劉 穎，柴麗娟，黃菊陽(yáng)，王 琴，宋 蕾，周 昆*，李云章*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.天津中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)藥研究院 天津市中藥藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300193)

隨著人們生活水平的提高，寵物的飼養(yǎng)條件及醫(yī)療保健程度有了很大的提升，寵物平均壽命也隨之增長(zhǎng)，寵物老年病和慢性病日漸涌現(xiàn)，其中就包括骨質(zhì)疏松等骨骼疾病，常表現(xiàn)為老年動(dòng)物的骨折、椎體變形、骨痛等。

淫羊藿(Epimediumbrevicornu)，又名仙靈脾、三枝九葉草，是傳統(tǒng)的補(bǔ)腎壯骨中藥，能補(bǔ)腎陽(yáng)、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕[1]。近期研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿可提升軟骨內(nèi)成骨，增加骨痂和骨密度，加快骨折愈合[2]；淫羊藿苷通過(guò)抑制成骨細(xì)胞表達(dá)核轉(zhuǎn)錄因子(receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL)誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞，從而減少破骨細(xì)胞的分化[3]。淫羊藿中朝藿定A、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ、朝藿定B、朝藿定C等黃酮類(lèi)成分含量較高并具有較強(qiáng)生理活性[4]。故本試驗(yàn)以正常小鼠骨髓單核細(xì)胞誘導(dǎo)形成的破骨細(xì)胞和去勢(shì)誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松雄性小鼠為模型，明確朝藿定A對(duì)破骨細(xì)胞及骨質(zhì)疏松雄性小鼠的作用。目前，去勢(shì)小鼠模型是比較公認(rèn)的骨丟失動(dòng)物模型，可以很好的模擬老年激素缺乏所引起的骨丟失，因而體內(nèi)試驗(yàn)采用去睪丸的方法造模進(jìn)行骨質(zhì)疏松癥的基礎(chǔ)研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物4～6周C57BL/6J 小鼠，SPF級(jí)，用于采集骨髓細(xì)胞；72只雄性ICR小鼠，體質(zhì)量約20 g，SPF級(jí)，用于構(gòu)建骨質(zhì)疏松模型。小鼠購(gòu)買(mǎi)于北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證編號(hào)：SCXK(京)2016-0004。動(dòng)物飼養(yǎng)于天津中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房。

1.2 主要試劑α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、青鏈霉素混合液、trypsin-0.25%EDTA(Gibco)；堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)&TRACP染色試劑盒(TaKaRa)；朝藿定A(普菲德)；磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)、EDTA-Na2(索萊寶)；二甲基亞砜(Amresco)；依普拉芬膠囊(Enzymatic Therapy)；骨保護(hù)素(OPG)ELSIA 試劑盒(Abcam)；Ⅰ型前膠原交聯(lián)C末端肽(CTXⅠ)ELSIA 試劑盒(USCN)；雌二醇(E2)(Sigma)。

1.3 主要儀器多功能讀板機(jī)(Felex station 3，MD)；超聲破碎儀(VCX 130，Sonics)；倒置熒光顯微鏡(TE300，Nikon)；超凈工作臺(tái)(蘇凈安泰)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo)；小型臺(tái)式離心機(jī)、臺(tái)式冷凍離心機(jī)(Beckman)；氣浴搖床(S1500，Stuart)；天平(Sartorius)；VivaCT 40骨密度儀(Scanco Medical AG)。

1.4 細(xì)胞試驗(yàn)

1.4.1小鼠骨髓單核細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 拉頸法處死C57BL/6J小鼠，于75%酒精中浸泡消毒5 min，在超凈臺(tái)分離小鼠后肢長(zhǎng)骨，去除骨表面軟組織和骨骺，置入盛有PBS(1%雙抗)的玻璃皿中。用針筒吸取完全培養(yǎng)基(90%α-MEM，10%FBS，1%青鏈霉素，簡(jiǎn)稱(chēng)全培)，反復(fù)沖洗骨髓腔和骨內(nèi)表面，直至骨壁變白。骨髓懸液用70μm細(xì)胞篩過(guò)濾，用 ficoll分離液分離出單核細(xì)胞，將細(xì)胞懸液均勻接種至25 cm2培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.4.2破骨細(xì)胞TRACP染色 將細(xì)胞懸液用含20 μg/L 巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor,M-CSF)的完全培養(yǎng)基調(diào)節(jié)濃度至3×105個(gè)/mL，接種到96孔板。培養(yǎng)48 h后，吸去培基去除未貼壁細(xì)胞，加入含20 μg/L M-CSF和50 μg/L RANKL的α-MEM含藥培基進(jìn)行培養(yǎng)。設(shè)朝藿定A給藥濃度分別為0.01，0.10，1.00 μmol/L(記為AL、AM、AH)；陽(yáng)性對(duì)照給予E2，濃度為0.10 μmol/L；對(duì)照(CON)和模型(MO)給予0.1%DMSO。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3～4 d 換液，培養(yǎng)7 d后，吸掉96孔板內(nèi)的培養(yǎng)液，用PBS沖洗3遍，用TRACP染色試劑盒對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。

