潘 永，楊 陽(yáng)，段世宇，楊 琦,3*

(1.貴州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州大學(xué) 動(dòng)物疫病研究所，貴州 貴陽(yáng) 550025；3.貴州省動(dòng)物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025)

sRNA(small RNA)是長(zhǎng)度為40～500 nt的主要調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)的短非編碼RNA，在原核生物中廣泛存在，此前相關(guān)研究主要集中于大腸桿菌和沙門(mén)菌[1]。多項(xiàng)研究結(jié)果表明，sRNA調(diào)控著多種基因，這些基因編碼與細(xì)菌生理、代謝、應(yīng)激反應(yīng)和群體感應(yīng)等有關(guān)過(guò)程中涉及的蛋白質(zhì)[2-5]。許多sRNA能夠調(diào)節(jié)多種靶mRNA，一種靶mRNA可受多個(gè)sRNA調(diào)節(jié)，從而形成了一個(gè)基于sRNA的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，體現(xiàn)了它們?cè)诨蜣D(zhuǎn)錄后調(diào)控中的重要作用。sRNA降低了細(xì)菌代謝所消耗的能量并提供了更緊密，更快速的基因調(diào)節(jié)，可幫助細(xì)菌適應(yīng)新環(huán)境。sRNA GcvB是一段僅有206個(gè)核苷酸組成的短非編碼RNA分子，在細(xì)菌中比較保守，大腸桿菌和沙門(mén)菌gcvB基因RNA序列相似度高達(dá)95%。研究表明，GcvB主要調(diào)控沙門(mén)菌ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)[6]。GcvB通過(guò)3個(gè)特殊保守單鏈核苷酸序列R1、R2或R3與靶mRNA對(duì)應(yīng)序列完全或部分堿基互補(bǔ)配對(duì)，從而抑制或促進(jìn)mRNA的翻譯[7-9]。此前，僅探明GcvB直接調(diào)控30余種mRNA，相信還有大量GcvB靶基因未被挖掘。MIYAKOSHI等[10]最近在研究與鼠傷寒沙門(mén)菌(Salmonellatyphimurium LT2，STM LT2)sRNA GcvB產(chǎn)生拮抗作用的mRNA 海綿SroC時(shí)，通過(guò)微陣列分析篩選到部分受GcvB調(diào)控的基因，但這些基因是否受GcvB直接調(diào)控目前尚未驗(yàn)證。

研究表明，GcvB在細(xì)菌對(duì)數(shù)期早期表達(dá)量最高，隨著生長(zhǎng)周期往后的推移，表達(dá)量水平下降直至穩(wěn)定期幾乎檢測(cè)不到，因此本研究?jī)H分析各基因轉(zhuǎn)錄水平在STM LT2對(duì)數(shù)早期時(shí)的變化[11]。本試驗(yàn)根據(jù)GcvB特性，利用無(wú)痕基因重組技術(shù)構(gòu)建STM LT2ΔgcvBR1、STM LT2ΔgcvBR2和STM LT2ΔgcvBR3菌株，并設(shè)計(jì)合成熒光定量PCR引物，通過(guò)相對(duì)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)各基因在不同菌株中的轉(zhuǎn)錄水平變化，最后進(jìn)一步分析各基因與GcvB 3個(gè)功能區(qū)的關(guān)系，旨在挖掘STM LT2 sRNA GcvB潛在靶基因并探明其與GcvB的作用方式，為闡明沙門(mén)菌致病機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒及主要試劑野生型STM LT2株被命名為3409(GenBank ID：AE006468.2)，STM LT2ΔgcvB株被命名為10241；無(wú)痕基因重組系統(tǒng)涉及質(zhì)粒pKD46為同源重組的輔助質(zhì)粒,含有溫度敏感復(fù)制子,37℃及以上培養(yǎng)可去除，20%阿拉伯糖誘導(dǎo)后能夠表達(dá)Gam、Beta和Exo 3個(gè)λ噬菌體重組酶；pKD3含氯霉素(cat)抗性基因，為重組轉(zhuǎn)化子提供篩選標(biāo)志；以上所有材料均由法國(guó)國(guó)家科學(xué)研究中心(CNRS)分子遺傳學(xué)Bossi實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。Pfu和Taq DNA聚合酶均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;PCR產(chǎn)物純化試劑盒和RNA提取試劑TRIzol均購(gòu)自上海生工生物有限公司;膠回收試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScriptⅡ Q Select RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)以及熒光染料AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix皆購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成如表1所示，雙橫線表示堿基與3409 的基因序列同源，為無(wú)痕基因重組提供同源臂。單橫線標(biāo)示堿基與pKD3質(zhì)粒序列同源，其中g(shù)cvB-R與cat-F反向互補(bǔ)，cat-F與cat-R擴(kuò)增得到氯霉素抗性(cat)基因序列，為無(wú)痕重組提供篩選標(biāo)記。gcvBR1-F、gcvBR2-F和gcvBR3-F已分別刪除功能區(qū)R1(5′-GTGATGTTGTGTTGTTGTGTTTGC-3′)、R2(5′-ACTTCCTGT-3′)和R3(5′-TACCCTGTCTGTCCATAGTGATTAAT-3′)。無(wú)橫線引物中除aF和aR外皆為熒光定量PCR引物，本試驗(yàn)以16S rRNA為內(nèi)參基因，所有引物通過(guò)Primerselect軟件設(shè)計(jì)并由上海生工生物有限公司合成。

