朱海云 馬瑜 柯楊 李勃

（陜西省微生物研究所，西安 710043）

獼猴桃潰瘍病是一種由丁香假單胞菌獼猴桃致病 變 種（Pseudomonas syringae pv. actinidiae，Psa）引起的細菌性病害，主要危害樹干，枝條，葉片、花蕾，嚴重時造成整株枯死，常導致毀滅果園的嚴重后果。自19世紀80年代在日本爆發(fā)后，先后席卷中國、韓國、意大利、新西蘭、葡萄牙、西班牙、土耳其等各獼猴桃主產(chǎn)區(qū)［1］。Psa具有強致病力和傳染性，不僅可存活于落葉和修剪的枝條中，甚至還可附著在無癥狀的葉片中，給世界獼猴桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展造成了嚴重的威脅。近年來，針對獼猴桃潰瘍病的防治主要依賴于銅制劑和農(nóng)用鏈霉素［2］，但是長期施用此類藥劑不僅會導致病原菌產(chǎn)生抗藥 性［3-4］，還會對植物及種植環(huán)境微生物群落產(chǎn)生毒性和污染。因此，亟需尋找有效的環(huán)境友好型的防治藥劑，如細菌、放線菌和木霉等進行獼猴桃潰瘍病防治［5-7］。

植物內(nèi)生菌（endophyte）是指那些在其生活史的一定階段或全部階段生活在健康植物組織和器官內(nèi)部而不引起宿主任何癥狀的真菌或細菌［8］。內(nèi)生細菌能夠分泌多種抗菌物質(zhì)，在促進宿主植物生長的同時增強其抗逆境、抗病蟲害能力［9］，是生物活性物質(zhì)的重要來源［10］。已有研究表明，植物內(nèi)生細菌對病原細菌、植物病原真菌具有明顯的拮抗活性［11-12］，是潛在的生防資源庫。銀杏（Ginkgo biloba L.）是銀杏屬現(xiàn)存的唯一生存種，其果實和葉子具有很高的藥用價值，且其在生長期很少感染病蟲害。項目組在前期研究中從銀杏根、莖及枝葉中分離得到多株不同類型內(nèi)生細菌［13］，現(xiàn)以獼猴桃潰瘍病病原菌Psa為靶標，開展抗獼猴桃潰瘍病生防內(nèi)生細菌的分離、篩選及鑒定工作，并通過其對多種常見植物病原菌真菌的拮抗試驗，測定該菌株的抑菌譜，旨為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物 野生銀杏（G. biloba L.）標本采自秦嶺太白山自然保護區(qū)。

1.1.2 供試病原菌 Pseudomonas syringae pv. Actinidiae；Alternaria alternata；Botrytis cinerea；Fusarium oxysporum；Trichoderma virens；Fusarium oxysporum f.sp.Vasinfectum；Botryosphaeria dothidea。以上菌種均由本實驗室從致病植株中分離、鑒定，并保藏于陜西省微生物研究所菌種保藏中心（SMRL）。

1.1.3 培養(yǎng)基 PSA培養(yǎng)基：蛋白胨 0.5%，蔗糖 2%，K2HPO40.05%，MgSO4·7H2O 0.025%，瓊 脂15%，余量為水，pH 7.2-7.4，121℃滅菌20 min。PDA培養(yǎng)基：土豆200 g/L，葡萄糖20.0 g/L，瓊脂15 g/L，余量為水，pH 7.2-7.4，121℃滅菌20 min。發(fā)酵培養(yǎng)基［14］：葡萄糖2.5%，蛋白胨0.05%，可溶性淀粉4%，NaNO30.3%，MgSO4·7H2O 0.15%，K2HPO40.25%，CaCO30.12%，MnSO40.035%，余量為水，pH7.0，121℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 銀杏內(nèi)生細菌的分離、純化 參考李勃等［13］的三步表面消毒法。

1.2.2 拮抗菌的篩選 以獼猴桃潰瘍病病原菌Psa為供試靶標菌，采用管碟法［15］，篩選對Psa具有拮抗作用的內(nèi)生細菌。取1 mL濃度為108CFU/mL的Psa菌懸液加至50℃水浴保溫備用的100 mL PSA培養(yǎng)基，混勻倒平板，以無菌水為對照。待培養(yǎng)基冷卻后，向每個平板上均勻放置3個牛津杯，每個牛津杯加入200 μL待測發(fā)酵上清液，于28℃下培養(yǎng)48 h后，測量抑菌圈直徑，每個實驗做3次平行，取平均值。