1.4.3破骨細(xì)胞骨吸收能力測(cè)定 將無(wú)菌處理過(guò)的骨切片放入96孔板中，而后將細(xì)胞懸液以3×105個(gè)/mL種入，200 μL/孔。2 d后PBS液洗滌除去未貼壁細(xì)胞，加入含20 μg/L M-CSF和50 μg/L RANKL的α-MEM含藥培基進(jìn)行培養(yǎng)。設(shè)朝藿定A給藥濃度分別為0.01，0.10，1.00 μmol/L(記為AL、AM、AH)；陽(yáng)性對(duì)照給予E2，濃度為0.1 μmol/L；對(duì)照(CON)和模型(MO)給予0.1%DMSO。細(xì)胞每3 d換液1次，于14 d后細(xì)胞終止培養(yǎng)，取出骨薄片，進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色。

1.5 動(dòng)物試驗(yàn)

1.5.1動(dòng)物造模、分組及給藥 采用隨機(jī)數(shù)字法，從72只雄性ICR小鼠中抽取12只作為空白對(duì)照組(Con)；其余小鼠行睪丸切除術(shù)造模。采用5%水合氯醛(0.008 mL/g)麻醉，術(shù)后連續(xù)2 d腹腔注射4萬(wàn)單位青霉素。造模6周后，將去勢(shì)小鼠隨機(jī)分為5組，即模型組(Model)、依普拉芬組(IP98：每天80 mg/kg)、朝藿定A高、中、低劑量組(AH、AM、AL：每天20，10，5 mg/kg)。組間小鼠體質(zhì)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。去勢(shì)后7周開(kāi)始，給藥組按體質(zhì)量灌胃給藥，連續(xù)8周；對(duì)照組及模型組給予相應(yīng)體積的飲用水。

1.5.2血清樣本檢測(cè) 小鼠禁食8 h后，眼動(dòng)脈取血并處死，將全血分別轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃靜置30 min，3 000 r/min離心10 min，取上層血清保存于離心管中，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)的要求步驟對(duì)OPG和CTXⅠ進(jìn)行檢測(cè)。

1.5.3骨小梁微結(jié)構(gòu)特性分析 剝離試驗(yàn)小鼠的單側(cè)股骨和脛骨，脛骨采用10%甲醛溶液固定，采用Micro-CT沿標(biāo)本的長(zhǎng)軸方向?qū)γ劰堑膬?nèi)部結(jié)構(gòu)進(jìn)行掃描，獲取連續(xù)不同層面的Micro-CT圖像，重建后得到掃描區(qū)域的立體結(jié)構(gòu)，采用配套軟件分析骨小梁的微結(jié)構(gòu)并收集骨小梁空間結(jié)構(gòu)參數(shù)，如骨連接數(shù)(Conn.D)、骨模型指數(shù)(SMI)、骨表面積(BS)和各項(xiàng)異性指標(biāo)(DA)。

1.5.4股骨HE染色 股骨于10%甲醛溶液中固定24 h后，轉(zhuǎn)置于10%EDTA脫鈣液中脫鈣30 d，經(jīng)ASP200S自動(dòng)真空組織脫水機(jī)脫水浸蠟，Leica EG1150H自動(dòng)生物組織包埋機(jī)包埋，Leica RM2255切片機(jī)制片，HE染色，Nikon Ci-L顯微鏡觀察，HMIAS-2000高清晰度數(shù)碼顯微圖像分析系統(tǒng)采圖。

2 結(jié)果

2.1 朝藿定A對(duì)骨髓單個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)分化形成破骨細(xì)胞的影響

2.1.1破骨細(xì)胞TRACP染色 按照ALP & TRACP染色試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行染色，破骨細(xì)胞分泌的TRACP被染成紫紅色，濃度越高，顏色越深。由圖1可見(jiàn)，由M-CSF和RANKL誘導(dǎo)的骨髓單個(gè)核細(xì)胞分化融合，形成大量破骨細(xì)胞并分泌大量TRACP，如MO組；給藥后，E2和各濃度朝藿定A組的破骨細(xì)胞數(shù)量和TRACP分泌較MO組明顯減少，其中朝藿定A對(duì)破骨細(xì)胞的抑制作用有一定的劑量依賴(lài)性。

