梁潔 陳輝華 楊川川 曹玉嬪 陳俊 李耀華 陳曉思 柳賢福

中圖分類號 R285;R284.1 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）14-1721-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.14.10

摘 要 目的：考察不同產地壯藥三七姜乙酸乙酯提取物抗炎、鎮(zhèn)痛作用的譜-效關系。方法：以不同產地的10批三七姜為樣品，分別以二甲苯致小鼠耳廓腫脹、乙酸致小鼠扭體反應實驗考察其乙酸乙酯提取物的抗炎、鎮(zhèn)痛活性。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》建立10批三七姜乙酸乙酯提取物的高效液相色譜指紋圖譜并進行相似度評價，通過與對照品比對進行共有峰的指認?；赑earson相關系數法（以小鼠耳腫脹度和15 min內扭體次數為藥效指標）和灰色關聯(lián)分析法（以耳腫脹抑制率和鎮(zhèn)痛率為藥效指標）分析三七姜乙酸乙酯提取物抗炎、鎮(zhèn)痛的譜-效關系。結果：10批不同產地三七姜乙酸乙酯提取物均具有較好的抗炎、鎮(zhèn)痛作用，其對小鼠的耳腫脹抑制率為46.43%～55.16%，對小鼠的鎮(zhèn)痛率為45.56%～52.72%。10批樣品共確定了18個共有峰，其與對照指紋圖譜的相似度為0.994～0.997。通過與對照品比對，指認出了峰1、2、4分別為原兒茶酸、對羥基苯甲酸、對羥基苯甲醛。Pearson相關性分析結果顯示，峰10、18與小鼠耳腫脹度和15 min內扭體次數均呈顯著負相關（r分別為-0.853、? ?-0.738，P分別為0.002、0.015）;灰色關聯(lián)分析結果顯示，18個共有峰與耳腫脹抑制率和鎮(zhèn)痛率的關聯(lián)度均在0.65以上，其中峰14、1（原兒茶酸）、17、9、4（對羥基苯甲醛）、2（對羥基苯甲酸）、16、7、6與耳腫脹抑制率的關聯(lián)度相對較高（關聯(lián)度均高于0.7），峰1（原兒茶酸）、17、14、9、16、2（對羥基苯甲酸）、4（對羥基苯甲醛）與鎮(zhèn)痛率的關聯(lián)度相對較高（關聯(lián)度均高于0.7）。結論：三七姜乙酸乙酯提取物具有較好的抗炎、鎮(zhèn)痛作用，峰1（原兒茶酸）、2（對羥基苯甲酸）、10、14、17、18等可能是其主要活性成分。

關鍵詞 三七姜;乙酸乙酯提取物;抗炎;鎮(zhèn)痛;譜-效關系;Pearson相關性分析;灰色關聯(lián)分析

Study on Spectrum-effect Relationship of Anti-inflammatory and Analgesic Effects of Ethyl Acetate Extract from Zhuang Medicine Stahlianthus involucratus

