)25株菌進(jìn)行排油圈的測(cè)定發(fā)現(xiàn)，各菌株產(chǎn)表面活性劑能力差別較大，其中紅球菌屬3株菌S16、S18 和S25產(chǎn)生的排油圈顯著大于其他菌株（圖2），說(shuō)明這些菌株具有較高的產(chǎn)表面活性劑能力。

圖2 石油降解菌產(chǎn)生物表面活性劑能力Fig. 2 Ability of petroleum degrading bacteria to produce surfactant

根據(jù)排油圈大小，選擇8株具備較強(qiáng)的產(chǎn)表面活性劑能力的菌株，以不加菌劑為對(duì)照，通過(guò)重量法測(cè)定菌株對(duì)原油的降解能力。結(jié)果表明，菌株對(duì)原油的降解能力各不相同，降解率在25.0%-50.0%之間，隸屬于紅球菌屬的菌株S25和S18降解能力最強(qiáng)，降解率分別為50%和47.2%；Cytobacillus屬菌株S19和鏈霉菌屬菌株S10次之，降解率均為44.4%；假單胞屬菌株S23降解率僅為S25菌株的一半，降解能力最?。▓D3）。

圖3 石油降解菌對(duì)石油的降解率Fig. 3 Degradation rate of petroleumby degrading bacteria isolates

2.3 單一和復(fù)合菌劑對(duì)石油污染土壤的修復(fù)效果

通過(guò)菌株的拮抗性檢測(cè)，篩選菌株S25和S18用于復(fù)合菌群構(gòu)建并進(jìn)行土壤修復(fù)實(shí)驗(yàn)。分別將兩個(gè)菌株制備成單一菌劑和復(fù)合菌劑施入石油污染土壤中，覆土90 d后通過(guò)重量法測(cè)定污染土壤中總石油含量。結(jié)果表明，分離出的菌株對(duì)石油污染土壤有較強(qiáng)的的修復(fù)能力，其中，單一菌劑S18對(duì)油污土壤中石油的降解率為62.7%，菌株S25的降解率為75.4%，而二者制備的復(fù)合菌劑的降解效果要顯著強(qiáng)于單一菌劑，降解率達(dá)到84.7%（圖4）。

圖4 高效石油降解菌對(duì)污染土壤石油的降解率Fig. 4 Degradation rate of petroleum in polluted soil by high efficiency petroleum degrading bacteria

3 討論

石油降解菌廣泛存在于在石油污染土壤中。目前已報(bào)道的能夠降解石油的微生物分布于100 多個(gè)屬200 多種。常見的有假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、紅球菌屬、不動(dòng)桿菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬和節(jié)桿菌屬等。楊智等［8］對(duì)玉門油田污染土壤石油降解菌多樣性的研究表明，分離的石油降解菌分屬于21屬，假單胞菌屬、紅球菌屬、微球菌屬（Micrococcus）、寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）、無(wú)色桿菌屬（Achromobacter）和葡萄球菌屬（Staphylococcus）為優(yōu)勢(shì)菌屬；趙碩偉等［15］從勝利油田污染土壤中分離篩選出的3 株高效石油降解菌株均屬于紅球菌屬；吳濤等［16］從黃河三角洲石油污染土壤中分離得到 1 株高效耐鹽石油烴降解菌 BM38，確定為惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）。本研究從寧夏鹽池縣油田開發(fā)區(qū)原油污染土壤中篩選出25株石油降解菌，通過(guò)形態(tài)特征、生理生化特征和 16S rRNA基因序列分析，表明這些石油降解菌隸屬于12屬，常見的有鏈霉菌屬、假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、紅球菌屬和類諾卡氏菌屬等。此外，還包括微桿菌屬、類芽孢桿菌屬Paenibacillus、短芽孢桿菌屬Brevibacillus等石油降解菌，這與眾多研究中報(bào)道石油降解菌較一致［17-18］。而白蟻菌屬Isoptericola、博德特氏菌屬Bordetella和纖維菌屬Cellulosimicrobium等作為石油降解菌的研究目前鮮有報(bào)道。白蟻菌屬目前已知有4種，部分菌株有嗜熱嗜鹽特性，能降解甲殼素、產(chǎn)生水解酶促進(jìn)紙漿漂白，或具備解磷、分泌吲哚乙酸、產(chǎn)ACC脫氨酶等促生能力；博德特氏菌屬菌株多為人類病原菌，目前也有報(bào)道從石油污染土壤中分離出博德特氏菌，對(duì)汽油或潤(rùn)滑油具有優(yōu)良的降解性能［7，19］；纖維菌屬主要局限于土壤、海洋等中溫環(huán)境，目前主要從熱泉、南極積雪和海洋沉積物中分離出，其降解石油的作用還有待于進(jìn)一步研究。

