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        α-硫辛酸對(duì)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞糖代謝紊亂的改善作用

        2021-08-10 04:05:12安仙蓉管俊歡楊秀麗吳先進(jìn)梁冰
        中國(guó)藥房 2021年14期
        關(guān)鍵詞:胰島素

        安仙蓉 管俊歡 楊秀麗 吳先進(jìn) 梁冰

        中圖分類號(hào) R965;Q493.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408(2021)14-1703-06

        DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.14.07

        摘 要 目的:研究α-硫辛酸對(duì)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞糖代謝紊亂的改善作用。方法:采用MTT法測(cè)定25~1 000 ?mol/L α-硫辛酸對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2存活率的影響,以確定α-硫辛酸給藥濃度。實(shí)驗(yàn)設(shè)陰性對(duì)照組、胰島素抵抗組(1×10-7 mol/L胰島素)、聯(lián)合抵抗組(30 ?mol/L 亞砷酸鈉+1×10-8 mol/L胰島素)和α-硫辛酸低、中、高濃度組。按分組加入α-硫辛酸作用HepG2細(xì)胞12 h后,再分別給予相應(yīng)濃度的亞砷酸鈉或/和胰島素繼續(xù)培養(yǎng)24 h。采用葡萄糖氧化酶法檢測(cè)細(xì)胞葡萄消耗量,比色法檢測(cè)細(xì)胞己糖激酶、丙酮酸激酶活性,蒽酮法檢測(cè)細(xì)胞糖原含量,Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4(GLUT4)、磷酸化糖原合成激酶3β(p-GSK3β)、GSK3β蛋白表達(dá)水平和磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)/Akt、p-GSK3β/GSK3β比值。結(jié)果:25、50、100 ?mol/L的α-硫辛酸對(duì)細(xì)胞存活率無(wú)明顯影響(P>0.05),且細(xì)胞存活率均大于96%,故將其作為后續(xù)研究的低、中、高濃度。與陰性對(duì)照組比較,胰島素抵抗組、聯(lián)合抵抗組細(xì)胞葡萄糖消耗量、己糖激酶和丙酮酸激酶活性、糖原含量、GLUT4和p-GSK3β蛋白表達(dá)水平、p-Akt/Akt和p-GSK3β/GSK3β比值均顯著降低,GSK3β蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)。與聯(lián)合抵抗組比較,α-硫辛酸各濃度組細(xì)胞葡萄糖消耗量(α-硫辛酸低濃度組除外)、己糖激酶(α-硫辛酸低、中濃度組除外)和丙酮酸激酶(α-硫辛酸低、中濃度組除外)活性、糖原含量、GLUT4(α-硫辛酸低濃度組除外)、p-GSK3β蛋白表達(dá)水平和p-Akt/Akt(α-硫辛酸低、中濃度組除外)、p-GSK3β/GSK3β(α-硫辛酸低濃度組除外)比值均顯著升高,GSK3β(α-硫辛酸低、中濃度組除外)蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05),且α-硫辛酸高濃度組細(xì)胞糖原含量、GLUT4蛋白表達(dá)水平、p-GSK3β/GSK3β比值和α-硫辛酸中、高濃度組細(xì)胞p-GSK3β蛋白表達(dá)水平的改善效果更明顯(P<0.05)。結(jié)論:α-硫辛酸對(duì)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞的糖代謝紊亂具有一定的改善作用,其機(jī)制可能與增加葡萄糖消耗,增強(qiáng)糖代謝相關(guān)酶活性,提高糖原含量,上調(diào)Akt、GSK3β蛋白的磷酸化水平和GLUT4、p-GSK3β蛋白的表達(dá)水平,下調(diào)GSK3β蛋白的表達(dá)水平有關(guān)。

        關(guān)鍵詞 α-硫辛酸;人肝癌細(xì)胞HepG2;亞砷酸鈉;胰島素抵抗;糖代謝紊亂;磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B

        Improvement Effects of α-lipoic Acid on Glucose Metabolism Disorder of Insulin Resistant HepG2 Cells

        AN Xianrong1,GUAN Junhuan1,YANG Xiuli1,WU Xianjin1,LIANG Bing1,2(1. Dept. of Pharmacology, School of Basic Medical Sciences, Guizhou Medical University, Guiyang 550025, China; 2. Key Laboratory of Environmental Pollution and Disease Monitoring, Ministry of Education, Guiyang 550025, China)