CON.基礎(chǔ)培養(yǎng)基；MO.破骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基；E2.含E2的破骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基;AL，AM，AH.朝藿定A低、中、高劑量的破骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基。下同

2.1.2破骨細(xì)胞骨吸收陷窩染色 骨吸收完成時(shí)，骨表面局部形成吸收陷窩。骨吸收陷窩呈圓形、橢圓形或不規(guī)則形(圖2中箭頭所示藍(lán)色深染區(qū)域)，陷窩邊界清晰，底面粗糙。從圖2可以看出，破骨細(xì)胞在M-CSF和RANKL誘導(dǎo)下培養(yǎng)21 d，可使骨薄片上形成大面積骨陷窩，如MO組；E2和各濃度朝藿定A給藥組的骨陷窩較MO組明顯減少，其中朝藿定A對(duì)破骨細(xì)胞的抑制作用有一定的劑量依賴(lài)性。

圖2 破骨細(xì)胞骨吸收陷窩染色

2.2 朝藿定A對(duì)小鼠血清中OPG和CTXⅠ含量的影響與對(duì)照組比較，小鼠模型組的OPG、CTXⅠ均顯著升高(P<0.05)；而朝藿定A給藥組OPG和CTXⅠ較模型組顯著降低(P<0.05或P<0.01)，IP98組在這2個(gè)指標(biāo)上無(wú)顯著影響(圖3)。

#示P<0.05；##示P<0.01；*示P<0.05,**示P<0.01。下同

2.3 朝藿定A對(duì)小鼠骨微結(jié)構(gòu)的影響

2.3.1小鼠脛骨Micro-CT分析 與對(duì)照組比較，小鼠模型組BS、SMI、Conn.D均顯著降低(P<0.01)，DA顯著升高(P<0.01)；各給藥組與模型組比較，陽(yáng)性藥IP98組各項(xiàng)指標(biāo)均沒(méi)有明顯改善，AM組Coon.D和BS顯著升高(P<0.01)；AH組Coon.D、SMI顯著升高(P<0.05，0.01)，DA顯著降低(P<0.01)，其他給藥組DA也有下降趨勢(shì)(圖4)。

圖4 小鼠脛骨骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)

2.3.2小鼠股骨HE染色 由圖5可見(jiàn)，空白對(duì)照組脛骨上端骺板軟骨細(xì)胞柱狀排列不甚整齊，軟骨各層細(xì)胞分界欠清楚，骨小梁(圖中箭頭所示粉色條狀部分)及鈣化區(qū)底部的過(guò)渡骨小梁形成較多，但不飽滿(mǎn)，較細(xì)長(zhǎng)或團(tuán)塊狀，部分間隙較大；模型組脛骨上端骺板軟骨細(xì)胞柱狀排列不甚整齊，軟骨各層細(xì)胞分界欠清楚，骨小梁及過(guò)渡骨小梁數(shù)目較空白對(duì)照組有所減少，但數(shù)目及形態(tài)結(jié)構(gòu)與空白對(duì)照組比較差異不明顯；陽(yáng)性藥組軟骨細(xì)胞和骨小梁數(shù)目及形態(tài)結(jié)構(gòu)與模型組比較有明顯改善；朝藿定A組脛骨上端骺板軟骨細(xì)胞柱狀排列不甚整齊，軟骨各層細(xì)胞分界欠清楚。骨小梁數(shù)目及形態(tài)結(jié)構(gòu)與模型組比較均有所改善，以高劑量組改善較為明顯。

CON.空白對(duì)照；MO.去勢(shì)誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松模型；IP98，AL，AM，AH.IP98或朝藿定A低、中、高劑量試驗(yàn)組

3 討論

骨質(zhì)疏松發(fā)生于骨代謝的失衡，即骨吸收大于骨形成。骨骼是隨著機(jī)械負(fù)荷不斷重建的動(dòng)態(tài)組織，而重建是舊的骨組織被取代的生理過(guò)程。骨重建發(fā)生在基本多細(xì)胞單元中，包括成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和骨細(xì)胞[5]。

