唐昊 孫燦 李沅秋 羅朝兵

（樂山師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，樂山 614000）

植物生物質(zhì)主要由木質(zhì)纖維素組成，是地球上最豐富的生物質(zhì)組成部分。由于木質(zhì)纖維素可作為生物燃料制備的可持續(xù)資源，因此其降解過程受到廣泛關(guān)注［1］。纖維素是葡萄糖單體的聚合物，通過β-1，4-糖苷鍵連接，是木質(zhì)纖維素生物質(zhì)資源中最常見的成分之一［2］。大量文獻(xiàn)報(bào)道，纖維素聚合物的降解需要多種碳水化合物活性酶（carbohydrate-active enzymes，CAZymes）家族成員的協(xié)同作用，這些酶家族之間通過多重互補(bǔ)和協(xié)調(diào)氧化、水解和非水解活性共同作用實(shí)現(xiàn)碳水化合物的降解［3］。關(guān)于纖維素水解成葡萄糖單體的過程，其需要3種酶的協(xié)同作用，包括內(nèi)葡聚糖酶、外葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶［4］。在微生物中，如木霉屬（Trichoderma）［5］、曲霉屬（Aspergillus）［6］和青霉屬（Penicillium）［7］等真菌分泌的纖維素降解酶已被廣泛的研究，但細(xì)菌較真菌而言，具有生長速度更快、多酶復(fù)合物表達(dá)和極端環(huán)境的耐受性等優(yōu)勢，已成為目前纖維素酶生產(chǎn)研究的重點(diǎn)［8-10］。許多歸屬于芽孢桿菌屬（Bacillus）［11］、類芽胞桿菌屬（Paenibacillus）［12］、纖 維 菌 屬（Cellulomonas）［13］、噬纖維菌屬（Cytophaga）［14］等纖維素分解微生物都能產(chǎn)生纖維素降解酶。

研究表明昆蟲共生微生物可降解由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成的植物細(xì)胞壁［15］。這些微生物包括細(xì)菌和真菌，幫助宿主昆蟲利用植物細(xì)胞壁材料中的單糖。目前已有大量研究從昆蟲腸道中篩離得到纖維素降解細(xì)菌，如黃勝威等［16］從暗黑鰓金龜幼蟲腸道中分離得到假單胞菌屬Pseudomonas，微桿菌屬M(fèi)icrobacterium，德沃斯氏菌屬Devosia等屬中能夠降解纖維素的細(xì)菌，其中Pseudomonass屬中的消化還原假單胞菌Pseudomonas nitroreducens是暗黑鰓金龜幼蟲腸道內(nèi)最主要的纖維素降解菌；胡霞等和傅慧靜等［17］探討了松墨天牛（Monochamus alternatus）幼蟲腸道細(xì)菌的多樣性，并從中分離鑒定了以噬纖維細(xì)菌科細(xì)菌 Siphonobacter aquaeclarae 為優(yōu)勢菌等10個(gè)可降解纖維素的菌株；胡霞［18］從華山松大小蠹（Dendroctonus armandi）幼蟲腸道中分離出 91 株纖維素降解菌，其中沙雷氏菌屬為重要的纖維素降解菌等。

長足大竹象（Cyrtotrachelus buqueti）作為一種專食性害蟲，嚴(yán)重危害竹產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。Luo等［19-20］通過轉(zhuǎn)錄組測序等手段揭示了長足大竹象可降解慈竹木質(zhì)纖維素，進(jìn)一步通過微生物測序等手段發(fā)現(xiàn)長足大竹象腸道內(nèi)存在大量的共生菌，并參與木質(zhì)纖維素的降解，包括纖維素降解［21］。并且一些纖維素降解菌已被成功分離鑒定并表現(xiàn)出纖維素降解能力，如貝萊斯芽胞桿菌（Bacillus velezensis LC1）［22］。本研究以長足大竹象腸道為樣本，利用CMC培養(yǎng)基和剛果紅染色法篩選分離出具有較高纖維素能力的細(xì)菌Raoultella ornithinolytica LL1，通過基因組測序及分析揭示其降解纖維素的遺傳基礎(chǔ)，并且通過纖維素酶活的測定研究其纖維素降解能力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基配方 LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，pH調(diào)至7.0；CMC培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉5 g/L，NaNO33 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO40.5g/L，KCl 0.5 g/L，F(xiàn)eSO40.01 g/L，瓊脂15 g/L，pH調(diào)至7.0。

