劉 建 ，鄒 輝 ，羅志文 ，李愛民 ，呂培茹 ，劉紅波 ，鞠翠芳 ，岳慧潔 ，劉 燊 *，王 闖 ，3

（1.江西正邦養(yǎng)殖有限公司，江西 南昌 330096；2.河南創(chuàng)源生物技術(shù)有限公司，河南 鄭州 451475 ；3.江西正邦農(nóng)業(yè)科學(xué)院，江西 南昌 330096）

動物育種主要有三項內(nèi)容，一是純種選育，二是雜交利用，三是新品種培育[1]，其中在豬的繁育體系中，最常見的是杜洛克、長白、大白等的純種豬選育與“杜長大”雜交模式。常規(guī)育種通過有性繁殖方式進行，基因往下游傳遞的周期長、資金成本高，培育效率低。豬體細胞核移植，又稱克隆，是一種無性繁殖技術(shù)，可以大規(guī)模復(fù)制生產(chǎn)性能優(yōu)秀的種豬，從而加快群體的擴繁和遺傳改良進程[2-3]。然而，豬的克隆技術(shù)還存在諸多問題，例如整體效率偏低，出生易畸形，后期存活困難等，雖有不少單位在嘗試種公豬克隆技術(shù)應(yīng)用[4-5]，但離生產(chǎn)上規(guī)?；瘧?yīng)用還有一定差距。此次試驗將常規(guī)育種與克隆技術(shù)相結(jié)合，將克隆豬應(yīng)用于純種擴繁，以評估克隆豬自身及其后代的生產(chǎn)性能，為克隆杜洛克種公豬在生豬產(chǎn)業(yè)上的應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

研究中，細胞建系、重構(gòu)胚生產(chǎn)等在河南創(chuàng)源生物技術(shù)有限公司完成，胚胎移植、生產(chǎn)性能測定等在江西正邦養(yǎng)殖有限公司某原種豬場完成。

1.1 試驗材料

供體豬是根據(jù)父系指數(shù)、達100 kg體重日齡、體型指標等篩選得到的2頭性能優(yōu)秀的杜洛克公豬（DDZBBK517006801和DDZBBK516084606），胚胎移植受體母豬為純種長白母豬，與配母豬為杜洛克擴繁群母豬。

根據(jù)父系指數(shù)、達100 kg體重日齡、體型等生產(chǎn)性能指標，選擇2頭杜洛克公豬（DDZBBK517006801和DDZBBK516084606）作為候選公豬，建立細胞系，其信息見表1。

表1 供體杜洛克種公豬生產(chǎn)性能

細胞建系試劑盒、胚胎培養(yǎng)與操作試劑盒等由河南創(chuàng)源生物技術(shù)有限公司配置，相關(guān)試劑、藥品除特別注明外，均購自Sigma公司。

主要儀器和耗材有：體式顯微鏡（Nikon）、超低溫冰箱（中科都菱）、顯微操作儀（Nikon）、電融合儀（ECM-2001）、豬活體保定電子籠秤（TCS-300）、超聲測膘儀（My Lab Touch）等；12孔培養(yǎng)板、4孔培養(yǎng)板、15 mL/50 mL離心管等細胞培養(yǎng)耗材均為Corning公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 供體細胞分離培養(yǎng)

采集供體豬耳部組織，4 ℃低溫將樣本帶回實驗室，利用細胞建系試劑盒標準操作流程進行細胞分離培養(yǎng)、凍存和擴增傳代，待供體細胞達到80%匯合度后，抑制1～2 d內(nèi)使用，且供體細胞一般使用1～3代以內(nèi)。

1.2.2 卵母細胞收集和體外成熟

豬卵巢采集于當(dāng)?shù)赝涝讏?，摘取新鮮卵巢并立即置于盛有33～35 ℃生理鹽水的保溫瓶中，3 h內(nèi)送回實驗室，用10 mL注射器（12號針頭）抽吸大約3～7 mL的卵泡液。在顯微鏡下挑選胞質(zhì)均勻的卵母細胞并于Washcome medium P1.0液中洗3次，之后在卵母細胞成熟液Matcome medium P1.0中洗2次并置于4孔培養(yǎng)板中，于38.5 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱體外成熟42～45 h。顯微鏡下挑選成熟好的胞質(zhì)均勻且含有第一極體的卵母細胞備用。