表1 引物序列信息

1.3 STM LT2gcvBΔR1、STM LT2gcvBΔR2和STM LT2gcvBΔR3菌株的構(gòu)建

1.3.1SOE-PCR結(jié)合Touchdown PCR制備無(wú)痕基因重組目的片段 通過(guò)SOE-PCR技術(shù)分別將刪除R1、R2和R3的部分gcvB基因與氯霉素抗性(cat)基因融合，擴(kuò)增分為兩步：第1步以3409總DNA為模板，分別以(gcvBR1-F,gcvB-R)、(gcvBR2-F,gcvB-R)和(gcvBR3-F,gcvB-R)為引物進(jìn)行擴(kuò)增；以pKD3為模板，以(cat-F,cat-R)為引物進(jìn)行擴(kuò)增，取25 μL產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并膠回收。第2步分別取上述前3個(gè)反應(yīng)的膠回收產(chǎn)物逐一與第4個(gè)混合(1∶1)作為模板，同時(shí)分別以gcvBR1-F和cat-R、gcvBR2-F和cat-R以及gcvBR3-F 和cat-R為引物進(jìn)行擴(kuò)增。上述所有反應(yīng)體系均為：模板DNA 100～200 ng，10 μmol/L 上、下游引物各1 μL，Pfu DNA Polymerase(5 U/μL)0.25 μL，Taq DNA Polymerase(5 U/μL)0.75 μL，10 mmol/L dNTPs Mix 2 μL，10×Pfu Buffer 2 μL，10×Taq Buffer 6 μL，ddH2O補(bǔ)足80 μL。所有擴(kuò)增反應(yīng)均使用Touchdown PCR程序：95℃ 6 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 90s，循環(huán)5次；95℃ 10 s，53℃ 30 s，72℃ 90 s，循環(huán)20次；72℃ 8 min。取10 μL產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，若無(wú)特異性條帶則將剩余產(chǎn)物用產(chǎn)物純化試劑盒回收并測(cè)量DNA濃度。