1.1.2 試劑配制 DNS試劑：200 g酒石酸鉀鈉加熱溶于一定水中，再加入10.0 g 3，5-二硝基水楊酸、10.0 g NaOH、2 g苯酚、0.5 g無水亞硫酸鈉加熱溶解，冷卻至室溫后，定容至1 000 mL，常溫保存；1% CMC緩沖溶液：200 mL蒸餾水中加入2 g羧甲基纖維素鈉，用紗布過濾水浴加熱后的溶液。取100 mL濾液、40 mL蒸餾水和20 mL的0.2 mol/L醋酸緩沖液（pH4.8）振蕩混勻，4℃低溫保存；1%水楊苷溶液：取1 g D-水楊苷和適量0.2 mol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH 4.8）于燒杯加熱溶解，定容至100 mL，4℃低溫保存；1%微晶纖維素：取1 g微晶纖維素和適量0.2 mol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH4.8）于燒杯中加熱溶解，定容至100 mL，4℃低溫保存；pH 4.8檸檬酸緩沖液：蒸餾水溶解稀釋8.4 g檸檬酸和17.6 g檸檬酸鈉至2 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離篩選 長足大竹象樣品采集于四川樂山市沐川縣（東經(jīng)103°98′，北緯28°96′）。在無菌條件下，使用無菌解剖工具解剖長足大竹象，挑出其完整腸道，于裝有少量無菌水的滅菌研缽中研磨均勻。將腸道研磨液按濃度梯度稀釋為 10-1-10-9，分別取0.1 mL的10-7-10-9的稀釋液涂布于CMC培養(yǎng)基，30℃恒溫培養(yǎng)。待培養(yǎng)基上長出單菌落后，反復(fù)在CMC培養(yǎng)基上劃線接菌，對菌進(jìn)行分離、純化培養(yǎng)。CMC培養(yǎng)基用0.2%剛果紅染液染色后用于篩選纖維素降解菌，水解能力比率 （HCR）用透明圈直徑與菌落直徑比值的大小表示［23］。通過鏡檢確保篩選的菌落為單菌落，并接種于斜面培養(yǎng)基，4℃保存。

1.2.2 細(xì)菌的分子生物學(xué)鑒定 以16S rRNA V3-V4 區(qū)為擴(kuò)增區(qū)，采用27F（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGYTACCTTGTACGACTT-3′）分別作為正向和反向引物進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增子的檢驗(yàn)使用1%瓊脂糖凝膠電泳。通過MEGA7軟件鄰接法構(gòu)建NCBI GenBank中檢索到的序列和參考序列的系統(tǒng)發(fā)育樹。PCR反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸100 s，循環(huán)30次；72℃修復(fù)延伸2 min。

1.2.3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 配制0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.5 mg/mL、0.6 mg/mL和0.7 mg/mL葡萄糖溶液。分別取上述濃度葡萄糖溶液0.1 mL、0.3 mL檸檬酸緩沖液（pH4.8）與0.6 mL DNS試劑于EP管中，振蕩混勻后沸水浴5 min。4 mL蒸餾水在冷卻后加入，混勻后用移液槍加0.2 mL反應(yīng)液于酶標(biāo)板，波長540 nm處測定OD值。以橫坐標(biāo)為葡萄糖濃度，縱坐標(biāo)為吸光值做出標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=0.977 9x-0.025 2，R2=0.992 4。

1.2.4 纖維素酶活的測定 粗酶液的制備：將1 mL菌液加入100 mL CMC培養(yǎng)基，30℃、200 r/min 下培養(yǎng)，分別取培養(yǎng)1、2、3、4、5和6 d后的培養(yǎng)液1 mL，4℃、4 000 r/min離心10 min，上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾滅菌后作為粗酶液。分別向0.3 mL的1% CMC、1%水楊苷或1%微晶纖維素溶液中加入0.1 mL粗酶液，50℃恒溫反應(yīng)60 min后加入0.6 mL DNS顯色劑，經(jīng)過5 min沸水浴令反應(yīng)終止。酶標(biāo)板中加入0.2 mL反應(yīng)液，OD值于540 nm波長下測定。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，空白對照為高溫滅活的粗酶液。