        ABSTRACT? ?OBJECTIVE: To study the improvement effects of α-lipoic acid on glucose metabolism disorder of insulin resistant HepG2 cells. METHODS: The effects of 25-1 000 ?mol/L α-lipoic acid on survival rate of human hepatoma cell HepG2 were determined by MTT assay so as to determine the concentration of α-lipoic acid. Negative control group, insulin resistance group (1×10-7 mol/L insulin), combination resistance group (30 ?mol/L sodium arsenite+1×10-8 mol/L insulin), α-lipoic acid low- concentration, medium-concentration and high-concentration groups were set up. HepG2 cells were treated with α-lipoic acid for 12 h and then cultured with corresponding concentration of sodium arsenite or/and insulin for 24 h. The glucose oxidase method was used to detect the glucose consumption, colorimetric method was used to detect hexokinase activity and pyruvate kinase activity, and anthrone method was used to detect glycogen content. Western blot assay was used to detect the protein expression of GLUT4, p-GSK3β and GSK3β as well as the ratio of p-Akt/Akt and p-GSK3β/GSK3β. RESULTS: 25, 50, 100 ?mol/L α-lipoic acid had no significant effect on the survival rates of HepG2 cells (P>0.05), and survival rates of HepG2 cells were higher than 96%, so they were used as the low, medium and high concentration for follow-up study. Compared with negative control group, glucose consumption, the activities of hexokinase and pyruvate kinase, glycogen content, protein expression of GLUT4 and p-GSK3β, the ratio of p-Akt/Akt and p-GSK3β/GSK3β were decreased significantly in insulin resistance group and combined resistance group, while the protein expression of GSK3β was increased significantly (P<0.05). Compared with combination resistance group, the glucose consumption (except for α-lipoic acid low- concentration group), the activities of hexokinase (except for α-lipoic acid low-concentration and medium-concentration groups) and pyruvate kinase (except for α-lipoic acid low-concentration and medium-concentration groups), glycogen contents, protein expression of GLUT4 (except for α-lipoic acid low-concentration group) and p-GSK3β, the ratio of p-Akt/Akt (except for α-lipoic acid low-concentration and medium-concentration groups) and p-GSK3β/GSK3β (except for α-lipoic acid low-concentration groups) were increased significantly in α-lipoic acid groups, while protein expression of GSK3β (except for α-lipoic acid low-concentration and medium-concentration groups) was decreased significantly (P<0.05); glycogen content, protein expression of GLUT4 and the ratio of p-GSK3β/GSK3β in α-lipoic acid high-concentration group as well as the protein expression of p-GSK3β in α-lipoic acid medium-concentration and high-concentration groups were improved significantly(P<0.05). CONCLUSIONS: α-lipoic acid can improve the disorder of glucose metabolism in insulin resistant HepG2 cells, the mechanism of which may be associated with the increase of glucose consumption, the activities of glucose metabolism related enzymes and? glycogen content, and expression up-regulation of the phosphorylation levels of Akt and GSK3β protein, the expression of GLUT4 and p-GSK3β proteins, down-regulation of the expression of GSK3β protein.

        KEYWORDS? ?α-lipoic acid; Human hepatoma cell HepG2; Sodium arsenite; Insulin resistance; Glucose metabolism disorder; PI3K/Akt

        砷是廣泛分布于自然界的非金屬元素,具有較強(qiáng)的毒性,長(zhǎng)期飲用含砷量較高的水會(huì)引起慢性砷中毒[1]。已有流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示,環(huán)境砷暴露與糖尿病患病率或發(fā)病率增加有關(guān),且砷暴露條件下的糖尿病特征與2型糖尿病相似[2-5]。因此,砷與糖尿病的關(guān)系成為砷中毒研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)問題之一。

        α-硫辛酸是一種兼具水溶性和脂溶性的代謝抗氧化物,臨床研究發(fā)現(xiàn),該成分可促進(jìn)體內(nèi)葡萄糖的吸收,具有調(diào)節(jié)血糖平衡的作用[6]。此外,α-硫辛酸還能改善糖尿病周圍神經(jīng)病變引起的臨床癥狀(如肢體麻木、燒灼感、刀割樣痛、針刺樣痛癥狀)[7-8]。不僅如此,α-硫辛酸還可解除重金屬對(duì)巰基酶的毒性作用,促進(jìn)大鼠體內(nèi)重金屬的外排,減少重金屬在其體內(nèi)的蓄積[9]。胰島素抵抗是2型糖尿病發(fā)病的重要原因[10]。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號(hào)通路是胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要通路之一,其可通過(guò)調(diào)節(jié)下游葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4(GLUT4)、糖原合成激酶3β(GSK3β)蛋白的表達(dá)來(lái)參與細(xì)胞的糖代謝過(guò)程,該通路的傳遞受阻與胰島素抵抗的發(fā)生密切相關(guān)[11]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),一定濃度的亞砷酸鈉與1×10-8 mol/L胰島素聯(lián)合可致人肝癌細(xì)胞HepG2產(chǎn)生胰島素抵抗,提示砷可能具有加速或促進(jìn)胰島素抵抗形成的作用?;诖耍狙芯恳驭?硫辛酸為受試藥物,基于PI3K/Akt信號(hào)通路探討該成分對(duì)亞砷酸鈉聯(lián)合胰島素所致胰島素抵抗HepG2細(xì)胞糖代謝紊亂的改善作用,旨在為砷暴露下糖尿病治療藥物的研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