1.3.2無(wú)痕基因重組反應(yīng) 第1步：按1∶100取3409過(guò)夜菌液于5 mL 液體LB中30℃ 170 r/min振蕩培養(yǎng)至D600 nm≈0.5，冰浴10 min后用10%甘油洗滌3次,取50 μL 10%甘油懸浮即為電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，將1 μL pKD46(100～200 mg/L)與50 μL 感受態(tài)細(xì)胞混合并轉(zhuǎn)入0.2 cm的Bio-Rad電極杯中，按Bio-Rad電轉(zhuǎn)儀預(yù)設(shè)參數(shù)(2.5 kV,5.8 ms)電擊轉(zhuǎn)化并迅速加入1 mL預(yù)冷的SOC復(fù)蘇液，將杯內(nèi)液體轉(zhuǎn)入無(wú)菌空試管并于搖床30℃ 170 r/min條件下培養(yǎng)1 h，取100 μL涂布于含氨芐青霉素抗性的LB平板30℃過(guò)夜培養(yǎng)，次日挑單個(gè)陽(yáng)性菌落過(guò)夜培養(yǎng)。第2步：取400 μL陽(yáng)性菌過(guò)夜培養(yǎng)物及26μL 20%阿拉伯糖溶液于40 mL液體LB 30℃培養(yǎng)至D600 nm≈0.5，10%甘油洗滌5次并用100 μL 10%甘油懸浮制備電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，取上述純化的PCR產(chǎn)物100～200 ng與50 μL感受態(tài)細(xì)胞混合后電擊、37℃復(fù)蘇以及200 μL涂于氯霉素抗性平板37℃過(guò)夜培養(yǎng)，次日挑單個(gè)菌落以a-F和a-R為引物進(jìn)行PCR及測(cè)序鑒定。電擊杯中PCR產(chǎn)物體積原則上不超過(guò)感受態(tài)細(xì)胞體積的10%，感受態(tài)細(xì)胞的制備全程于冰上操作且全程需注意無(wú)菌操作。

1.4 細(xì)菌總RNA的提取分別將3409、10241、STM LT2gcvBΔR1、STM LT2gcvBΔ R2和STM LT2gcvBΔR3菌株的過(guò)夜培養(yǎng)物按1∶100接種于5 mL液體LB中，除3409外其余均添加終質(zhì)量濃度為25 mg/L的氯霉素，37℃ 170 r/min振蕩培養(yǎng)至D600 nm≈0.4，然后根據(jù)TRIzol說(shuō)明書(shū)提取總RNA并測(cè)量濃度，產(chǎn)物保存于-80℃。

1.5 cDNA的制備分別取總RNA產(chǎn)物按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)先進(jìn)行去基因組處理然后反轉(zhuǎn)錄，cDNA置-20℃保存。

1.6 熒光定量PCR檢測(cè)基因轉(zhuǎn)錄水平通過(guò)普通PCR對(duì)GcvB調(diào)控基因的熒光定量PCR引物進(jìn)行特異性檢測(cè)后，通過(guò)熒光相對(duì)定量法檢測(cè)各基因在不同基因型菌株中的轉(zhuǎn)錄水平，反應(yīng)體系：2×AceQ SYBR qPCR Master Mix10 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.4 μL，cDNA 1 μL，ddH2O補(bǔ)足20 μL。反應(yīng)條件為95℃ 30 s；95℃ 10 s，60℃ 30 s，循環(huán)40次；熔解曲線分析：95℃ 15 s；60℃ 1 min；95℃ 15 s。每個(gè)樣設(shè)3個(gè)重復(fù),以16S rRNA cDNA作為內(nèi)參基因，結(jié)果根據(jù)2-△△Ct法計(jì)算全部基因在不同基因型菌株中的相對(duì)表達(dá)水平[12]。

2 結(jié)果

2.1 基因敲除菌株的構(gòu)建通過(guò)SOE-PCR結(jié)合Touchdown PCR制備同源重組目的片段并利用無(wú)痕基因重組系統(tǒng)構(gòu)建STM LT2gcvBΔR1、STM LT2gcvBΔR2和STM LT2gcvBΔR3菌株。結(jié)果顯示，以a-F和a-R為引物通過(guò)PCR分別擴(kuò)增包含gcvB在內(nèi)的基因片段后，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)出現(xiàn)與預(yù)期值一致的條帶(圖1)。測(cè)序分析結(jié)果對(duì)比3409gcvB基因序列(圖2)顯示，gcvB基因R1(圖3)、R2(圖4)和R3(圖5)已被成功敲除。結(jié)果表明，STM LT2gcvBΔR1、STM LT2gcvBΔR2和STM LT2gcvBΔR3菌株已被成功構(gòu)建。