1.2.5 基因組DNA提取與測序 將單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中，菌株在30℃、170 r/min搖床中生長2 d后，使用離心機(jī)8 000 r/min轉(zhuǎn)速離心3 min收集菌體。菌株基因組DNA的提取采用CTAB法［24］，純化用中國南京諾唯贊生物科技有限公司生產(chǎn)的Wizard 基因組DNA純化試劑盒。全基因組測序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。利用HGAP 2.0過濾并進(jìn)行基因組組裝［25］。

1.2.6 基因預(yù)測和功能注釋 用Glimmer 3.0預(yù)測編碼基因的編碼區(qū)域。將預(yù)測到的基因采用BLAST比對到NCBI非冗余蛋白庫（NR）、蛋白質(zhì)直系通源簇（COGs）數(shù)據(jù)庫、Swiss-Pro、GO和KEGG數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行基因功能注釋。在生物信息學(xué)中，GO是一個(gè)重要的工具，并且統(tǒng)一表達(dá)了所有物種中的基因和基因產(chǎn)物［26］。KEGG是一個(gè)了解高級功能的數(shù)據(jù)資源庫，也可以分析代謝途徑。此外，AZy數(shù)據(jù)庫，利用HMMER［27］軟件與數(shù)據(jù)庫比對，取e<1e-10的注釋。

2 結(jié)果

2.1 纖維素降解菌的分離及鑒定

利用羧甲基纖維素鈉（CMC）選擇培養(yǎng)，從長足大竹象成蟲腸道中分離出PX19、PX20、PX21 3株纖維素降解菌。隨后將這3株菌分別涂布于剛果紅培養(yǎng)基，觀察降解圈并進(jìn)行測量。結(jié)果表明此3株菌菌落周圍均有明顯降解圈（圖1）。通過測定降解圈的大小并計(jì)算各菌株HCR值。菌株P(guān)X19（HCR：4.83）顯著高于PX20（HCR：1.59）和PX21（HCR：1.51）（圖1），表明菌株P(guān)X19纖維素降解能力最強(qiáng)，因此對PX19進(jìn)行進(jìn)一步研究。

圖1 纖維素降解菌PX19、PX20和PX21剛果紅染色對比Fig.1 Comparison of Congo red staining of cellulose degrading bacterium PX19, PX20 and PX21

利用引物27F和1492R擴(kuò)增16S rRNA基因序列并測序用于PX19的鑒定。PX19的16S rRNA基因序列長度為1 500 bp（登錄號：CP061719-CP061720）。將16S rRNA基因序列提交NCBI，并進(jìn)行序列blast分析并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果顯 示PX19與Raoultella ornithinolytica B6（NZ_CP012555.1）菌株相似性最高，相似度達(dá)到98%，表明PX19與R. ornithinolytica B6親緣性最高（圖 2）。因此，PX19被鑒定為R. ornithinolytica，并命名為R. ornithinolytica LL1。

圖2 纖維素降解菌PX19的鑒定Fig.2 Identification of cellulose degrading bacterium PX19

2.2 R. ornithinolytica LL1纖維素酶活

為了探究R. ornithinolytica LL1纖維素降解能力，測定了該菌株在羧甲基纖維素（CMC）培養(yǎng)中的纖維素酶活，包括內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。結(jié)果表明3種纖維素酶中，β-葡萄糖苷酶活性最高，其次是內(nèi)切葡聚糖酶，外切葡聚糖酶活性最低。在處理過程中，內(nèi)切葡聚糖酶處理第1天酶活為0.356 ± 0.008 U/mL，第4天達(dá)到最大酶活（1.232 ± 0.017 U/mL），隨后降低；外切葡聚糖酶酶活從0.148 ± 0.006 U/mL升高至0.478 ± 0.003 U/mL（第3天），隨后降低；β-葡萄糖苷酶酶活從0.682 ± 0.015 U/mL上升到1.443 ± 0.014 U/mL（第4天），隨后降低（圖3）。

圖3 R. ornithinolytica LL1纖維素酶活Fig.3 Determination of cellulase activity in R. ornithinolytica LL1