1.2.3 拮抗菌的鑒定 形態(tài)觀察及理化實驗參考《伯杰氏細菌系統(tǒng)手冊（第九版英文）》和《常見細菌鑒定手冊》。

用TaKaRa全基因組提取試劑盒提取菌株基因組DAN，采用細菌16S rRNA通用引物27F（5′- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3′） 和1492R（5′-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′）擴 增 細 菌 的16S rRNA基因［16］。PCR擴增反應(yīng)條件為：95℃ 5 min；95℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 2.5 min，共35個循環(huán)；72℃延伸5 min。將PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，交上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行測序。當鑒定菌株的16S rDNA序列與模式菌株的同源性大于99%時，可以對其進行種水平上的鑒定。在GenBank中采用BLAST程序?qū)?6S rRNA序列進行比對分析［17］，并采用MEGA 6.0軟件中的鄰接法（neighborjoining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 獼猴桃潰瘍病盆栽防治實驗 將有5-7片葉子的獼猴桃幼苗移栽到花盆中，在接種病原菌前2 d用MA23發(fā)酵液上清對獼猴桃幼苗進行全株噴霧，之后用針刺法接種病原菌，接種1 d和5 d后分別再用MA23發(fā)酵液上清進行全株噴霧防治，全程設(shè)置清水對照，接種9 d后統(tǒng)計病情指數(shù)。以黃色暈圈直徑或者病斑面積代表病級值，計算防效：

1.2.5 拮抗菌真菌抑菌譜的檢測 采用平板對峙法檢測拮抗菌對病原真菌的抑菌譜［18］。用直徑5 mm的打孔器分別在培養(yǎng)1 d的細菌平板和培養(yǎng)5 d的病原真菌平板上打孔，獲得同質(zhì)等量的菌塊。將真菌菌塊置于直徑為90 cm的PDA平板中心，同時在距平皿中心22.5 cm處的圓周上均勻放置3塊細菌菌塊，并設(shè)置不放置細菌菌塊的平板對照，各設(shè)3個重復，于28℃培養(yǎng)5 d后測量細菌及病原菌兩接種點連線上病原菌的菌落半徑，計算抑菌率。

2 結(jié)果

2.1 銀杏樹內(nèi)生菌的分離與拮抗菌的篩選

共分離到86株銀杏內(nèi)生細菌，其中有7株對Psa具有拮抗活性，而菌株MA23的拮抗活性最為顯著（圖1）。

圖1 Psa拮抗內(nèi)生菌的篩選Fig. 1 Screening of antagonistic endophytic bacteria against Psa

2.2 拮抗菌株MA23的鑒定

2.2.1 形態(tài)特征及生理生化特征 在LB培養(yǎng)基上，培養(yǎng)初期菌落為乳白色，膿狀，圓形，邊緣整齊，菌落稍隆起，表面濕潤，直徑1-2 mm；培養(yǎng)后期菌落呈淡黃色，邊緣不規(guī)則，表面干燥有褶皺（圖2-A）；在液體培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)，表面形成白色菌膜。菌體細胞為桿狀，末端方形，呈短鏈或長鏈狀，大小約1.1 μm×3.5 μm（圖2-B）；產(chǎn)芽孢，芽孢為柱狀，中生或近中生，孢囊無明顯膨脹（圖2-C）。MA23菌株的生理生化特征見表1。

表1 MA23菌株生理生化鑒定結(jié)果Table 1 Physiological and biochemical identification results of MA23

圖2 MA23菌株的形態(tài)特征Fig. 2 Morphological characteristics of MA23

2.2.2 菌株MA23的分子生物學鑒定 菌株MA23的16S rDNA序列長度為1 474 bp。將該序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的核酸序列進行同源性比對，發(fā)現(xiàn)MA23菌株與蠟樣芽孢桿菌的相似性達到100%。選擇相似性較高的菌株及芽孢屬等相關(guān)菌株的16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖3。結(jié)合形態(tài)特征、生理生化特征以及16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果最終確定MA23菌株在細菌分類學上屬于蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）。

圖3 MA23菌株的N-J系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Neighbor-joining phylogenetic tree of MA23

2.3 拮抗菌MA23對獼猴桃潰瘍病的盆栽防治實驗

用MA23發(fā)酵液上清對獼猴桃潰瘍病進行盆栽防治實驗，并在接種病原9 d后統(tǒng)計病情指數(shù)，結(jié)果顯示MA23對獼猴桃潰瘍病的盆栽防治效率為93.6%。從圖4可以看出，接種病原9 d后，清水對照組葉片出現(xiàn)不規(guī)則的褐色斑點，周圍有黃色的暈圈，發(fā)病嚴重；而MA23防治組葉片則很少出現(xiàn)褐色斑點，僅出現(xiàn)極少數(shù)的面積較小的黃斑點，這說明MA23對獼猴桃潰瘍病具有較好的盆栽防治效果。

圖4 MA23對獼猴桃潰瘍病的盆栽防治實驗Fig. 4 Pot experiment of MA23 controlling kiwifruit canker

2.4 拮抗菌MA23對病原真菌的抑制

MA23菌株對6種真菌病原菌的平板對峙實驗如圖5所示，對6種真菌病原的抑制率見表2。A23菌株對Botrytis cinerea（番茄灰霉病病原）和Alternaria alternata（蘋果黑斑病病原）具有很好的抑制效果，抑制率超過90%；對Trichoderma virens（郁金香腐爛病病原）和Fusarium oxysporum（甘薯干腐病病原）具有抑制效果，抑制率在70%以上；對Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum（棉花枯萎病病原）也具有一定的抑制效果，抑制率為54.21%；而對Botryosphaeria dothidea（蘋果干腐病病原）抑制效果不佳，抑制率僅為29.9%。