M.DL2000 DNA Marker;A1.3409;A2.gcvBΔR1;A3.gcvBΔR2;A4.gcvBΔR3;A5.Blank control

GcvB.1～206 nt;R1.65～93 nt;R2.136～145 nt;R3.150～175 nt

圖3 STM LT2 gcvBΔR1株測(cè)序(A)和色譜(B)結(jié)果

圖4 STM LT2 gcvBΔR2株測(cè)序(A)和色譜(B)結(jié)果

圖5 STM LT2 gcvBΔR3株測(cè)序(A)和色譜(B)結(jié)果

2.2 熒光定量PCR檢測(cè)基因轉(zhuǎn)錄水平對(duì)GcvB調(diào)控基因的熒光定量PCR引物特異性檢測(cè)后進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)各基因在不同基因型菌株中的轉(zhuǎn)錄水平變化。結(jié)果顯示，STM LT2gcvBR1、gcvBR2或gcvBR3單敲除使fhuA、aphA、STM2714、STM0298和STM1827基因轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)與gcvB單敲除時(shí)一樣大于2倍的下調(diào)變化，STM0276、exbD和sodA基因在gcvB、gcvBR1或gcvBR2單敲除時(shí)均出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)大于2倍的變化，trpE和yifK基因則在gcvB或gcvBR3單敲除時(shí)出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)大于2倍的變化(圖6)。以上結(jié)果表明，GcvB 調(diào)控fhuA、aphA、STM2714、STM0298和STM1827基因的表達(dá)與功能基序R1、R2和R3相關(guān)；調(diào)控STM0276、exbD和sodA基因表達(dá)與功能基序R1和R2相關(guān)；調(diào)控trpE和yifK基因表達(dá)與功能基序R3相關(guān)。

圖6 GcvB調(diào)控基因在不同基因型菌株中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平

3 討論

Red同源重組技術(shù)常被應(yīng)用于對(duì)細(xì)菌進(jìn)行染色體基因定點(diǎn)修飾，該技術(shù)可精確地實(shí)現(xiàn)基因敲除、敲入及各種突變體的引入[13]。通常用抗性基因?qū)⒃瓉?lái)的基因替換而達(dá)到敲除目的，進(jìn)一步引入可表達(dá)FLP酶的質(zhì)粒通過(guò)識(shí)別抗性基因兩側(cè)的FRT位點(diǎn)酶切抗性基因序列達(dá)到去除篩選基因目的，而這將留下一段30個(gè)核苷酸長(zhǎng)的FRT序列[14]。為分析STM LT2 GcvB R1、R2和R3在所調(diào)控基因中是否發(fā)揮作用，本試驗(yàn)在gcvB基因下游引入抗性基因，成功構(gòu)建STM LT2gcvBΔR1、STM LT2gcvBΔR1 STM LT2gcvBΔR2和STM LT2gcvBΔR3菌株，測(cè)序結(jié)果表明各菌株gcvB基因除功能區(qū)被刪除外完整性未被改變，實(shí)現(xiàn)了基因的無(wú)痕敲除。