LIANG Jie1，2，3，CHEN Huihua1，YANG Chuanchuan1，CAO Yupin1，CHEN Jun1，LI Yaohua1，CHEN Xiaosi1，LIU Xianfu4（1. School of Pharmacy， Guangxi University of TCM， Nanning 530200， China; 2. Guangxi Zhuang Yao Medicine Center of Engineering and Technology， Nanning 530200， China; 3. Guangxi Superior Chinese Patent Medicine and National Medicine Development Engineering Technology Center， Nanning 530200， China; 4. College of Pharmacy Science， Guangxi University of TCM， Nanning 530222， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To investigate the spectrum-effect relationship of analgesic and anti-inflammatory effects of ethyl acetate extract from Zhuang medicine Stahlianthus involucratus from different habitats. METHODS： Ten batches of S. involucratus from different habitats were used as samples to investigate the anti-inflammatory and analgesic activities of ethyl acetate extracts by xylene induced ear swelling test and acetic acid induced writhing test in mice. HPLC fingerprints of 10 batches of ethyl acetate extract from S. involucratus were established and their similarity was evaluated by using Similarity Evaluation System of TCM Chromatogram Fingerprint （2012 edition）， and the common peaks were identified by comparison with the control. The spectrum-effect relationship of anti-inflammatory and analgesic effects of ethyl acetate extract from S. involucratus were analyzed on the basis of Pearson correlation coefficient （auricle swelling degree and writhing times in 15 min as pharmacodynamic indexes） and Grey relational analysis （inhibition rate of ear swelling and analgesic rate as pharmacodynamic indexes）. RESULTS： Ten batches of ethyl acetate extract from S. involucratus had obvious anti-inflammatory and analgesic effects; inhibition rates of ear swelling in mice were 46.43%-55.16%， and the analgesic rates of mice were 45.56%-52.72%. A total of 18 common peaks were identified in 10 batches of samples， and the similarity between them and the control fingerprint was 0.994-0.997. Compared with substance control， the peaks 1， 2 and 4 were identified as protocatechuic acid， p-hydroxy- benzoic acid and p-hydroxybenzaldehyde， respectively. Results of Pearson correlation analysis showed that peak 10 and peak 18 were significantly negative correlated with auricle swelling degree and writhing times in 15 min （r were values -0.853， -0.738，P values were 0.002， 0.015， respectively）. Results of Gray correlation degree analysis showed that the correlation degree of 18 common peaks with inhibition rate of ear swelling and analgesic rate were all greater than 0.65; among them， peaks 14， 1 （protocatechuic acid）， 17， 9， 4 （p-hydroxybenzaldehyde）， 2 （p-hydroxybenzoic acid）， 16， 7 and 6 showed the relatively high correlation degree （correlation degree >0.7）; peak 1 （protocatechuic acid）， 17， 14， 9， 16， 2 （p-hydroxybenzoic acid） and 4 （p-hydroxybenzaldehyde） showed the relatively high correlation degree （correlation degree >0.7）. CONCLUSIONS： The ethyl acetate extract of S. involucratus show good anti-inflammatory and analgesic effects. Peak 1 （protocatechuic acid）， 2 （p-hydroxybenzoic acid）， 10， 14， 17， 18 may be its main active ingredients.

KEYWORDS? ?Stahlianthus involucratus; Ethyl acetate extract; Anti-inflammatory; Analgesic; Spectrum-effect relationship; Pearson correlation analysis; Gray correlation analysis

三七姜為姜科Zingiberaeeae姜七屬植物土田七Stahlianthus involucratus（King ex Bak.）Craib.的塊根和根莖，又稱土田七、小田七、竹田七、毛七、姜三七、姜田七等，其性溫，味辛，具有散瘀、止痛、止血等功效，主治跌打損傷、風濕骨痛等[1]。三七姜為廣西民間傳統(tǒng)壯藥，現(xiàn)收載于《廣西壯族自治區(qū)壯藥質量標準（第二卷）》[2]，主要分布于我國廣西、云南、廣東、福建等省區(qū)[3]?，F(xiàn)代研究表明，三七姜中含有黃酮類、皂苷類、酚類、蒽醌類、三萜類、糖類等多種化學成分[4]，具有抗腫瘤、抗炎等藥理作用[5-6]。民間常將三七姜根莖作為野生草藥使用，并發(fā)現(xiàn)其對風濕性骨關節(jié)疼痛癥狀有一定療效，可用于治療風濕骨痛、吐血衄血、月經過多等;且還可炒炭研粉后撒于患處以散瘀消腫、活血止血、行氣止痛，用于治療跌打損傷、蟲咬蛇傷、外傷出血等[1]。

本課題組前期對三七姜不同溶劑提取物的抗炎、鎮(zhèn)痛作用進行了研究，發(fā)現(xiàn)其乙酸乙酯提取物具有顯著的抗炎、鎮(zhèn)痛作用。目前，譜效學已被學者廣泛應用于中藥的活性成分和藥理作用關系的研究中，其可通過數理統(tǒng)計方法，快捷地篩選出中藥的活性成分，從而分析其藥理活性的物質基礎[7]。基于此，本研究分別以二甲苯致小鼠耳廓腫脹、乙酸致小鼠扭體反應作為炎癥和疼痛模型，考察三七姜乙酸乙酯提取物的抗炎、鎮(zhèn)痛藥效;并建立不同產地三七姜乙酸乙酯提取物的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，然后通過Pearson相關系數法和灰色關聯(lián)分析法將抗炎、鎮(zhèn)痛藥效與指紋圖譜進行關聯(lián)，旨在初步探討三七姜抗炎、鎮(zhèn)痛作用的藥效物質基礎，為進一步開發(fā)壯藥三七姜提供科學依據。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括1100型HPLC儀（美國Agilent公司）、CPA225D型電子天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]、KQ5200B型超聲波清洗器（昆山市超聲波儀器有限公司）、UPC-Ⅱ-10T型實驗室超純水器（四川優(yōu)普超純科技有限公司）、HH-S型恒溫水浴鍋（江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠）、TGL-16G型離心機（上海安亭科學儀器廠）等。

