華 威，孫莎莎 ，許 浩，林生嶺

(江蘇科技大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，鎮(zhèn)江 212100)

表面增強(qiáng)拉曼散射是指待測物分子吸附于粗糙貴金屬表面，在入射激光的照射下，其拉曼散射信號獲得顯著增強(qiáng)的光學(xué)現(xiàn)象[1].SERS光譜不僅提供分子的振動指紋信息，而且具有穩(wěn)定性好、水干擾小、可猝滅熒光、分辨率高、探測靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，因此廣泛應(yīng)用于環(huán)境污染物、食品安全、生物醫(yī)藥等有害分子的檢測[2-8].貴金屬納米粒子(Au、Ag)作為拉曼增強(qiáng)最常用的納米粒子，在光場照射下能夠激發(fā)局域表面等離子體共振，但銀納米顆粒具有較強(qiáng)的生物毒性，在空氣中極易氧化等限制了其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展[9].相比之下，金納米顆粒盡管拉曼增強(qiáng)效果略弱，但生物相容性好、合成步驟簡單等特點(diǎn)使其在光熱治療、生物分子檢測、成像等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[10-12].由于貴金屬納米粒子易于發(fā)生聚集現(xiàn)象使得穩(wěn)定性和重復(fù)性較差，因此制備一種具有優(yōu)良增強(qiáng)活性、良好穩(wěn)定性、生物相容性好的新型活性基底成為SERS研究的熱點(diǎn)之一.絲素蛋白具有良好的可加工性、可降解性、機(jī)械穩(wěn)定性和生物相容性被廣泛應(yīng)用于組織修復(fù)、植入式生物傳感器[13-15].由于絲纖維上的酪氨酸基團(tuán)可以將金離子還原成金納米顆粒，科研工作者利用原位合成方法將絲素蛋白作為穩(wěn)定劑和還原劑在絲素纖維表面生成金納米顆粒用于SERS痕量分析[16-17].文中主要采用原位合成和物理混合兩種方法制備金納米復(fù)合絲素膜(AuNPs-SF)，通過比較金納米復(fù)合絲素膜形貌和結(jié)構(gòu)等，探討不同合成方法的SERS效應(yīng).

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 儀器及試劑

藥品均為商品化分析純試劑，蠶繭由江蘇科技大學(xué)蠶業(yè)研究所提供，去離子水實(shí)驗(yàn)室自行制備.

結(jié)構(gòu)和形貌在X射線衍射儀(XRD)(理學(xué)公司，日本)，場發(fā)射掃描電子顯微鏡(ZEISS，德國，蔡司公司)和紫外-可見分光度計(UV-2550，日本，島津公司)上進(jìn)行，SERS效應(yīng)在拉曼光譜儀(HR800，日本，掘廠公司)上進(jìn)行.

1.2 絲素膜的制備

蠶繭剪成小塊，0.02 mol/L Na2CO3水溶液煮沸30 min去除絲膠蛋白.然后用去離子水沖洗3～5次，鋪平，于60 ℃烘箱中干燥.脫膠后的絲素蛋白置于9.3 mol/L LiBr溶液60 ℃ 4 h溶解.溶解后的絲素蛋白溶液放置于透析袋(截留分子量3500 KDa)透析72 h，每4 h換一次水.透析后的絲素蛋白溶液9 000 r/min離心20 min，除去未溶解的絲素聚集體.將2 mL蠶絲溶液與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%甘油混合均勻在60 ℃條件下4～5 h澆鑄成絲素膜(SF).

1.3 原位合成制備金納米復(fù)合絲素膜

1.3.1 一步合成法

將絲素膜在1 mmol/L氯金酸(HAuCl4)溶液中85 ℃加熱75 min.反應(yīng)結(jié)束后沖洗干燥，得到金納米絲素復(fù)合膜1(AuNPs-SF1).

1.3.2 兩步合成法

將絲素膜浸泡在含1% HAuCl4浸漬液的30 mL去離子水溶液中，4 ℃冰箱中反應(yīng)24 h.24 h后，絲素膜和混合液在75 ℃下反應(yīng)4 h.反應(yīng)結(jié)束后沖洗干燥，得到金納米絲素復(fù)合膜2(AuNPs-SF2).