        1 材料

        1.1 主要儀器

        本研究所用主要儀器包括2001HY-6003型CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)、SW-CJ-2D型超凈工作臺(tái)(浙江蘇凈凈化設(shè)備有限公司)、IX71型倒置顯微鏡(日本Hitachi公司)、Elx800 UV型酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek公司)、722SP型可見分光光度計(jì)(上海棱光技術(shù)有限公司)、Universal HoodⅡ型凝膠成像分析儀(美國(guó)Bio-Rad公司)、WD-9405D型水平搖床和DYCZ-24DN型電泳儀(北京市六一儀器廠)、Allegray 64R Centrifuge型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Beckman Coulter公司)等。

        1.2 主要藥品與試劑

        亞砷酸鈉對(duì)照品(批號(hào)H4525,純度97%)購(gòu)自山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司;胰島素對(duì)照品(批號(hào)J1001A,純度96.8%)購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司;α-硫辛酸對(duì)照品(批號(hào)1077287,純度>99%)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;DMEM高糖培養(yǎng)基(批號(hào)8121089)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;1%青霉素-鏈霉素雙抗(批號(hào)J190005)購(gòu)自美國(guó)HyClone公司;胎牛血清(批號(hào)19070506)購(gòu)自浙江天杭生物科技股份有限公司;葡萄糖測(cè)定試劑盒(批號(hào)20200902137)購(gòu)自上海榮盛生物藥業(yè)有限公司;二甲基亞砜(DMSO)、MTT、糖原含量試劑盒、己糖激酶試劑盒、丙酮酸激酶試劑盒、RIPA細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)制備試劑盒(批號(hào)分別為12130234、1117X054、20200903、20201211、20201112、20200916、20201030、20201116)均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;兔抗磷酸化Akt(p-Akt,Ser473位點(diǎn))、Akt單克隆抗體(批號(hào)分別為P31749、4691S)均購(gòu)自美國(guó)CST公司;兔抗GLUT4、磷酸化GSK3β(p-GSK3β,Ser9位點(diǎn))、GSK3β、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體和辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)二抗(批號(hào)分別為NQ30、10016184、00083124、00047696、116154)均購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司;快速封閉液、化學(xué)發(fā)光試劑盒(批號(hào)分別為P0252、123119200731)均購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司;其余試劑均為分析純,水為超純水。

        1.3 細(xì)胞

        人肝癌細(xì)胞HepG2購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

        2 方法

        2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

        HepG2細(xì)胞復(fù)蘇后,接種在含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基中,置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(培養(yǎng)條件下同)。

        2.2 α-硫辛酸的細(xì)胞毒性檢測(cè)

        采用MTT法進(jìn)行檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞,以6×103個(gè)/孔接種于96孔板中,培養(yǎng)24 h;棄去培養(yǎng)基,加入α-硫辛酸終濃度分別為25、50、100、200、500、1 000 ?mol/L的普通培養(yǎng)基(無(wú)血清,下同)200 ?L,記為α-硫辛酸組;另設(shè)不含藥物的陰性對(duì)照組和不含細(xì)胞、不含藥物的調(diào)零組,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)12 h后,每孔加入5 mg/mL的MTT試劑20 ?L,培養(yǎng)4 h后,棄去板中液體,加入DMSO 150 ?L,避光振蕩10 min,使用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的光密度(OD)值,并計(jì)算各組的細(xì)胞存活率:細(xì)胞存活率(%)=(OD實(shí)驗(yàn)組-OD調(diào)零組)/(OD陰性對(duì)照組-OD調(diào)零組)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

