陳進(jìn)城，何 堅，張圓芳，陳樂春，江 煜，張幻真，蔣晶晶，林志剛*，陳水金

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院，福建 福州350003；2.福建省康復(fù)技術(shù)重點實驗室，福建 福州350003；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，福建 福州350122；4.湖州市南潯區(qū)人民醫(yī)院，浙江 湖州313000）

據(jù)研究數(shù)據(jù)統(tǒng)計，頸痛（neck pain，NP）是全球常見的骨骼肌肉疾病，是全球第四大致殘障原因，NP發(fā)病率約16.2%［1-2］。頸型頸椎病（neck type of cervical spondylosis，NTCS）是NP中最常見疾病之一，NTCS的發(fā)病率逐年增高，并出現(xiàn)了顯著年輕化的趨勢，患病率高、持續(xù)時間長，并導(dǎo)致一系列心理和社會問題，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，給社會造成一定程度的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，是醫(yī)學(xué)界關(guān)注的焦點［3-4］。研究表明，NTCS的主要病理性改變是頸部局部肌肉痙攣、水腫及炎癥浸潤等［5］。推拿治療作為一種外治法，在治療患者疼痛時顯示出其具有簡、便、驗、廉、副作用少等諸多優(yōu)點。本研究通過觀察造模前、造模后及治療后各組NTCS兔炎性痛閾值及血清、背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglion，DRG）中TNF-α、IL-1β、IL-6炎癥因子的影響，從神經(jīng)電生理及分子生物學(xué)的角度，探討了推拿治療NTCS的可能機(jī)制，為臨床上運用推拿治療NTCS鎮(zhèn)痛機(jī)制提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物6月齡新西蘭大白兔40只，雌雄各半，體質(zhì)量3.0～3.5 kg，由福建中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供。合格證號：SYXK（閩）2019-0007。按照實驗動物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)常規(guī)飼養(yǎng)，動物自由進(jìn)食和飲水，其飼養(yǎng)過程條件均一致。

1.2 主要儀器與試劑 無線觸覺力按摩指套（日本FingerTPS公司）；頸椎病兔固定器（蘇州市蘇杭科技器材有限公司）；高速冷凍離心機(jī)（美國Beckman公司）；TNF-α、IL-1β、IL-6的ELISA檢測試劑盒（武漢基因美生物科技有限公司）；PBS溶液（美國Hyclone公司）；微量移液器（德國Eppendorf公司）。

2 實驗方法

2.1 造模 采用隨機(jī)數(shù)字表法將新西蘭大白兔隨機(jī)分為空白組、模型組、觸摸組、推拿手法組，每組各10只。適應(yīng)性常規(guī)飼養(yǎng)1周后，參照文獻(xiàn)［6-7］，模型組、觸摸組、推拿手法組采用低頭位兔頸后部敷冰塊或自制冰袋刺激的方法建立兔NTCS模型，具體操作方法如下：將家兔置于固定器當(dāng)中，兔低頭屈曲45°，使其后頸部肌肉呈牽拉狀態(tài)，在后頸部位敷上自制的保濕冰袋，并將吹風(fēng)機(jī)出風(fēng)口對著兔頸部吹。每次操作2 h，每日2次，連續(xù)造模4周。每天操作結(jié)束后，將各組家兔放回籠中，常規(guī)單籠飼養(yǎng)，自由飲食?？瞻捉M家兔在其他組造模期間同時置于兔子固定盒中，允許其頸部處于自由活動狀態(tài)，不做任何其他干預(yù)。

模型評估：①造模后，除空白組外，其余各組兔血清炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)水平升高者為造模成功；②模型兔頸后肌硬度改變，出現(xiàn)條索狀結(jié)節(jié)情況；③組織形態(tài)學(xué)改變，包括頸后肌肌細(xì)胞形態(tài)、肌原纖維排列及炎癥細(xì)胞出現(xiàn)等情況。

2.2 干預(yù) 造模4周后進(jìn)行干預(yù)，推拿手法組采用推拿按揉法：先將兔置于推拿固定床15 min，適應(yīng)環(huán)境，施術(shù)者拇指帶上無線觸覺力按摩指套，拇指羅紋面置于兔大椎穴（第七頸椎棘突下凹陷處），進(jìn)行按揉，按揉力度最大為10 N，頻率為120次／min。觸摸組采用手指撫摸法：先將兔置于推拿固定床15 min，適應(yīng)環(huán)境，拇指帶上無線觸覺力按摩指套，拇指羅紋面對兔大椎穴進(jìn)行節(jié)律性撫摸，力度最大為0.5 N，頻率為120次／min。每日操作1次，每次10 min，連續(xù)干預(yù)18 d?？瞻捉M、模型組不做任何干預(yù)。