2.3 R. ornithinolytica LL1基因組測序與組裝

本研究利用三代Pacbio Sequl和二代Illumina Novaseq平臺對R. ornithinolytica LL1進(jìn)行完整基因組測序。如表1所示，R. ornithinolytica LL1基因組大小為5 584 354 bp，其中包括大小為5 440 254 bp的環(huán)狀染色體和144 100 bp的環(huán)狀質(zhì)粒。染色體GC含量為55.23%，其中基因和基因間區(qū)的GC含量分別為56.39%和48.63%；質(zhì)粒GC含量為52.06%，其中基因和基因間區(qū)的GC含量分別為56.16%和55.13%?；蚪M共有5 512個(gè)基因，其中染色體含有5 396個(gè)基因，而質(zhì)粒含有116個(gè)基因，基因總長度為4 789 311 bp；基因組內(nèi)包含重復(fù)序列153個(gè)；5S rRNA、16S rRNA和23S rRNA的數(shù)量分別為9、8和8個(gè)；使用NR、Swiss-Prot、Pfam、COG、GO和KEGG數(shù)據(jù)庫中分別注釋到5 511、4 419、4 584、4 745、3 610和3 336個(gè)基因。進(jìn)一步根據(jù)基因組相關(guān)信息，使用TBtools軟件［28］繪制了R. ornithinolytica LL1基因組圈圖（圖4）。

圖4 R. ornithinolytica LL1的全基因組圈圖Fig. 4 Whole genome circle of R. ornithinolytica LL1

表1 R. ornithinolytica LL1的基因組特征Table1 Genome characteristics of R. ornithinolytica LL1

2.4 基因組注釋中參與糖代謝的COGs

共有4 745個(gè)基因被注釋到2 847個(gè)COGs中，其中碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝（Carbohydrate transport and metabolism，9.57%）、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝（Amino acid transport and metabolism，9.78%）和轉(zhuǎn)錄（Transcription，8.83%）三類最為豐富（表2）。為了從遺傳水平闡明R. ornithinolytica LL1在纖維素降解中的潛能，本研究重點(diǎn)分析了參與碳水化合物代謝的COGs。共有454個(gè)基因被注釋到碳水化合物代謝中，包括192個(gè)COGs，其中最豐富的COGs是COG0524（pfkb結(jié)構(gòu)域蛋白）、COG2814（主要促進(jìn)劑）、COG1263（PTS系統(tǒng)），COG0477（主要促進(jìn)者超家族）、COG1940（ROK家族）和COG2723（β-葡萄糖苷酶）。功能注釋的高度多樣性表明R. ornithinolytica LL1具有降解纖維素的遺傳基礎(chǔ)。

表2 R. ornithinolytica LL1 COG注釋Table 2 COG annotation of R. ornithinolytica LL1

2.5 GO注釋

GO注釋表明，分子功能包含最多的基因數(shù)（5 333），其次是生物過程（基因數(shù)：4 418）和細(xì)胞成分（基因數(shù)：2 300）（圖5）。在分子功能方面，最主要的5個(gè)途徑是DNA結(jié)合（DNA binding，GO0003677，422個(gè)基因）、ATP結(jié)合（ATP binding，GO0005524，411個(gè)基因）、轉(zhuǎn)錄因子活性（transcription factor activity，GO0003700，230個(gè)基因）、金屬離子 結(jié) 合（metal ion binding，GO0046872；171個(gè) 基因）和載體活性（transporter activity，GO0005215；135個(gè)基因）。氧化還原過程（oxidation-reductionprocess，GO0055114，366個(gè)基因）和轉(zhuǎn)錄調(diào)控（regulation of transcription，GO0006355，336個(gè) 基因）是生物過程中最主要的途徑，而膜的組成部分（integral component of membrane，GO0016021，906個(gè)基因）和細(xì)胞質(zhì)（cytoplasm，GO0005737，433個(gè)基因）是細(xì)胞成分最主要的途徑。此外，通過分析與碳水化合物代謝相關(guān)的GOs，確定了114個(gè)與碳水化合物代謝相關(guān)的GO項(xiàng)，包括GO0004553（水解O-糖基化合物的水解酶活性）、GO0005975（碳水化合物代謝過程）和GO0016787（水解酶活性）。

圖5 R. ornithinolytica LL1 GO注釋Fig.5 GO annotation of R. ornithinolytica LL1

2.6 KEGG注釋

在KEGG途徑的6個(gè)分類中，基因數(shù)量最多的是與代謝相關(guān)的途徑，其次是環(huán)境信息處理（圖6）。KEGG注釋的代謝中碳水化合物代謝包含393個(gè)基因，其中蔗糖和淀粉代謝（starch and sucrose metabolism，ko00500，67個(gè)基因）、糖酵解/糖異生（glycolysis/gluconeogenesis，ko00010，62個(gè)基因）丙酮酸代謝（pyruvate metabolism，ko00620，58個(gè)基因）、戊糖磷酸途徑（pentose phosphate pathway，ko00030，48個(gè)基因）和氨基糖和核苷酸糖代謝（amino sugar and nucleotide sugar metabolism，ko0052047個(gè)基因）等途徑占主導(dǎo)地位（表3）。