sRNAGcvB為反式編碼RNA，通常與靶標(biāo)形成10～25個(gè)堿基對(duì)的sRNA-mRNA雙鏈結(jié)構(gòu)，而GcvB與mRNA的結(jié)合區(qū)域目前已鑒定的有R1、R2和R3，3個(gè)功能基序通常以1個(gè)或以上與靶mRNA結(jié)合[15]。LALAOUNA等[9]認(rèn)為，已鑒定的GcvB靶基因中，79%通過(guò)核糖體結(jié)合位點(diǎn)(ribosome binding site，RBS)與GcvB結(jié)合，15% 以CDS上游區(qū)域與GcvB作用，6%則以CDS下游區(qū)域作為GcvB靶位點(diǎn)。大多數(shù)情況GcvB通過(guò)干擾30S核糖體亞基結(jié)合來(lái)阻斷翻譯起始[16]。此外，GcvB也通過(guò)封閉翻譯增強(qiáng)子原件(富含C/A的序列)而有效抑制翻譯[7,17]。最近的研究證明，GcvB與mRNA配對(duì)并募集Rnase E來(lái)促進(jìn)mRNA降解，這解釋了本研究中dppA、oppA、yifK和STM4351基因在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生不同變化的原因。這4個(gè)基因是已被驗(yàn)證的GcvB直接調(diào)控靶標(biāo)，均與沙門(mén)菌氨基酸攝取有關(guān)，gcvB基因的敲除均使它們?cè)诘鞍姿桨l(fā)生顯著上調(diào)變化[7,17]。而本研究中dppA和yifK基因在gcvB敲除后轉(zhuǎn)錄水平與蛋白水平均顯著上調(diào)，同樣的處理，oppA和STM4351基因轉(zhuǎn)錄水平卻未發(fā)生改變，而GcvB是轉(zhuǎn)錄后調(diào)控sRNA，分析認(rèn)為這是GcvB不同的作用方式產(chǎn)生的結(jié)果，GcvB對(duì)dppA和yifK基因的作用機(jī)理或許為募集RNase E使其降解，對(duì)oppA和STM4351基因則通過(guò)封閉mRNA翻譯功能區(qū)阻礙翻譯的進(jìn)行但不使mRNA降解，可能封閉30S核糖體亞基結(jié)合區(qū)域、富含C/A增強(qiáng)子區(qū)域或其它未被探明的序列，具體作用機(jī)理有待深入研究。

一直以來(lái)，對(duì)GcvB靶基因的挖掘主要局限于受其負(fù)調(diào)控的基因，而研究發(fā)現(xiàn)，沙門(mén)菌gcvB基因敲除后轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào)的基因接近8%，當(dāng)中相信還有許多未知正調(diào)控靶標(biāo)及作用機(jī)理未被揭示[18]?，F(xiàn)在已經(jīng)記錄了一些sRNA正調(diào)控mRNA激活翻譯和穩(wěn)定mRNA的例子，如sRNA SgrS與靶mRNA pldB堿基互補(bǔ)配對(duì)使RNase E識(shí)別序列被SgrS隔離從而避免mRNA被降解；同樣sRNA CsrA與大腸桿菌中的fhlDC mRNA的相互作用通過(guò)獨(dú)立于任何輔助sRNA的機(jī)制保護(hù)轉(zhuǎn)錄本不受RNase E的降解也是sRNA正向調(diào)控靶基因的例子[19]。本研究熒光定量PCR結(jié)果中fhuA、aphA、STM2714、STM0298、STM1827、STM0276、exbD和sodA基因分別與沙門(mén)菌的外膜蛋白受體/亞鐵蛋白、大腸菌素M和噬菌體(T1、T5及phi80)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、非特異性酸性磷酸酶/B類(lèi)磷酸轉(zhuǎn)移酶、Fels-2噬菌體蛋白、推定整合酶核心結(jié)構(gòu)域蛋白、假定的雙鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶/磷酸二酯酶、推測(cè)的胞質(zhì)蛋白、腸螯合素的攝取和超氧化物歧化酶相關(guān)，這8個(gè)基因在轉(zhuǎn)錄水平均下調(diào)，對(duì)GcvB相應(yīng)功能區(qū)進(jìn)行敲除后也出現(xiàn)與gcvB基因完全敲除時(shí)一樣的轉(zhuǎn)錄水平變化，預(yù)示GcvB對(duì)這些基因進(jìn)行直接的正向調(diào)控，并推測(cè)GcvB R1、R2和R3對(duì)fhuA、aphA、STM2714、STM0298和STM1827基因發(fā)揮調(diào)控作用，R1和R2對(duì) STM0276、exbD和sodA基因發(fā)揮調(diào)控作用，而這種調(diào)控機(jī)制可能是由于GcvB功能基序與RNase E競(jìng)爭(zhēng)和mRNA的結(jié)合區(qū)域?qū)е耺RNA無(wú)法被核酸酶降解。