2.3 取材 各組兔子取血液后，用10 mL型號注射器吸入7～10 mL容量的空氣，用耳緣靜脈空氣栓塞處死兔子，快速在兔后頸部皮下經(jīng)筋起止點附近觸及到條索狀、硬結(jié)、有摩擦感的部位剪取肌肉組織，大致在下頸段頸3～6棘突旁約1 cm處，取肌肉組織約1 cm3（避免過度用力鉗夾）。

2.4 觀察指標(biāo)及方法

2.4.1 一般情況觀察 觀察家兔實驗期間的一般狀況，如毛色、飲食、活動等情況變化。

2.4.2 兔頸后肌肉硬度變化 觀察各組家兔在造模和治療過程中肌肉硬度的變化及有無條索狀。

2.4.3 痛閾值測定 參照文獻(xiàn)［8］測量痛閾值的方法，設(shè)電刺頻率400 Hz，持續(xù)時間10 s，電流從0 mA逐漸加大，大白兔出現(xiàn)嘶叫時的電流值記錄為痛閾值。于造模前、造模完成后、治療后均測取2次，每次間隔時間20 s，計算平均值記錄并比較。

2.4.4 血清炎性因子的測定 于造模結(jié)束后第2天和治療后第2天這兩個時間點，兔盒固定兔子后，對所有兔用一次性采血針進(jìn)行耳緣靜脈采血。血液置于采血管內(nèi)，并及時置于4℃環(huán)境下離心，然后吸取上清，做好標(biāo)記，并置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用酶?biāo)儀檢測炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)水平。

2.4.5 DRG炎性因子的測定 分別于造模結(jié)束后第2天和治療后第2天處死兔子，并迅速取出兔子右側(cè)C6、C7、T1的DRG。置于管內(nèi)，并及時置于4℃環(huán)境下離心，然后取得上清液，做好標(biāo)記，并置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。測定DRG中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)水平變化，酶標(biāo)儀檢測［9］。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，組間比較采用單因素方差進(jìn)行分析，若方差齊采用LSD方法，方差不齊采用Games-Howell方法；不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗方法。

3 結(jié) 果

3.1 一般情況 各組大白兔在造模前毛色有光澤、反應(yīng)靈敏、活動度與飲食可；造模期間，模型組、觸摸組、推拿手法組大白兔逐漸出現(xiàn)毛色變黯、反應(yīng)稍遲鈍、活動度與飲食均減少，體質(zhì)量增長速度較正常組緩慢；治療期間，推拿手法組大白兔一般情況逐漸改善，體質(zhì)量增長速度較模型組加快。

3.2 兔頸后肌肉硬度變化情況 空白組大白兔頸后部肌肉柔軟有彈性，未觸及肌肉里有明顯的條索或硬結(jié)。模型組、觸摸組、推拿手法組大白兔造模結(jié)束時頸后肌肉明顯，呈條索狀肌痙攣；治療后推拿手法組較模型組頸肌條索明顯變少，顯著改善。

3.3 4組大白兔造模前、造模后、治療后痛閾值比較 見表1。

表1 4組大白兔造模前、造模后、治療后痛閾值比較（±s）mA

表1 4組大白兔造模前、造模后、治療后痛閾值比較（±s）mA

注：與造模前比較，1）P＜0.05；與造模后比較，2）P＜0.05；與空白組比較，3）P＜0.05；與模型組比較，4）P＜0.05；與觸摸組比較，5）P＜0.05。

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3.4 4組大白兔血清TNF-α、IL-1β、IL-6濃度比較 見表2。

表2 4組大白兔血清TNF-α、IL-1β、IL-6濃度比較（±s）pg／mg

表2 4組大白兔血清TNF-α、IL-1β、IL-6濃度比較（±s）pg／mg

注：與空白組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05；與觸摸組比較，3）P＜0.05。

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3.5 4組大白兔DRG中TNF-α、IL-1β、IL-6炎癥因子濃度比較 見表3。