1.2 主要藥品與試劑

10批三七姜藥材均由本課題組自行采摘，所有藥材經廣西中醫(yī)藥大學滕建北教授鑒定均為姜科植物土田七S. involucratus（King ex Bak.）Craib.的塊根和根莖，其具體來源信息見表1。復方醋酸地塞米松乳膏（批號1812012S，規(guī)格20 g ∶ 15 mg）購自華潤三九醫(yī)藥股份有限公司;雙氯芬酸二乙胺乳膠劑[批號VP2181，規(guī)格20 g ∶ 0.2 g（以C14H10Cl2NNaO2計）]購自北京諾華制藥有限公司;原兒茶酸對照品（批號RP190605，純度≥98%）、對羥基苯甲酸對照品（批號RP190609，純度≥98%）、對羥基苯甲醛對照品（批號RP180913，純度≥98%）均購自成都麥德生科技有限公司;二甲苯（批號20181022）購自天津市富宇精細化工有限公司;冰乙酸（批號181227）購自成都市科隆化學品有限公司;甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 實驗動物

實驗所用動物為健康SPF級KM小鼠，共240只，雄性，體質量為18～22 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物生產許可證號為SCXK（湘）2016-0002。所有小鼠購入后均飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學實驗動物中心，飼養(yǎng)期間均自由攝食、飲水。實驗方案經廣西中醫(yī)藥大學倫理委員會批準，實驗過程嚴格遵守《廣西中醫(yī)藥大學實驗動物管理條例》。所有小鼠均適應性喂養(yǎng)7 d后進行后續(xù)實驗。

2 方法與結果

2.1 三七姜乙酸乙酯提取物的制備

稱取不同產地三七姜粗粉適量，加入8倍量（mL/mg）的80%乙醇，加熱回流提取3次，每次2 h，分別濾過并合并3次濾液，減壓濃縮至無醇味，得到三七姜80%乙醇總提物。將總提物用水分散后，依次用石油醚、乙酸乙酯各萃取3次，分別合并萃取液，回收乙酸乙酯部位萃取溶劑，蒸干，即得到不同產地三七姜藥材的乙酸乙酯提取物（得率約為1.23%）。將所得提取物密封后置于4 ℃冰箱中保存，備用。

2.2 不同產地三七姜乙酸乙酯提取物的抗炎、鎮(zhèn)痛作用2.2.1 藥液的制備 臨用前，將“2.1”項下10批不同產地三七姜乙酸乙酯提取物分別用水配成質量濃度均為1.5 g/mL（按生藥量計）的混懸液，備用。

2.2.2 三七姜乙酸乙酯提取物的抗炎作用研究 將120只小鼠隨機分為空白對照組、復方醋酸地塞米松乳膏組（陽性對照，0.06 g/耳，劑量參考本課題組前期預實驗結果設置）和10批不同產地三七姜乙酸乙酯提取物組（0.075 g/耳，以生藥量計，劑量參考本課題組前期預實驗結果設置），每組10只，均按組別分籠飼養(yǎng)。各給藥組小鼠分別于右耳正反兩面涂抹相應藥液50 μL，空白對照組小鼠同法涂抹生理鹽水50 μL，每10 min涂抹1次，連續(xù)涂藥1 h，共涂藥6次。末次涂藥結束10 min后，用生理鹽水擦凈右耳后再用干藥棉擦干。10 min后，除空白對照組外的其余各組小鼠均于右耳涂抹二甲苯20 μL致炎，分別于致炎后10 min和2 h，再次于右耳涂抹等量二甲苯1次。于再次涂抹二甲苯4 h后，處死小鼠（處死前用生理鹽水擦凈右耳并用干藥棉擦干），剪下雙耳，對齊，用6 mm打孔器取下圓形耳片，稱定上述圓形耳片的質量。根據以下公式計算耳腫脹度和耳腫脹抑制率：耳腫脹度（mg）=致炎耳耳片質量（mg）-正常耳耳片質量（mg）;耳腫脹抑制率（%）=（空白對照組平均耳腫脹度-給藥組平均耳腫脹度）/空白對照組平均耳腫脹度×100%。采用SPSS 23.0軟件對數據進行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的計量資料用x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準α=0.05。各組小鼠耳腫脹度和耳腫脹抑制率的測定結果見表2。