破骨細(xì)胞的主要作用是骨吸收，這些多核細(xì)胞來(lái)源于造血細(xì)胞系[6]，通過(guò)單核祖細(xì)胞的融合形成，例如單核細(xì)胞和骨髓巨噬細(xì)胞。M-CSF促進(jìn)造血干細(xì)胞分化成單核巨噬細(xì)胞集落形成單位并保持其增殖和分化的能力。細(xì)胞開(kāi)始表達(dá)TRACP直至形成成熟破骨細(xì)胞，只有成熟的破骨細(xì)胞才具有骨吸收能力。M-CSF和RANKL是破骨細(xì)胞分化和激活的2個(gè)重要誘導(dǎo)因子[7]。TRACP和骨吸收活性通常用于確定破骨細(xì)胞分化的階段，成熟的破骨細(xì)胞含有大量的標(biāo)志酶TRACP。當(dāng)破骨細(xì)胞進(jìn)行骨吸收時(shí)，TRACP從破骨細(xì)胞的溶酶體樣結(jié)構(gòu)分泌到骨吸收表面，并且使非膠原骨基質(zhì)蛋白如骨橋蛋白和骨粘連蛋白去磷酸化，促進(jìn)破骨細(xì)胞黏附到骨吸收表面。RANKL與其受體的結(jié)合導(dǎo)致單核祖細(xì)胞分化融合成多核破骨細(xì)胞。破骨細(xì)胞的活力在常態(tài)和大部分病理情況下與骨吸收的增加有關(guān)。OPG是一種誘導(dǎo)肽，由成骨細(xì)胞和成骨基質(zhì)干細(xì)胞分泌，通過(guò)清除RANKL來(lái)減少與RANK的結(jié)合，從而抑制過(guò)多的骨吸收[8]。因此，無(wú)論正?；蚣膊顟B(tài)下，骨髓中的RANKL/OPG率是骨質(zhì)量的重要決定因素[9]。

從細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，朝藿定A濃度在0.01～1.00 μmol/L時(shí)對(duì)誘導(dǎo)產(chǎn)生的破骨細(xì)胞TRACP酶有明顯抑制作用，對(duì)成熟破骨細(xì)胞形成數(shù)目有一定的降低趨勢(shì)。破骨細(xì)胞在M-CSF和RANKL誘導(dǎo)下培養(yǎng)14 d后，可以顯著增加骨薄片上骨陷窩的形成，朝藿定A可以一定程度上抑制破骨細(xì)胞的分化和對(duì)骨薄片的破壞作用，骨陷窩的數(shù)目和面積都有不同程度的降低，說(shuō)明朝藿定A濃度在0.01～1.00 μmol/L 時(shí)分別對(duì)原代破骨細(xì)胞的形成和TRACP分泌有抑制作用，并可以抑制原代破骨細(xì)胞對(duì)骨薄片的吸收作用，且呈劑量依賴(lài)性。王建鈞等[10]建立成骨-破骨細(xì)胞共育體系，觀察應(yīng)用淫羊藿后堿性磷酸酶抗TRACP的變化，結(jié)果顯示淫羊藿可顯著降低 TRACP 的活性，提示淫羊藿可增強(qiáng)共育體系中成骨細(xì)胞活性、抑制破骨細(xì)胞的功能，與本研究結(jié)果類(lèi)似。

血液中CTXⅠ的含量主要反映破骨細(xì)胞骨吸收的速率和骨轉(zhuǎn)換情況，升高則提示骨吸收速率加快[11]。IP98是一種臨床上已經(jīng)用于治療骨折疏松的西藥[12]，屬于非激素類(lèi)異黃酮類(lèi)衍生物化合物，與朝藿定A類(lèi)別相近，屬于植物雌激素，具有雌激素樣作用，但不具有雌激素固有的特性和副作用。IP98有抑制骨吸收又有刺激骨形成的作用。動(dòng)物試驗(yàn)中，IP98對(duì)去睪丸誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松小鼠沒(méi)有明顯的治療作用，比較之下，朝藿定A給藥組OPG、CTXⅠ顯著降低，證實(shí)朝藿定A可以通過(guò)降低血液中CTXⅠ和OPG水平，從而減少骨吸收，改善骨質(zhì)疏松狀態(tài)。

骨質(zhì)疏松模型的建立成功與否常常需要多個(gè)方面決定，即骨量、力學(xué)特性、骨微結(jié)構(gòu)、生化代謝指標(biāo)的變化。骨組織病理圖片和CT掃描數(shù)據(jù)在抗骨質(zhì)疏松效果評(píng)估中顯示著巨大優(yōu)勢(shì)。經(jīng)過(guò)Micro-CT掃描發(fā)現(xiàn)，給藥后骨微結(jié)構(gòu)各項(xiàng)參數(shù)均有所改善；病理組織學(xué)觀察骨微結(jié)構(gòu)結(jié)果顯示，朝藿定A高劑量組骨小梁數(shù)目及形態(tài)結(jié)構(gòu)與模型組比較有明顯改善。

綜上所述，朝藿定A可以抑制原代破骨細(xì)胞的形成和TRACP的分泌，同時(shí)抑制原代破骨細(xì)胞對(duì)骨薄片的吸收功能；通過(guò)改善骨質(zhì)疏松模型小鼠的骨微結(jié)構(gòu)和血清骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物含量，達(dá)到改善骨質(zhì)疏松的作用，且有一定的劑量依賴(lài)性。