生物表面活性劑是由微生物產(chǎn)生的一類集親水基和疏水基于一體的兩親化合物，由于微生物主要在油-水界面進(jìn)行石油的降解活動(dòng)，生物表面活性劑能夠降低石油表面張力，增加石油在水相中的分散程度，以此增大石油降解菌和石油的接觸面積，極大的促進(jìn)了微生物對(duì)石油的吸收降解［20-21］。因此根據(jù)產(chǎn)表面活性劑能力強(qiáng)弱篩選石油降解菌是一重要的指標(biāo)。目前多用降解菌的排油圈直徑來(lái)表征微生物產(chǎn)生物表面活性劑能力。排油圈直徑越大，菌株產(chǎn)生表面活性劑的量越多，對(duì)石油的降解作用越強(qiáng)。本研究分離出的25株菌產(chǎn)生了不同大小的排油圈，表明這些菌株都具有產(chǎn)表面活性劑的能力，其中3株紅球菌的排油圈直徑最大，石油降解率也高于假單胞菌屬和芽孢桿菌屬等菌株。這與已報(bào)道的假單胞菌屬和芽孢桿菌具有較強(qiáng)的產(chǎn)表面活性劑和乳化原油的能力并不一致［20］。此外，對(duì)石油降解能力的差異不僅體現(xiàn)在不同屬細(xì)菌之間，即使是同屬的菌株，降解能力也有很大差別，如紅球菌屬的S25和鏈霉菌屬的S10降解率顯著高于同屬其他菌株。這主要是由于環(huán)境因素、微生物活性和代謝途徑的差異等，使得大多數(shù)菌株只能選擇性地降解石油中的某一種或幾種組分。為了提高石油污染土壤的修復(fù)效果，我們結(jié)合菌株的排油圈、降解率和菌株間的交互作用等，篩選出2株紅球菌構(gòu)建了復(fù)合菌群并進(jìn)行土壤修復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示復(fù)合菌劑的石油降解率達(dá)到了84.7%，顯著高于兩個(gè)單一菌劑。復(fù)合菌劑的不同菌株對(duì)于石油中不同的烴類物質(zhì)具有不同的降解能力，能夠極大地促進(jìn)石油的降解。曹文娟等［22］向油污土壤中投加復(fù)合菌劑和單一菌劑進(jìn)行土壤修復(fù)70 d，結(jié)果表明復(fù)合菌劑的降解效率達(dá)到75.0%，兩個(gè)單一菌劑的降解率分別為53.0%和52.0%。孔令姣等［23］利用兩個(gè)單一菌劑和復(fù)合菌劑修復(fù)石油污染土壤70 d 后，單菌的石油降解率分別為53.8%和62.8%，而復(fù)合菌劑則高達(dá)72.8%。由于石油類化合物的復(fù)雜性，不同的微生物對(duì)石油各成分的利用率不同，因此通過(guò)構(gòu)建復(fù)合菌群促進(jìn)石油降解已成為石油污染土壤修復(fù)的重要途徑之一。但在構(gòu)建菌群時(shí)，菌株之間的交互作用是首先要考慮的因素。有研究表明，一些混合菌群的石油降解效果明顯低于單菌，因?yàn)榫曛g存在著相互抑制作用［24］。王佳楠等［25］的研究認(rèn)為，親緣關(guān)系近的芽孢桿菌屬種間存在著協(xié)同促進(jìn)作用，因此同屬微生物構(gòu)建的菌群對(duì)石油的降解表現(xiàn)出促進(jìn)效果。Gong等［26］認(rèn)為屬水平上一致的外源細(xì)菌能夠刺激同屬的內(nèi)源細(xì)菌，從而促進(jìn)微生物強(qiáng)化石油的降解效果。我們對(duì)石油污染土壤的修復(fù)效果也證實(shí)，用同屬于紅球菌屬的菌株構(gòu)建的復(fù)合菌群降解率顯著高于單一菌株，表明二者之間通過(guò)協(xié)同促進(jìn)作用，增強(qiáng)了石油污染土壤的修復(fù)效果。該菌群能否對(duì)野外石油污染場(chǎng)地的修復(fù)發(fā)揮積極的作用還有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

鹽池油田污染土壤中石油降解菌多樣性豐富，假單胞菌和鏈霉菌是優(yōu)勢(shì)菌群，紅球菌屬菌株降解石油的能力較強(qiáng)，以2株紅球菌制備的復(fù)合菌劑對(duì)污染土壤的修復(fù)效果要顯著強(qiáng)于單一菌劑，具備開發(fā)為微生物修復(fù)劑的潛能。