表3 碳水化合物代謝相關(guān)KEGG通路Table 3 KEGG pathways related to carbohydrate metabolism

圖6 R. ornithinolytica LL1 KEGG注釋Fig.6 KEGG annotation of R. ornithinolytica LL1

2.7 碳水化合物活性酶（CAZymes）注釋

基因組碳水化合物活性酶注釋結(jié)果表明，R. ornithinolytica LL1基因組注釋到128個(gè)CAZyme基因，占全部編碼基因的2.32%，其中糖苷水解酶（GH）對碳水化合物的降解具有關(guān)鍵作用，在基因組中注釋到55個(gè)GH基因（圖7）。此外，還鑒定了32個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶（GT）基因，23個(gè)糖酯酶（CE）基因，2個(gè)多糖裂解酶（PL）基因和16個(gè)具有輔助活性的酶（AA）基因（圖7）。一共有23個(gè)GH家族被注釋到，其中數(shù)量最多的為GH1、GH13、GH23和GH109，分別有9、8、7和5個(gè)成員；23個(gè)CE基因分配到8個(gè)CE家族，包括，CE1、CE3、CE4等，其中CE1成員數(shù)量最多，有9個(gè)；AA中共有7個(gè)家族被注釋，其中成員數(shù)量最多的是AA3；2個(gè)PL家族被注釋，包括PL9和PL22。

圖7 R. ornithinolytica HZ1的碳水化合物活性酶注釋Fig.7 Annotation of the carbohydrate active enzyme of R. ornithinolytica LL1

2.8 木質(zhì)纖維素酶基因

R. ornithinolytica LL1基因組中共注釋到25個(gè)纖維素降解相關(guān)基因，其中包括3個(gè)內(nèi)切葡聚糖酶（endoglucanase，EC 3.2.1.4）基因、10個(gè)β-葡萄糖苷酶（beta-glucosidase，EC 3.2.1.21）基因、2個(gè)6-磷酸-β-葡萄糖苷酶（6-phospho-beta-glucosidase，EC 3.2.1.86）基因、9個(gè)α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase，EC 3.2.1.20）基因和1個(gè)蔗糖-6-磷酸水解酶（sucrose-6-phosphate hydrolase，EC 2.4.1.-）（表4）。內(nèi)切葡聚糖酶基因編碼的蛋白質(zhì)屬于GH8和GH9家族；β-葡萄糖苷酶基因編碼的蛋白質(zhì)屬于GH1和GH3；α-葡萄糖苷酶基因編碼的蛋白質(zhì)主要屬于GH13和GH4家族；6-磷酸-β-葡萄糖苷酶屬于GH4家族（表4）。豐富的纖維素酶基因表明R. ornithinolytica LL1具有較強(qiáng)的纖維素降解潛力。

R. ornithinolytica LL1基因組中共有6個(gè)基因編碼半纖維素酶，包括3個(gè)木聚糖1，4-β-木糖苷酶（xylan 1，4-beta-xylosidase，EC：3.2.1.37）基因、2個(gè)β-半乳糖苷酶（beta-galactosidase，EC：3.2.1.23）基因和1個(gè)阿拉伯半乳聚糖內(nèi)-1，4-β-半乳糖苷酶（arabinogalactan endo-1，4-beta-galactosidase，EC：3.2.1.89）基因（表4）。木聚糖1，4-β-木糖苷酶屬于GH43家族；β-半乳糖苷酶屬于GH2和GH42家族；阿拉伯半乳聚糖內(nèi)-1，4-β-半乳糖苷酶屬于GH53家族（表4）。

R. ornithinolytica LL1基因組中共有11個(gè)木質(zhì)素降解相關(guān)基因，包括2個(gè)漆酶（laccase，EC 1.10.3.2）基因、1個(gè)錳過氧化物酶（manganese peroxidase，

EC 1.11.1.13）基 因、1個(gè)FAD結(jié) 合 蛋 白（FADbinding protein）和7個(gè)纖維素二糖脫氫酶（cellobiose dehydrogenase，EC 1.1.99.18）基因。其中漆酶基因編碼的蛋白質(zhì)屬于AA1家族，錳過氧化物酶基因編碼的蛋白質(zhì)屬于AA2家族，纖維素二糖脫氫酶基因編碼的蛋白質(zhì)屬于AA3家族（表4）。該結(jié)果表明R. ornithinolytica LL1同時(shí)具有木質(zhì)素降解能力。