由表2可見，與空白對照組比較，復方醋酸地塞米松軟膏組和10批不同產地三七姜乙酸乙酯提取物組小鼠的耳腫脹度均顯著降低（P<0.01）。10批不同產地三七姜乙酸乙酯提取物對小鼠的耳腫脹抑制率為46.43%～55.16%，說明各樣品均有較好的抗炎作用。

2.2.3 三七姜乙酸乙酯提取物的鎮(zhèn)痛作用研究 將120只小鼠隨機分為空白對照組、雙氯芬酸二乙胺乳膠劑組（陽性對照，0.3 g/只，劑量參考本課題組前期預實驗結果設置）和10批不同產地三七姜乙酸乙酯提取物組（0.45 g/只，以生藥量計，劑量參考本課題組前期預實驗結果設置），每組10只，均按組別分籠飼養(yǎng)。于實驗前24 h，剃除各組小鼠腹部被毛（面積約2 cm×2 cm）。各給藥組小鼠每天于脫毛處涂抹相應藥液2次（9：00和17：00），每次涂抹0.3 mL（以均勻涂抹于脫毛部位為準），共涂抹4天;空白對照組小鼠同法涂抹生理鹽水0.3 mL。于末次涂藥1 h后，各組小鼠均腹腔注射0.6%乙酸溶液（0.2 mL/只），觀察其注射乙酸溶液后15 min內的扭體次數和扭體潛伏期（即第1次扭體反應出現(xiàn)的時間），并計算各給藥組小鼠的鎮(zhèn)痛率：鎮(zhèn)痛率（%）=（空白對照組平均扭體次數-給藥組平均扭體次數）/空白對照組平均扭體次數×100%。按“2.2.2”項下方法對數據進行統(tǒng)計分析。各組小鼠扭體潛伏期、15 min內扭體次數和鎮(zhèn)痛率的測定結果見表3。

由表3可知，與空白對照組比較，雙氯芬酸二乙胺乳膠劑組小鼠的扭體潛伏期顯著延長（P<0.01），10批不同產地三七姜乙酸乙酯提取物組小鼠的扭體潛伏期雖也有所延長，但差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;雙氯芬酸二乙胺乳膠劑組和10批不同產地三七姜乙酸乙酯提取物組小鼠15 min內扭體次數均顯著減少（P<0.01）。10批不同產地三七姜乙酸乙酯提取物組小鼠的鎮(zhèn)痛率為45.56%～52.72%，說明各樣品均有較好的鎮(zhèn)痛作用。

2.3 10批不同產地三七姜乙酸乙酯提取物的HPLC指紋圖譜

2.3.1 溶液制備 （1）對照品溶液：稱取對羥基苯甲酸、原兒茶酸、對羥基苯甲醛對照品各適量，加甲醇溶解制成上述成分質量濃度分別為 0.212、0.236、0.149 mg/mL的混合對照品溶液。（2）三七姜供試品溶液：分別稱取不同產地三七姜乙酸乙酯提取物0.1 g，精密稱定，用5 mL甲醇超聲（功率250 W，頻率50 kHz）提取5 min，用甲醇定容到10 mL量瓶中，混勻，過濾，濾液以13 000 r/min 離心10 min，取上清液，過0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3.2 色譜條件 以Phenomenex Kinetex XB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，以0.1%磷酸溶液（A）-乙腈（B）為流動相進行洗脫梯度（0～20 min，60%B;20～50 min，60%B→80%B;50～75 min，80%B→100%B）;流速為0.8 mL/min;檢測波長為260 nm;柱溫為30 ℃;進樣量為10 μL。