圖5 蠟樣芽孢桿菌MA23對病原真菌的平板對峙實驗Fig. 5 Confrontation experiments of Bacillus cereus MA23 against pathogenic fungi

表2 MA23對不同植物病原真菌的抑制率Table 2 Inhibition ratios of MA23 against different plant pathogenic fungi

3 討論

由于Psa定殖于獼猴桃植株組織內(nèi)部，因此用于獼猴桃潰瘍病防治的生防菌需要能夠有效定殖于植株組織內(nèi)部而發(fā)揮防治作用。研究表明植物內(nèi)生菌能廣泛定殖于宿主的不同組織，它們通過吸附、侵入和定殖3個過程進入到植物體內(nèi)，且能在植物體內(nèi)轉(zhuǎn)移［19-20］。Wicaksono等［5］證明內(nèi)生假單胞菌能夠有效定殖于獼猴桃植株內(nèi)，且能減輕獼猴桃潰瘍病癥狀。本研究所篩選到的MA23菌株是一株可適應(yīng)多種環(huán)境的內(nèi)生蠟樣芽孢桿菌，能夠在獼猴桃植株內(nèi)有效定殖，進而發(fā)揮防治獼猴桃潰瘍病的作用。

蠟樣芽孢桿菌是一種能產(chǎn)生抗逆性芽孢的革蘭氏陽性細菌，它分布廣泛，易于培養(yǎng)和保存，抗逆性強，能適應(yīng)各種環(huán)境。蠟樣芽孢桿菌可產(chǎn)生多種抑菌活性物質(zhì)，如抗生素、細菌素、抗菌肽等［21-23］，可有效抑制病原微生物的繁殖，對植物根際有促生和防病等功效［24-25］。大量研究表明，蠟樣芽孢桿菌不但可以有效抑制細菌，還對多種植物病原真菌具有較好的抑制效果。例如，蠟樣芽孢桿菌ANTI-8098A能很好地定殖于番茄植株內(nèi)，對番茄青枯病（病原為Ralstonia solanacearum）有較好的防效［26］；蠟樣芽孢桿菌B3-7對小麥紋枯病（病原為Rhizoctonia cerealis）和小麥全蝕?。ú≡瓰镚aeumannomyces graminis）均有防治效果［27-28］；蠟樣芽孢桿菌BCJB01對可可毛色二孢菌（Lasiodiplodia theobromae）有抑制作用，可用于防治葡萄潰瘍?。?9］。綜合以往的研究結(jié)果可知，蠟樣芽孢桿菌對真菌及革蘭氏陽性菌均具有很好的抑制作用，而對革蘭氏陰性菌的抑制作用卻少見報道。本研究所篩選到的蠟樣芽孢桿菌MA23不僅對革蘭氏陰性菌Psa具有較好的拮抗活性，而且對多種植物病原真菌也具有較好的抑制效果，說明MA23抑菌譜較廣，在農(nóng)業(yè)病害防治中具有更廣泛的應(yīng)用價值和較好的應(yīng)用前景。

本研究以Psa為靶標菌通過抑菌圈法從野生銀杏內(nèi)生細菌中篩選到了拮抗活性菌株MA23，該菌株被鑒定為蠟樣芽孢桿菌。蠟樣芽孢桿菌MA23不但可以在體外有效抑制Psa，而且對多種植物真菌病原也具有抑制效果，因此可將其進一步應(yīng)用于獼猴桃潰瘍病的田間防治，并可開展其對獼猴桃真菌病原菌的防治研究。為了有效提高蠟樣芽胞桿菌MA23的田間防治效果，仍需要開展一系列的研究工作，如優(yōu)化發(fā)酵工藝，提高其抑菌活性；研究其在獼猴桃植株內(nèi)的定殖規(guī)律以便于合理安排噴施方式及時間等。

4 結(jié)論

本研究通過表面消毒法從野生銀杏中分離到86株內(nèi)生細菌。以Psa為指標菌，通過抑菌圈法篩選到7株對Psa具有拮抗活性的菌株，其中MA23菌株對Psa的拮抗活性最高。結(jié)合形態(tài)特征、生理生化特征以及16S rRNA基因序列分析，將MA23鑒定為蠟樣芽孢桿菌。蠟樣芽孢桿菌MA23不僅對獼猴桃潰瘍病具有很好的防治效果，盆栽防治效率為93.6%，而且，其對植物病原真 菌Alternaria alternata、Botrytis cinerea、Fusarium oxysporum、Trichoderma virens和Fusarium oxysporum f.sp.Vasinfectum也具有抑制效果。