1.2.3 重構(gòu)胚構(gòu)建以及體外發(fā)育測試

在Mancome medium P1.0顯微操作液中用固定針固定MⅡ期卵母細胞，用15～18 μm去核針吸取極體附近的胞質(zhì)，而后，利用活細胞熒光染料Hochest33342進行染色，熒光顯微鏡下挑選成功去核的卵母細胞作為受體胞質(zhì)；在顯微鏡下對細胞大小均勻，折光性好、細胞表面光滑的供體細胞進行透明帶下注射完成胚胎體外構(gòu)建。將構(gòu)建好的重構(gòu)胚置于融合液Fusioncome medium P1.0中，用電融合儀ECM2001進行電融合、激活（場強為100 V/mm，3次脈沖，脈沖時間為30 μs）。之后將融合、激活后的重構(gòu)胚轉(zhuǎn)移到添加細胞松弛素的Blacome medium P1.0胚胎培養(yǎng)液中，CO2培養(yǎng)箱（38.5 ℃、5%CO2）培養(yǎng)3 h，此后再移入Blacome medium P1.0胚胎培養(yǎng)液，克隆胚胎體外培養(yǎng)到0.5～2 d運輸?shù)截i場進行胚胎移植。

1.2.4 克隆胚胎體內(nèi)移植以及克隆豬生產(chǎn)

選擇斷奶3～5 d的代孕母豬，并在代孕母豬發(fā)情高峰期開始后2 d內(nèi)進行胚胎移植，手術(shù)前1 d下午停喂，手術(shù)當(dāng)天將構(gòu)建完成的克隆胚胎置Transcome medium P1.0胚胎移植液中，在12 h內(nèi)將克隆胚胎從輸卵管傘部緩慢注入輸卵管。每頭份克隆胚胎數(shù)量在150～180枚左右，胚齡約為0.5～2 d。術(shù)后受體母豬單欄飼養(yǎng)，連續(xù)5 d注射抗生素以防炎癥發(fā)生，移植后密切觀察愈后情況。分別于胚胎移植后的21～28 d進行第一次孕檢、49～56 d進行第二次孕檢。114 d后，記錄代孕豬分娩頭數(shù)和產(chǎn)仔數(shù)。

1.2.5 精液采集與配種

種豬飼養(yǎng)至8月齡利用假畜臺進行調(diào)教，調(diào)教成功后手工采精。采集的精液樣品立即運輸至實驗室，參照《豬人工授精技術(shù)規(guī)程（NY/T 636-2002）》進行，配種參照江西正邦養(yǎng)殖有限公司《母豬配種技術(shù)規(guī)范》企業(yè)標準進行。

1.2.6 生產(chǎn)性能測定

種豬生產(chǎn)性能測定按照《種豬生產(chǎn)性能測定技術(shù)規(guī)程（NY/T 822-2019）》的規(guī)定，活體背膘厚測定個體重應(yīng)為（100±5）kg；測定時，使用保定器或籠秤將待測個體站立保定于保定器或籠秤中并保持背腰相對平直。

1.3 數(shù)據(jù)分析處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析和多重比較分析（Duncan法），以P＜0.05作為顯著性差異，P＜0.01作為極顯著性差異的判定標準，結(jié)果均采用“平均值±標準差”表示。

2 結(jié)果

2.1 耳組織成纖維細胞系建立

解凍的豬耳組織采取酶消化法分離出原代細胞，分離的細胞培養(yǎng)3 d可見爬出小三角形、梭形細胞，6～8 d呈梭形、三角形的細胞呈優(yōu)勢生長，為典型的成纖維狀，第6～8天細胞匯合度80%以上進行傳代，經(jīng)過消化傳代1次后即可得到富集的成纖維細胞。見圖1。