2.3.3 精密度試驗 稱取三七姜乙酸乙酯提取物（編號S9）0.1 g，按“2.3.1（2）”項下方法制備供試品溶液，然后按“2.3.2”項下色譜條件連續(xù)測定6次，記錄色譜圖。結果，以2號峰（對羥基苯甲酸，該峰含量相對較高、分離度良好且出峰穩(wěn)定）為參照峰（S），計算得各共有峰相對保留時間的RSD均小于0.18%（n=6）、相對峰面積的RSD均小于1.80%（n=6），表明方法精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 取三七姜乙酸乙酯提取物（編號S9）0.1 g，按“2.3.1（2）”項下方法制備供試品溶液，于室溫下放置0、2、4、8、16、24 h時分別按“2.3.2”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果，以2號峰為參照峰，計算得各共有色譜峰相對保留時間的RSD均小于0.34%（n=6）、相對峰面積的RSD均小于2.12%（n=6），表明該供試品溶液于室溫下放置24 h內穩(wěn)定性良好。

2.3.5 重復性試驗 稱取三七姜乙酸乙酯提取物（編號S9）0.1 g，精密稱定6份，分別按“2.3.1（2）”項下方法制備供試品溶液，然后按“2.3.2”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果，以2號峰為參照峰，計算得各共有色譜峰相對保留時間的RSD均小于0.34%（n=6）、相對峰面積的RSD均小于1.77%（n=6），表明本方法重復性良好。

2.3.6 HPLC指紋圖譜的生成 分別取10批不同產地三七姜乙酸乙酯提取物各0.1 g，按 “2.3.1（2）” 項下方法制備供試品溶液，然后按“2.3.2”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。將10批樣品的色譜圖導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》中，以S1樣品的色譜圖為參照圖譜（因S1樣品圖譜的色譜峰信號相對較強且峰形較好），設置時間窗寬度為 0.1 s，采用多點校正法進行色譜峰匹配生成疊加指紋圖譜，并采用中位數法生成對照指紋圖譜（R）。結果，共確定了18個共有峰。10批不同產地三七姜乙酸乙酯提取物的HPLC疊加指紋圖譜和對照指紋圖譜見圖1。

2.3.7 共有峰的指認 取“2.3.1（1）”項下混合對照品溶液適量，按“2.3.2”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。通過比對該混合對照品圖譜與對照指紋圖譜（圖1B）中各成分峰的保留時間，指認出峰1為原兒茶酸、峰2為對羥基苯甲酸、峰4為對羥基苯甲醛?；旌蠈φ掌返腍PLC圖見圖2。

2.3.8 相似度評價 將10批三七姜乙酸乙酯提取物的HPLC指紋圖譜導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》中進行相似度評價。結果，10批樣品的色譜圖與對照指紋圖譜的相似度為0.944～0.997，均大于0.900，說明各批樣品化學成分的一致性較好。10批不同產地三七姜乙酸乙酯提取物的相似度評價結果見表4。

2.4 三七姜乙酸乙酯提取物抗炎、鎮(zhèn)痛的譜-效關系

2.4.1 基于Pearson相關系數的譜-效關系分析 將10批不同產地三七姜乙酸乙酯提取物的18個共有峰的峰面積與小鼠耳腫脹度（記為β1）、15 min內小鼠扭體次數（記為β2）分別導入SPSS 23.0軟件中，以10批樣品的18個共有峰峰面積為自變量、藥效指標（β1、β2）為因變量進行Pearson相關性分析[8]。結果顯示，峰10、18與β1呈顯著負相關（r分別為-0.853、-0.738，P分別為0.002、0.015），且峰10、18同時與β2呈顯著負相關（r分別為-0.821、-0.809，P分別為0.004、0.005）。以上結果提示，峰10、18與三七姜乙酸乙酯提取物的抗炎、鎮(zhèn)痛作用具有顯著相關性。18個共有峰與β1、β2的Pearson相關性分析結果分別見表5、表6。