表3 4組大白兔DRG中TNF-α、IL-1β、IL-6濃度比較（±s）pg／mg

表3 4組大白兔DRG中TNF-α、IL-1β、IL-6濃度比較（±s）pg／mg

注：與空白組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05；與觸摸組比較，3）P＜0.05。

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4 討 論

有關(guān)炎性痛的機(jī)制研究一直是疼痛及神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點之一。炎性痛是臨床常見的病理性疼痛類型，其主要表現(xiàn)為持續(xù)性的痛覺過敏，如常見的頸型頸椎病、骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肩袖損傷［10-11］?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為，NTCS屬于頸椎病發(fā)病的早期表現(xiàn)，多見于青中年人群，也可稱局部型頸椎病。NTCS是由于頸椎間盤退行性變的早期，頸肌防御性痙攣，其主要臨床表現(xiàn)為頸肩部疼痛不適感及活動受限［12-13］。NTCS頸痛的發(fā)生與炎癥因子密切相關(guān)，是常見炎性痛病癥之一［5，14］。

推拿具有疏經(jīng)通絡(luò)、理氣活血化瘀等作用，能有效緩解疼痛、消除腫脹，促進(jìn)肌肉骨骼功能的康復(fù)［15-16］。推拿手法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于NTCS的治療［17-18］，但其起效作用機(jī)制的實驗研究還較薄弱，制約了推拿學(xué)科的進(jìn)一步發(fā)展。因此，研究和揭示中醫(yī)推拿手法對NTCS的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)其鎮(zhèn)痛的關(guān)鍵靶點是較為重要的問題。

采用低頭架固定建立頸型頸椎病動物模型的方法不僅操作較為簡便，且具有無創(chuàng)傷性的優(yōu)勢，沒有損傷所觀察組織，有利于后期進(jìn)行干預(yù)和探討推拿取效機(jī)制的研究［6-7］。本實驗在造模過程中發(fā)現(xiàn)模型組、觸摸組、推拿手法組大白兔有搔抓后頸部的動作，且越來越頻繁，說明大白兔有頸部不適的癥狀表現(xiàn)，同時結(jié)合痛閾值和炎癥因子指標(biāo)也驗證了此種造模方法是成功的；干預(yù)過程中推拿手法組兔搔抓后頸部的動作頻率漸漸降低，說明推拿手法治療能使家兔頸痛逐漸減輕。但僅通過觀察家兔行為方面的變化，無法依據(jù)量化評估治療效果，故本實驗通過檢測痛閾方法判定兔頸部疼痛程度的變化情況［8］。本研究在應(yīng)用儀器檢測家兔痛閾變化時，隨著電流的緩慢變大，先出現(xiàn)掙扎擺頭動作，接著出現(xiàn)嘶叫聲，本研究將嘶叫時的電流值作為標(biāo)準(zhǔn)，每次測量均量取2次，以平均值記錄為痛閾值。說明推拿手法能通過抑制血清及DRG中炎癥因子的表達(dá)提高家兔疼痛閾值，減輕家兔頸部疼痛，效果明確。

NTCS是頸椎病發(fā)病過程中早期的病理、生理學(xué)改變，由于頸椎相關(guān)肌肉發(fā)生損傷后出現(xiàn)痙攣，導(dǎo)致周圍軟組織產(chǎn)生炎癥反應(yīng)而出現(xiàn)滲血、水腫、炎癥浸潤及粘連等，而TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子所致生物化學(xué)平衡的破壞是發(fā)病的主要原因［19］。何堅［5］通過檢測NTCS兔模型血清中相關(guān)炎癥因子的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)造模后NTCS模型兔炎癥因子的表達(dá)均顯著升高，證實NTCS的發(fā)生、發(fā)展與炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá)有著密切的聯(lián)系?；瘜W(xué)刺激是導(dǎo)致疼痛出現(xiàn)的重要因素之一，減弱炎性因子表達(dá)水平能減輕疼痛［20］。說明推拿手法這種治療方法可以抑制NTCS家兔血清及DRG中炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá)，減輕組織滲血、水腫、炎癥浸潤及粘連，進(jìn)而提高家兔疼痛閾值，減輕家兔頸部疼痛。

綜上所述，推拿手法可以減輕NTCS家兔頸部疼痛的癥狀，其作用機(jī)制可能與抑制TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子的表達(dá)密切有關(guān)。