        2.3 分組與給藥

        以HepG2細(xì)胞為研究對(duì)象,建立胰島素抵抗模型。實(shí)驗(yàn)設(shè)陰性對(duì)照組(只有細(xì)胞、不含藥物)、胰島素抵抗組(1×10-7 mol/L胰島素,濃度參考文獻(xiàn)[12]和前期研究結(jié)果設(shè)置)、聯(lián)合抵抗組(30 ?mol/L亞砷酸鈉+1×10-8 mol/L胰島素,濃度參考前期研究結(jié)果設(shè)置)和α-硫辛酸低、中、高濃度組(25、50、100 ?mol/L,濃度參考α-硫辛酸細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞適量,按照各實(shí)驗(yàn)所需的密度接種于96孔板、6孔板或者細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,培養(yǎng)24 h;棄去培養(yǎng)基,α-硫辛酸各濃度組加入相應(yīng)濃度的含藥普通培養(yǎng)基,其他組加入等體積的普通培養(yǎng)基,培養(yǎng)12 h;棄去培養(yǎng)基,聯(lián)合抵抗組和α-硫辛酸各濃度組加入含有30 ?mol/L 亞砷酸鈉和1×10-8 mol/L 胰島素的普通培養(yǎng)基,胰島素抵抗組加入含有1×10-7 mol/L胰島素的普通培養(yǎng)基,陰性對(duì)照組加入等體積的普通培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

        2.4 細(xì)胞葡萄糖消耗量和細(xì)胞毒性檢測(cè)

        采用葡萄糖氧化酶法和MTT法分別進(jìn)行檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞,以6×103個(gè)/孔接種于96孔板中,按照“2.3”項(xiàng)下方法分組、給藥、培養(yǎng),另增設(shè)不含藥物、不含細(xì)胞的空白對(duì)照組和1×10-8 mol/L胰島素組,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。每孔取培養(yǎng)基上清液2 ?L與葡萄糖測(cè)定試劑盒中反應(yīng)試劑進(jìn)行反應(yīng),嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。反應(yīng)完成后,使用酶標(biāo)儀在505 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的OD值,并計(jì)算各組細(xì)胞葡萄糖消耗量:葡萄糖含量(mmol/L)=(各組OD值/校準(zhǔn)液OD值)×校準(zhǔn)液濃度,葡萄糖消耗量(mmol/L)=空白對(duì)照組細(xì)胞上清液中葡萄糖含量-各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞上清液中葡萄糖含量。葡萄糖消耗量檢測(cè)結(jié)束后,再按“2.2”項(xiàng)下MTT法進(jìn)行檢測(cè)并計(jì)算每組細(xì)胞存活率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

        2.5 細(xì)胞己糖激酶、丙酮酸激酶活性檢測(cè)

        采用比色法進(jìn)行檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞,以5×106個(gè)/瓶接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,按照“2.3”項(xiàng)下方法分組、給藥、培養(yǎng),每組設(shè)3個(gè)培養(yǎng)瓶。每組分別收集500萬(wàn)細(xì)胞,加入己糖激酶、丙酮酸激酶提取液各1 mL,裂解細(xì)胞后,于4 ℃下以8 000×g離心10 min,取上清液30 ?L,與己糖激酶、丙酮酸激酶試劑盒中的反應(yīng)試劑進(jìn)行反應(yīng),嚴(yán)格按相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。在上清液與己糖激酶反應(yīng)試劑反應(yīng)20 s、5 min 20 s時(shí)利用可見分光光度計(jì)在340 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各組的吸光度(A20 s、A5 min 20 s)值,并計(jì)算各組細(xì)胞的己糖激酶活性:己糖激酶(U/104 cell)=2.226×(A5 min 20 s-A20 s);在上清液與丙酮酸激酶反應(yīng)試劑反應(yīng)20 s、2 min 20 s時(shí)利用可見分光光度計(jì)在340 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各組的A20 s、A2 min 20 s值,并計(jì)算各組細(xì)胞的丙酮酸激酶活性:丙酮酸激酶(U/104 cell)=5.226×(A20 s-A2 min 20 s)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

        2.6 細(xì)胞糖原含量檢測(cè)

        采用蒽酮法進(jìn)行檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞,以5×106個(gè)/瓶接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,按照“2.3”項(xiàng)下方法分組、給藥、培養(yǎng),每組設(shè)3個(gè)培養(yǎng)瓶。每組分別收集500萬(wàn)細(xì)胞,加入糖原提取液750 ?L,裂解細(xì)胞后,于25 ℃下以8 000×g離心10 min,取上清液,備用。同時(shí),增設(shè)空白組(水)、標(biāo)準(zhǔn)組(0.1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液)。每組取上清液60 ?L,與糖原含量試劑盒中的反應(yīng)試劑進(jìn)行反應(yīng),嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。反應(yīng)完成后,使用酶標(biāo)儀在620 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各組的A值,并計(jì)算各組細(xì)胞的糖原含量:糖原含量(?g/104 cell)=0.450×(A實(shí)驗(yàn)組-A空白組)/(A標(biāo)準(zhǔn)組-A空白組)/細(xì)胞數(shù)量×1 000。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