1.4 物理混合制備金納米復(fù)合絲素膜

制備30 nm金納米顆粒：將0.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的HAuCl4·3H2O溶液加入到50 mL水中，攪拌并加熱至沸騰，然后在攪拌下快速加入0.65 mL 1%的檸檬酸三鈉水溶液，持續(xù)加熱煮沸15 min.冷卻至室溫，得到酒紅色金納米顆粒.將金納米顆粒與含3% 甘油的絲素蛋白溶液混合均勻后澆膜，得到金納米絲素復(fù)合膜3(AuNPs-SF3).

2 結(jié)果與討論

2.1 絲素膜改性

由于甘油吸濕性強(qiáng)，與蠶絲蛋白結(jié)合后使其變得柔軟而富有彈性，圖1為純絲素膜和分別添加1%、3%、5%甘油的絲素膜力學(xué)性能測試.根據(jù)圖1發(fā)現(xiàn)未添加甘油的絲素膜應(yīng)力應(yīng)變曲線屬于典型的脆性斷裂，而添加3%甘油后大大提高了絲素膜的柔韌性，這說明甘油起到了增塑劑的作用[18-19].同時由于甘油的加入，絲素膜構(gòu)象由無規(guī)線團(tuán)向β-折疊轉(zhuǎn)變，發(fā)現(xiàn)含3% 甘油的絲素膜既保持透明性，又具有較低的含水率.因此適于制備金納米復(fù)合絲素膜.

圖1 純絲素膜和添加甘油絲素膜的應(yīng)力-應(yīng)變曲線Fig.1 Stress-strain curves of pure SF and SF containing glycerol

2.2 金納米復(fù)合絲素膜形貌結(jié)構(gòu)分析

圖2為絲素膜和金納米復(fù)合絲素膜的掃描電鏡圖及自然光下的圖片.由圖2(a)清楚觀察到改性后絲素膜為表面光滑的透明薄膜，這與SEM圖結(jié)果一致.采用原位合成方法成功在絲素膜上合成出金納米顆粒.由圖2(b)觀察到在自然光下絲素膜從透明變?yōu)辄S色，SEM圖顯示絲素膜表面合成的金納米顆粒分布不均，還有一些團(tuán)聚在一起，形成不規(guī)則形狀.而圖2(c)中金納米顆粒大小一致、分布均勻，平均粒徑約為30 nm.插入圖顯示自然光下整張膜呈酒紅色.這說明以絲素蛋白為還原劑，通過還原HAuCl4·xH2O在絲素膜表面成功合成出分散良好的金納米顆粒.由于物理混合，從圖2(d)看到合成好的金納米顆粒被包裹在絲素膜內(nèi)部.

圖2 絲素膜和金納米復(fù)合絲素膜的SEM圖Fig.2 SEM images of SF and AuNPs-SF

圖3為絲素膜和AuNPs-SF2的XRD譜圖.改性后絲素膜(圖3(b))顯示出強(qiáng)衍射峰(2θ=20.70°)，弱衍射峰(2θ=24.50°)和兩個肩衍射峰(2θ=28.8°和40.00°).

圖3 絲素膜和AuNPs-SF2的XRD譜圖Fig.3 XRD spectra of the SF and AuNPs-SF2

這些XRD衍射峰歸屬于絲素蛋白的β-折疊結(jié)構(gòu)，表明添加3%甘油后的絲素膜具有高結(jié)晶度.與絲素膜相比，用原位合成方法制備的AuNPs-SF2XRD圖譜中出現(xiàn)4個新的XRD峰，分別為2θ=38.40°，44.60°，64.80°和77.80°，這歸因于(111)，(200)，(220)和(311)金的面心立方結(jié)構(gòu)[20].這些結(jié)果還證明了在絲素膜上成功合成金納米顆粒.此外，在原位合成金納米顆粒后，絲素膜的XRD特征峰沒有發(fā)生明顯變化表明在反應(yīng)過程中絲素膜的晶體結(jié)構(gòu)始終保持不變.