2.4.2 基于灰色關聯(lián)度的譜-效關系分析 由于10批不同產地三七姜乙酸乙酯提取物的共有峰峰面積與小鼠藥效指標（鎮(zhèn)痛率、耳腫脹抑制率）的量綱不一致，不便于比較，因此在進行灰色關聯(lián)度分析時，需先對數據進行無量綱化處理[9-10]。本研究以10批不同產地三七姜乙酸乙酯提取物的共有峰峰面積為子序列、小鼠藥效指標為母序列，采用初值化變換法對數據進行無量綱化處理[9-10]。

將無量綱化處理后的子序列和母序列數值代入灰色關聯(lián)度公式：Δi（k）=│λ0（k）-λi（k）│。式中，λi（k）表示不同產地三七姜乙酸乙酯提取物的共有峰峰面積，i表示各共有峰的峰號（1～18），k表示樣品編號;λ0（k）表示不同產地三七姜乙酸乙酯提取物的抗炎、鎮(zhèn)痛指標，k表示各產地樣品提取物抗炎、鎮(zhèn)痛指標的編號（1～10）。求出兩個藥效指標絕對差的最大值和最小值，分別記為Δmax、Δmin。結果，Δ耳腫脹抑制率max=1.743 6、Δ耳腫脹抑制率min=0.005 3，Δ鎮(zhèn)痛率max=1.783 7、Δ鎮(zhèn)痛率min=0.005 2。將上述最大值和最小值代入灰色關聯(lián)系數計算公式[9]，計算18個共有峰與抗炎、鎮(zhèn)痛藥效指標的關聯(lián)系數。式中，ρ為分辨系數，在0～1內取值，取值越小，表示關聯(lián)度系數差異越大[11-12]。當ρ取0.6時[13]，得到10批不同產地三七姜乙酸乙酯提取物指紋圖譜中18個共有峰與抗炎、鎮(zhèn)痛藥效指標之間的關聯(lián)系數。利用所得的關聯(lián)系數計算關聯(lián)度（關聯(lián)度實質上是序列幾何關系的比較，是母序列與子序列各個時刻的關聯(lián)系數的平均值[14]），并對其進行排序組成關聯(lián)序，結果見表7。

由表7可知，10批不同產地三七姜乙酸乙酯提取物的18個共有峰與二甲苯致小鼠耳腫脹的抑制率以及與乙酸致小鼠扭體的鎮(zhèn)痛率的關聯(lián)度均在0.65以上，各成分對抗炎作用貢獻的大小順序依次為峰14>峰1>峰17>峰9>峰4>峰2>峰16>峰7>峰6>峰5>峰11>峰12>峰13>峰3>峰8>峰15>峰18>峰10，各成分對鎮(zhèn)痛作用貢獻的大小順序依次為峰1>峰17>峰14>峰9>峰16>峰2>峰4>峰7>峰6>峰5>峰18>峰15>峰3>峰11>峰12>峰13>峰10>峰8。同時，峰14、1（原兒茶酸）、17、9、4（對羥基苯甲醛）、2（對羥基苯甲酸）、16、7、6與三七姜乙酸乙酯提取物抗炎藥效的關聯(lián)度相對較高（關聯(lián)度均高于0.7），峰1（原兒茶酸）、17、14、9、16、2（對羥基苯甲酸）、4（對羥基苯甲醛）與三七姜乙酸乙酯提取物鎮(zhèn)痛藥效的關聯(lián)度相對較高（關聯(lián)度均高于0.7）。該結果表明，這些關聯(lián)度較高的峰（其中包括已知成分原兒茶酸、對羥基苯甲酸、對羥基苯甲醛等）可能是三七姜乙酸乙酯提取物發(fā)揮藥效的主要成分。

3 討論

3.1 色譜條件的篩選

本課題組前期考察了多種色譜柱（COSMOSIL 5C18-PAQ、Hypersil ODS2和Phenomennex Kinetex XB C18等）的分離效果，結果發(fā)現(xiàn)色譜柱Phenomenex Kinetex XB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）對各成分的分離效果明顯優(yōu)于其他色譜柱。此外，本課題組前期還考察了不同檢測波長（220、260、280、300、320 nm）、不同流動相（甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%冰乙酸溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液）、不同流速（0.8、1、1.2 mL/min）對各成分的分離效果。結果發(fā)現(xiàn)，當檢測波長為260 nm、流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液、流速為0.8 mL/min時，各色譜峰的分離效果和峰形均最好，且基線較平穩(wěn)、各峰保留時間適當，故最終確定了“2.3.2”項下色譜條件。