表4 編碼R. ornithinolytica LL1木質(zhì)纖維素降解酶基因Table 4 Genes encoding lignocellulose degradation in R. ornithinolytica LL1

3 討論

Raoultella ornithinolytica作為一類具有纖維素降解細(xì)菌，其基因組包含豐富的CAZymes基因［29］。本研究從長足大竹象腸道內(nèi)篩選到一株纖維素降解細(xì)菌R. ornithinolytica LL1，基因組大小為 5 584 354 bp，與一種木質(zhì)素降解相關(guān)的R. ornithinolytica S12基因組大小接近［29］，但略大于序列相似度極高的R. ornithinolytica B6基因組［30］。R. ornithinolytica B6分離自石油污染的土壤，其基因組中包含4 909個(gè)基因，其可利用己糖、戊糖、二糖及甘油等作為碳源或在過表達(dá)budABC基因情況下合成2，3-丁二醇［30-32］。

R. ornithinolytica LL1基因組內(nèi)共有128個(gè)編碼CAZyme基因，分別歸屬于GH家族、GT家族、CE家族、PL家族和AA家族。GH家族含有作用于糖苷鍵的各種水解酶［33］，而R. ornithinolytica LL1基因組中包含23個(gè)GH家族成員，其中GH1、GH8和GH9等家族編碼纖維素酶，GH5、GH7、GH12等家族主要編碼內(nèi)切葡聚糖酶，GH1、GH3家族主要與β-葡萄糖苷酶相關(guān)，它們共同參與了纖維素的降解［34］。與半纖維素降解相關(guān)的CAZyme家族主要包括GH43、GH2、GH42和GH53。其中，GH43是木聚糖降解的重要成員［35］，GH53被報(bào)道為內(nèi)切-1，4-β-半乳糖苷酶且具有水解1，4-β-D-半乳糖苷鍵的能力［36］。R. ornithinolytica LL1基因組中還鑒定出促進(jìn)木聚糖分解相關(guān)的CEs。CE3、CE4和CE7是乙酰木聚糖酯酶，可以促進(jìn)木聚糖的溶解［37-38］，此外CE4還含有參與甲殼素降解的肽聚糖N-脫乙?；?9］。CE10鑒定出羧酸酯酶和木聚糖酶活性并與半纖維素降解相關(guān)［40］。AAs包括AA1、AA2、AA4及AA7等。其中，AA4含有香草醇氧化酶，可以轉(zhuǎn)化某些酚類［41］，AA7酶參與木質(zhì)纖維素的生物轉(zhuǎn)化［42］。這些結(jié)果表明R. ornithinolytica LL1具有降解纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的潛力。

本研究首次從長足大竹象腸道內(nèi)篩選出R. ornithinolytica，解析了R. ornithinolytica LL1基因組，探討了其纖維素降解的遺傳基礎(chǔ)，并通過酶活驗(yàn)證了其纖維素降解潛力，為該菌的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)，可進(jìn)一步將其作為開發(fā)木質(zhì)纖維素酶的資源。

4 結(jié)論

本研究從長足大竹象腸道篩選到一株高效纖維素降解細(xì)菌R. ornithinolytica LL1，具有較高的纖維素酶活，其中纖維素酶β-葡萄糖苷酶活性最高，其次是內(nèi)切葡聚糖酶，外切葡聚糖酶活性最低。R. ornithinolytica LL1基因組大小為5 584 354 bp，包含5 512個(gè)基因，其中NR、Swiss-Prot、Pfam、COG、GO和KEGG數(shù)據(jù)庫中分別注釋有5 511、4 419、4 584、4 745、3 610和3 336個(gè)基因?；蚪M內(nèi)共有128個(gè)編碼CAZyme基因，包括55個(gè)GH基因、32個(gè)GT基因、23個(gè)CE基因、2個(gè)PL基因和16個(gè)AA基因，同時(shí)鑒定了木質(zhì)纖維素降解相關(guān)基因。本研究通過基因組測序及分析揭示了該菌其降解木質(zhì)纖維素的遺傳基礎(chǔ)，為木質(zhì)纖維素的降解提供新的微生物資源。