從圖4可以看出，與絲素膜相比，制備的金納米復(fù)合絲素膜均有明顯的吸收峰.與SEM和XRD結(jié)果一致，證明絲素膜表面存在金納米顆粒.AuNPs-SF2的UV-vis 吸收光譜顯示出一個單一的吸收帶位于535 nm處，這是球形金納米顆粒的局域等離子體共振(LSPR)引起的.而AuNPs-SF1肩帶的出現(xiàn)表明在絲素膜上原位合成的金納米顆粒具有各向異性[21].

圖4 絲素膜和金納米復(fù)合絲素膜的紫外-可見吸收光譜Fig.4 UV-vis absorption spectra of the SF and AuNPs-SF

2.3 金納米復(fù)合絲素膜SERS效應(yīng)研究

對樣品進(jìn)行拉曼表征，用4-MBA常作為SERS效應(yīng)的探測分子，因?yàn)槠渚哂忻黠@的拉曼峰.用1 mmol/L的4-MBA浸泡樣品12 h，4-MBA中的巰基與金原子形成配位鍵(金原子提供空軌道，巰基提供孤對電子)，單分子層吸附到金結(jié)構(gòu)表面，之后用乙醇清洗基板表面將多余的4-MBA除去.最后用拉曼光譜儀進(jìn)行表征.圖5為絲素膜和不同方法制備金納米復(fù)合絲素膜的拉曼光譜圖.與絲素膜的拉曼光譜圖5(a)相比，圖5(b)金納米顆粒容易發(fā)生團(tuán)聚生成不規(guī)則形狀的大尺寸顆?；钚暂^低，因此并未檢測到明顯的拉曼信號.而AuNPs-SF2(圖5(c))作為拉曼增強(qiáng)基底時出現(xiàn)明顯的峰值，增強(qiáng)了約100倍，說明其具有良好的拉曼增強(qiáng)效果.這是因?yàn)榻鸺{米顆粒在絲素膜上緊密排列，相鄰的金納米顆粒之間形成“熱點(diǎn)”，強(qiáng)烈的電磁場使得拉曼散射得到增強(qiáng).如圖5(c)所示，1 613 cm-1處的峰值歸因于C-C和C-S鍵的拉伸模式，絲素蛋白的β-折疊結(jié)構(gòu)造成1 724 cm-1處的峰值，CH2的搖擺振動造成875 cm-1處的弱峰，C-H鍵的彎曲產(chǎn)生1 089 cm-1和1 103 cm-1處的兩個弱峰，1 276 cm-1處的弱峰是因?yàn)镃-O-C的不對稱拉伸.圖5(d)中由于金納米顆粒被包裹在絲素膜內(nèi)部不能與4-MBA形成配位鍵，而未表現(xiàn)出SERS效應(yīng).拉曼光譜結(jié)果表明金納米顆粒的活性不僅與所處位置有關(guān)，而且與絲素膜表面金納米顆粒的形貌有關(guān).

圖5 絲素膜和金納米復(fù)合絲素膜的拉曼光譜圖Fig.5 Raman Spectra of the SF and AuNPs-SF

3 結(jié)論

文中首先采用添加甘油對絲素膜進(jìn)行改性，促進(jìn)β-折疊的形成，提高其結(jié)晶度.通過物理混合和原位合成的方法將絲素膜與金納米顆粒結(jié)合在一起.物理混合將金納米顆粒包裹在絲素膜內(nèi)部，無明顯的SERS效應(yīng).而采用原位合成法均可在改性后的絲素膜表面合成出金納米顆粒.用4-MBA作為SERS效應(yīng)的探測分子，拉曼光譜顯示只有兩步合成法制備的AuNPs-SF2具有良好的SERS效應(yīng).AuNP-SF2表面金納米顆粒分布均勻，平均粒徑約為30 nm，紫外-可見特征吸收峰出現(xiàn)在535 nm處，合成過程中未改變絲素膜的結(jié)構(gòu).金納米顆粒和改性后的絲素膜都具有良好的生物相容性，未來在生物檢測方向具有巨大的發(fā)展?jié)摿?