        2.7 細(xì)胞中p-Akt、Akt、GLUT4、p-GSK3β、GSK3β蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

        采用Western blot法進(jìn)行檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞,以6×105個(gè)/孔接種于6孔板中,按照“2.3”項(xiàng)下方法分組、給藥、培養(yǎng),每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。每組棄去上清液,裂解細(xì)胞后,于4 ℃下以15 294×g離心10 min,取上清液,采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞的蛋白濃度。蛋白于100 ℃煮沸變性5 min。取變性蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE分離,轉(zhuǎn)膜,經(jīng)快速封閉液室溫封閉30 min后,加入p-Akt、Akt、GLUT4、p-GSK3β、GSK3β單克隆抗體(稀釋比例均為1 ∶ 1 000)和GAPDH單克隆抗體(稀釋比例為1 ∶ 5 000),于4 ℃孵育過(guò)夜;用TBST溶液洗膜10 min×3次,加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(稀釋比例為1 ∶ 5 000),室溫孵育1.5 h;用TBST溶液洗膜10 min×3次,經(jīng)化學(xué)發(fā)光液顯色后,使用凝膠成像分析儀曝光成像。采用Image Lab 5.2.1軟件對(duì)目的條帶進(jìn)行灰度值分析,計(jì)算目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平和磷酸化水平:目的蛋白的表達(dá)水平=目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值,目的蛋白的磷酸化水平=磷酸化目的蛋白灰度值/總目的蛋白灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

        2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以x±s表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢測(cè)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

        3 結(jié)果

        3.1 α-硫辛酸對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響

        與陰性對(duì)照組比較,α-硫辛酸25、50、100 ?mol/L組細(xì)胞的存活率均無(wú)顯著變化(P>0.05),而α-硫辛酸500、1 000 ?mol/L組細(xì)胞的存活率均顯著降低(P<0.05),詳見表1。因此,后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇25、50、100 ?mol/L作為α-硫辛酸的低、中、高濃度。

        3.2 α-硫辛酸對(duì)HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量和存活率的影響

        與陰性對(duì)照組比較,胰島素抵抗組、聯(lián)合抵抗組細(xì)胞的葡萄糖消耗量均顯著降低(P<0.05),而其余各組細(xì)胞的存活率均無(wú)顯著變化(P>0.05)。與聯(lián)合抵抗組比較,α-硫辛酸中、高濃度組細(xì)胞的葡萄糖消耗量均顯著升高(P<0.05),但兩者組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),詳見表2。

        3.3 α-硫辛酸對(duì)HepG2細(xì)胞己糖激酶、丙酮酸激酶活性的影響

        與陰性對(duì)照組比較,胰島素抵抗組、聯(lián)合抵抗組細(xì)胞的己糖激酶、丙酮酸激酶活性均顯著降低(P<0.05)。與聯(lián)合抵抗組比較,α-硫辛酸高濃度組細(xì)胞的己糖激酶、丙酮酸激酶活性均顯著升高(P<0.05),詳見表3。

        3.4 α-硫辛酸對(duì)HepG2細(xì)胞糖原含量的影響

        與陰性對(duì)照組比較,胰島素抵抗組、聯(lián)合抵抗組細(xì)胞的糖原含量均顯著降低(P<0.05)。與聯(lián)合抵抗組比較,α-硫辛酸低、中、高濃度組細(xì)胞的糖原含量均顯著升高(P<0.05)。與α-硫辛酸低、中濃度組比較,α-硫辛酸高濃度組細(xì)胞的糖原含量均顯著升高(P<0.05),詳見表4。