3.2 三七姜乙酸乙酯提取物抗炎、鎮(zhèn)痛的譜-效關系分析

本研究主要是想探討三七姜外用的抗炎、鎮(zhèn)痛作用，因此選擇了外敷藥物復方醋酸地塞米松軟膏和雙氯芬酸二乙胺乳膠劑作為陽性對照藥物。其中，復方醋酸地塞米松軟膏為糖皮質激素外用制劑，臨床上常用于炎癥性疾病的治療，且效果顯著[15];雙氯芬酸二乙胺乳膠劑為前列腺素合成抑制劑，其不僅能抑制前列腺素的合成，具有抗炎、鎮(zhèn)痛作用，還能提高痛閾值，從而減輕疼痛及腫脹，最終達到治療效果[16]。

本研究采用HPLC法對10批不同產地三七姜乙酸乙酯提取物進行了指紋圖譜分析，共標定出了18個共有峰，并指認出了其中3個特征峰。接著，本研究分別采用Pearson相關系數法和灰色關聯(lián)分析法對這18個共有色譜峰與三七姜乙酸乙酯提取物的抗炎、鎮(zhèn)痛作用進行了相關性分析。Pearson相關性分析結果表明，與三七姜乙酸乙酯提取物抗炎、鎮(zhèn)痛作用具有顯著相關的是峰10、18;基于灰色關聯(lián)度分析表明，對三七姜乙酸乙酯提取物抗炎作用貢獻較大的是峰14、1（原兒茶酸）、17、9、4（對羥基苯甲醛）、2（對羥基苯甲酸）、16、7、6，對其鎮(zhèn)痛作用貢獻較大的是峰1（原兒茶酸）、17、14、9、16、2（對羥基苯甲酸）、4（對羥基苯甲醛）。以上各特征峰與三七姜乙酸乙酯提取物對應藥效的關聯(lián)度雖存在差異，但關聯(lián)度均高于0.7，可能為三七姜乙酸乙酯提取物發(fā)揮抗炎、鎮(zhèn)痛效果的主要活性成分[17]。

在上述關聯(lián)度較高的色譜峰中，筆者指認出了原兒茶酸、對羥基苯甲酸、對羥基苯甲醛這3種成分。占龍等[18]通過研究原兒茶酸在體外對白細胞介素1β誘導炎癥軟骨細胞的生物學影響，證實了其能促進軟骨細胞生長以及下調炎癥相關基因MMP-13的表達。姜鴻等[19]在火絨草抗急性炎癥的藥效物質基礎研究中發(fā)現(xiàn)，該藥發(fā)揮抗急性炎癥的作用與其所含成分原兒茶酸有關。 Dikmen等[20]研究發(fā)現(xiàn)，原兒茶酸通過內源性大麻素系統(tǒng)來抑制疼痛反應。Arslan等[21]通過小鼠熱板實驗（脊柱上綜合反應）和尾巴浸入實驗（脊髓反射）發(fā)現(xiàn)，原兒茶酸具有鎮(zhèn)痛作用。和蕾等[22]研究發(fā)現(xiàn)，對羥基苯甲酸具有抗炎活性。劉珊珊等[23]研究表明，天麻中的對羥基苯甲醛具有抗炎作用?？梢?，原兒茶酸、對羥基苯甲酸、對羥基苯甲醛可能為三七姜藥材抗炎、鎮(zhèn)痛的活性成分之一。

綜上所述，三七姜乙酸乙酯提取物具有一定的抗炎、鎮(zhèn)痛作用。其中，峰1（原兒茶酸）、2（對羥基苯甲酸）、4（對羥基苯甲醛）、14、17、10、18等可能是其抗炎、鎮(zhèn)痛作用的主要活性成分。但本研究僅指認出了部分對抗炎、鎮(zhèn)痛作用貢獻較大的化學成分，對其他關聯(lián)度較高的有效成分仍需結合超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜技術進行深入的挖掘與鑒定。

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（收稿日期：2021-01-22 修回日期：2021-03-28）

（編輯：林 靜）