        3.5 α-硫辛酸對(duì)HepG2細(xì)胞中p-Akt、Akt、GLUT4、p-GSK3β、GSK3β蛋白表達(dá)水平的影響

        與陰性對(duì)照組比較,胰島素抵抗組、聯(lián)合抵抗組細(xì)胞中GLUT4、p-GSK3β蛋白表達(dá)水平和p-Akt/Akt、p-GSK3β/GSK3β比值均顯著降低,GSK3β蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)。與聯(lián)合抵抗組比較,α-硫辛酸各濃度組細(xì)胞中GLUT4(α-硫辛酸低濃度組除外)、p-GSK3β蛋白表達(dá)水平和p-Akt/Akt(α-硫辛酸低、中濃度組除外)、p-GSK3β/GSK3β(α-硫辛酸低濃度組除外)比值均顯著升高,GSK3β(α-硫辛酸低、中濃度組除外)蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)。與α-硫辛酸低濃度組比較,α-硫辛酸中、高濃度組細(xì)胞中p-GSK3β蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)。與α-硫辛酸中濃度組比較,α-硫辛酸高濃度組細(xì)胞中GLUT4蛋白表達(dá)水平和p-GSK3β/GSK3β比值均顯著升高(P<0.05),詳見圖1、表5。

        4 討論

        2型糖尿病主要表現(xiàn)為胰島B細(xì)胞分泌胰島素不足或外周組織(例如肝、脂肪、骨骼?。┌l(fā)生胰島素抵抗[13]。HepG2細(xì)胞是人肝癌細(xì)胞,其保留了大部分肝細(xì)胞生物學(xué)特征和代謝特點(diǎn),是用于研究胰島素抵抗發(fā)生機(jī)制和降糖藥物作用機(jī)制的理想模型[14]。

        本研究以α-硫辛酸作為受試藥物,探討其對(duì)亞砷酸鈉聯(lián)合胰島素所致胰島素抵抗HepG2細(xì)胞糖代謝紊亂的改善作用。首先,本研究通過(guò)MTT法檢測(cè)了α-硫辛酸對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性,結(jié)果發(fā)現(xiàn),25、50、100 ?mol/L的α-硫辛酸對(duì)HepG2細(xì)胞的存活率均無(wú)明顯影響,且細(xì)胞的存活率均在96%以上,因此選擇25、50、100 ?mol/L作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中α-硫辛酸的低、中、高濃度。

        已有研究表明,胰島素抵抗時(shí)外周組織對(duì)葡萄糖的消耗量減少,造成機(jī)體血糖升高[15]。本研究通過(guò)測(cè)定葡萄糖消耗量發(fā)現(xiàn),與陰性對(duì)照組比較,聯(lián)合抵抗組細(xì)胞葡萄糖消耗量顯著降低,而α-硫辛酸中、高濃度組細(xì)胞葡萄糖消耗量均顯著高于聯(lián)合抵抗組,由此說(shuō)明α-硫辛酸可在一定程度上改善亞砷酸鈉聯(lián)合胰島素所致的HepG2細(xì)胞胰島素抵抗。

        肝是葡萄糖代謝的主要場(chǎng)所之一,其可通過(guò)調(diào)控糖酵解、糖原合成來(lái)維持機(jī)體的血糖平衡[16]。己糖激酶是糖酵解途徑中控制葡萄糖代謝速率的首個(gè)關(guān)鍵酶,丙酮酸激酶是糖酵解過(guò)程中催化磷酸烯醇丙酮酸和腺苷二磷酸轉(zhuǎn)變成丙酮酸和腺苷三磷酸的磷酸基轉(zhuǎn)移酶,兩者都是糖酵解過(guò)程中重要的限速酶[17-18]。當(dāng)肝細(xì)胞內(nèi)己糖激酶和丙酮酸激酶活性下降時(shí),會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞對(duì)葡萄糖的利用減少,糖原合成降低,從而引發(fā)肝臟胰島素抵抗[19]。本研究通過(guò)檢測(cè)糖代謝相關(guān)酶活性及糖原含量發(fā)現(xiàn),與陰性對(duì)照組比較,聯(lián)合抵抗組細(xì)胞的己糖激酶、丙酮酸激酶活性和糖原含量均顯著降低,提示細(xì)胞糖代謝發(fā)生了紊亂;而α-硫辛酸高濃度組細(xì)胞的己糖激酶、丙酮酸激酶活性和α-硫辛酸各濃度組細(xì)胞的糖原含量均顯著高于聯(lián)合抵抗組,且高濃度組細(xì)胞的糖原含量顯著高于α-硫辛酸低、中濃度組。這說(shuō)明α-硫辛酸可通過(guò)提高糖代謝相關(guān)酶活性和糖原含量來(lái)改善亞砷酸鈉聯(lián)合胰島素所致的HepG2細(xì)胞胰島素抵抗。

        Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,Ser473位點(diǎn)的磷酸化是Akt活化的主要標(biāo)志[20]。當(dāng)肝細(xì)胞受到胰島素刺激時(shí),Akt蛋白磷酸化被激活,激活的Akt參與調(diào)控細(xì)胞的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和糖原合成[21]。GLUT4是糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白之一,p-Akt可使GLUT4發(fā)生易位,讓GLUT4從細(xì)胞囊泡中轉(zhuǎn)移并嵌入至細(xì)胞膜上,從而把葡萄糖從細(xì)胞外轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)[22]。GLUT4是維系機(jī)體血糖平衡的關(guān)鍵因子,故是抗糖尿病的靶點(diǎn)之一[23]。此外,p-Akt可使GSK3β的Ser9位點(diǎn)發(fā)生磷酸化,抑制GSK3β蛋白表達(dá),激活細(xì)胞的糖原合成[24]。GSK3β可通過(guò)磷酸化失活來(lái)促進(jìn)糖原合成,進(jìn)一步增加細(xì)胞對(duì)葡萄糖的利用率,從而達(dá)到降血糖的目的,故近年來(lái)GSK3β被作為治療糖尿病的新靶點(diǎn)之一[25]。本研究通過(guò)Western blot法檢測(cè)糖代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn),與陰性對(duì)照組比較,聯(lián)合抵抗組細(xì)胞中GLUT4、p-GSK3β蛋白表達(dá)水平和p-Akt/Akt、p-GSK3β/GSK3β比值均顯著降低,GSK3β蛋白表達(dá)水平顯著升高。這提示亞砷酸鈉聯(lián)合胰島素可降低GLUT4蛋白表達(dá),造成葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的障礙,同時(shí)下調(diào)GSK3β蛋白磷酸化水平,造成糖原合成的異常,從而降低細(xì)胞對(duì)葡萄糖的利用率,導(dǎo)致糖代謝紊亂的發(fā)生。與聯(lián)合抵抗組比較,α-硫辛酸各濃度組細(xì)胞GLUT4(α-硫辛酸低濃度組除外)、p-GSK3β蛋白表達(dá)水平和p-Akt/Akt(α-硫辛酸中、低濃度組除外)、p-GSK3β/GSK3β(α-硫辛酸低濃度組除外)比值均顯著升高,GSK3β(α-硫辛酸中、低濃度組除外)蛋白表達(dá)水平顯著降低。這提示α-硫辛酸可通過(guò)增加GLUT4蛋白表達(dá)來(lái)改善葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)障礙,同時(shí)通過(guò)上調(diào)GSK3β蛋白磷酸化水平、抑制GSK3β蛋白表達(dá)來(lái)改善細(xì)胞糖原合成的異常,從而增加細(xì)胞對(duì)葡萄糖的利用率,改善亞砷酸鈉聯(lián)合胰島素所致胰島素抵抗HepG2細(xì)胞的糖代謝紊亂。

        綜上所述,α-硫辛酸對(duì)亞砷酸鈉聯(lián)合胰島素所致胰島素抵抗HepG2細(xì)胞的糖代謝紊亂具有一定的改善作用,其機(jī)制可能與增加葡萄糖消耗,增強(qiáng)糖代謝相關(guān)酶活性,提高糖原含量,上調(diào)Akt、GSK3β蛋白的磷酸化水平和GLUT4、p-GSK3β蛋白的表達(dá)水平,下調(diào)GSK3β蛋白的表達(dá)水平有關(guān)。本研究結(jié)果為砷暴露下糖尿病治療藥物的研發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),但糖代謝過(guò)程還受諸多因素調(diào)控,砷對(duì)糖代謝的影響有待進(jìn)一步的深入研究加以證實(shí)。

        參考文獻(xiàn)

        [ 1 ] KUO C C,MOON K A,WANG S L,et al. The association of arsenic metabolism with cancer,cardiovascular di- sease,and diabetes:a systematic review of the epidemiological evidence[J]. Environ Health Perspect,2017,125(8):087001.

        [ 2 ] TSENG C H,TSENG C P,CHIOU H Y,et al. Epidemiologic evidence of diabetogenic effect of arsenic[J]. Toxicol Lett,2002,133(1):69-76.

        [ 3 ] RAHMAN M,TONDEL M,AHMAD S A,et al. Diabetes mellitus associated with arsenic exposure in Bangladesh[J]. Am J Epidemiol,1998,148(2):198-203.

        [ 4 ] CORONADO-GONZALEZ J A,DEL RAZO L M, GARCIA-VARGAS G,et al. Inorganic arsenic exposure and type 2 diabetes mellitus in Mexico[J]. Environ Res,2007,104(3):383-389.

        [ 5 ] HUANG C F,CHEN Y W,YANG C Y,et al. Arsenic and diabetes:current perspectives[J]. Kaohsiung J Med Sci,2011,27(9):402-410.

        [ 6 ] GOSSELIN L E,CHRAPOWITZKY L,RIDEOUT T C,et al. Matebolic effects of α-lipoic acid supplementation in pre-diabetics:a randomized,placebo-controlled pilot study

        [J]. Food Funct,2019,10(9):5732-5738.

        [ 7 ] 程明瑜. α-硫辛酸治療糖尿病周圍神經(jīng)病變患者的臨床觀察[J].大家健康旬刊,2016,10(4):150-151.

        [ 8 ] 趙慧娟,趙令君,孫海峰. α-硫辛酸聯(lián)合甲鈷胺治療老年糖尿病周圍神經(jīng)病變的臨床療效[J].中國(guó)老年學(xué)雜志,2017,37(6):1359-1360.

        [ 9 ] GHOSH S,MISHRA R,BISWAS S,et al. α-lipoic acid mitigates arsenic-induced hematological abnorm-alities in adult male rats[J]. Iran J Med Sci,2017,42(3):242-250.

        [10] GALICIA-GARCIA U,BENITO-VICENTE A,JEBAR S,et al. Pathophysiology of type 2 diabetes mellitus[J]. Int J Mol Sci,2020,21(17):6275.

        [11] LUO W,AI L,WANG B F,et al. High glucose inhibits myogenesis and induces insulin resistance by down-regulating Akt signaling[J]. Biomed Pharmacother,2019,120:109498.

        [12] 羅明,梁冰,陳文章,等.樹豆酮酸A對(duì)HepG2細(xì)胞體外糖代謝影響[J].中國(guó)公共衛(wèi)生,2016,32(7):928-930.

        [13] LAAKSO M. Biomarkers for type 2 diabetes[J]. Mol Metab,2019,27(Suppl):S139-S146.

        [14] 黎梓霖,金惠杰,方佳,等.芒果苷對(duì)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞糖脂代謝的影響[J].中國(guó)藥房,2021,32(9):1082-1088.

        [15] GHASEMI A,NOROUZIRAD R. Type 2 diabetes:an updated overview[J]. Crit Rev Oncog,2019,24(3):213-222.

        [16] SHI H,YAO R,LIAN S,et al. Regulating glycolysis,the TLR4 signal pathway and expression of RBM3 in mouse liver in response to acute cold exposure[J]. Stress,2019,22(3):366-376.

        [17] OYEDEMI S O,NWAOGU G,CHUKWUMA C I,et al.Quercetin modulates hyperglycemia by improving the pancreatic antioxidant status and enzymes activities linked with glucose metabolism in type 2 diabetes model of rats:in silico studies of molecular interaction of quercetin with hexokinase and catalase[J]. J Food Biochem,2020,44(2):e13127.

        [18] LEWANDOWSKI S L,CARDONE R L,F(xiàn)OSTER H R,et al. Pyruvate kinase controls signal strength in the insulin secretory pathway[J]. Cell Metab,2020,32(5):736- 750.

        [19] CAO C,LI C,CHEN Q,et al. Physicochemical characte- rization,potential antioxidant and hypoglycemic activity of polysaccharide from Sargassum pallidum[J]. Int J Biol Macromol,2019,139:1009-1017.

        [20] WEI Y,ZHOU J,YU H,et al. Akt phosphorylation sites of Ser473 and Thr308 regulate Akt degradation[J]. Biosci Biotechnol Biochem,2019,83(3):429-435.

        [21] 宋紫臨,吳麗麗,秦靈靈,等. PI3K/Akt信號(hào)通路與糖尿病的研究進(jìn)展[J].世界科學(xué)技術(shù):中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2019,21(6):1264-1269.

        [22] FLORES-OPAZO M,BOLAND E,GARNHAM A,et al. Exercise and GLUT4 in human subcutaneous adiposetissue[J]. Physiological Report,2018,6(22):e13918.

        [23] 吳寧,黃密,黃蘊(yùn),等.基于GLUT4靶點(diǎn)的抗糖尿病中藥研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥師,2018,21(12):2201-2205.

        [24] BEUREL E,GRIECO S F,JOPE R S. Glycogen synthase kinase-3(GSK3):regulation,actions,and diseases [J].Pharmacol Ther,2015,148:114-131.

        [25] 吳建軍,王順春.抑制2型糖尿病新靶點(diǎn)-糖原合成酶激酶3及其抑制劑的研究進(jìn)展[J].中國(guó)糖尿病雜志,2018,26(10):864-870.

        (收稿日期:2021-03-04 修回日期:2021-06-07)

        (編輯:鄒麗娟)

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