圖1 杜洛克耳組織細胞建系

2.2 重構(gòu)胚生產(chǎn)與胚胎移植

重構(gòu)胚體外培養(yǎng)1～2 d后，并在胚胎移植前對克隆胚胎進行鏡檢，可見部分胚胎已經(jīng)卵裂，如圖2。挑選形態(tài)和發(fā)育較好的胚胎進行移植，自然發(fā)情第1天或第2天的母豬用作受體（以出現(xiàn)壓背靜立反射為發(fā)情的第0天），移植方法為手術(shù)法輸卵管深部移植。胚胎移植后28 d，進行超聲波妊娠檢測。

圖2 杜洛克耳細胞作為核供體生產(chǎn)的重構(gòu)胚

2.3 供核種公豬的生產(chǎn)性能分析

供核公豬DDZBBK516084606分別由3頭母豬代孕（LLZBBK616004011、LLZBBK617002109和LLZBBK617003411），共產(chǎn)公仔豬20頭，其中有6頭公豬用于調(diào)教配種；供核公豬DDZBBK517006801分別由4頭母豬代孕（LLCNKG1150L3121、LLZBBK617001605、LLZBBK617001609和LLZBBK617003306），共產(chǎn)公仔豬19頭，其中有4頭公豬用于調(diào)教配種。詳見表2。采集克隆仔豬尾組織與供核公豬、受體母豬等進行盲樣處理，并經(jīng)過50 K基因芯片鑒定親緣關(guān)系，證明克隆豬與供核公豬基因型一致，與受體母豬無親緣關(guān)系。

表2 克隆種公豬及后代的存活 頭

存活的10頭公豬進行性狀分析，克隆豬初生重1.57±0.38 kg、斷奶重6.85±1.51 kg、校正體重100 kg日齡157.07±6.54 d，校正背膘厚8.84±1.82 mm，左乳頭數(shù)6.40±0.69個，右乳頭數(shù)6.20±0.42個，與同時期的普通杜洛克公豬均無顯著性差異（表3）。與其供核公豬相比，校正100 kg體重日齡的天數(shù)相差較大（157.07±6.54 d Vs 132.8、138.8 d）。

表3 克隆公豬與同期普通杜洛克公豬性狀比較

2.4 克隆豬后代的生產(chǎn)性能

10頭克隆公豬調(diào)教完成后，2頭用于正常生產(chǎn)，8頭出現(xiàn)少精、密度稀、活力差等現(xiàn)象被淘汰。配種后，獲得的59頭克隆公豬后代，其初生重1.61±0.33 kg、斷奶重7.65±1.65 kg、校正100 kg體重日齡159.26±8.27 d，校正背膘厚9.41±1.47 mm，與同時期的普通公豬后代均無顯著性差異。后代按性別分組，克隆公豬與普通公豬所產(chǎn)的公豬和母豬，其相關(guān)性能指標也無顯著性區(qū)別。僅在右乳頭數(shù)指標上，克隆公豬后代（6.34±0.48個）顯著低于普通公豬后代（6.60±0.66個）。詳見表4。

表4 克隆公豬后代與同期普通杜洛克公豬后代性狀比較

3 討論

自1997年體細胞克隆羊“多莉”成功之后，2000年P(guān)olejaeva等首例體細胞克隆豬[6]，同年Onishi等和Betthauser等也相繼得到了體細胞克隆豬[7-8]。豬克隆技術(shù)誕生后，在人類疾病模型、抗病豬新品種培育、地方豬品種保護等方面具有巨大的應(yīng)用前景[9]。與常規(guī)選育、全基因組選育技術(shù)相結(jié)合，豬克隆技術(shù)可對優(yōu)秀種豬進行無性復(fù)制擴繁，從而可規(guī)?；瘮U繁生產(chǎn)高生產(chǎn)性能種豬，延伸優(yōu)秀種豬的利用時間和空間，縮短育種年限，加快遺傳進展和提高養(yǎng)殖效益，凸顯其巨大的應(yīng)用潛力，此次試驗基于種公豬的克隆技術(shù)生產(chǎn)克隆豬，并應(yīng)用于實際規(guī)模化的生產(chǎn)中，具有很強的前沿性和經(jīng)濟價值。

然而，截止到目前生產(chǎn)克隆豬的總體效率不到3%，導(dǎo)致了制作克隆豬的成本高，嚴重束縛著克隆種豬的應(yīng)用推廣[10]。為提高克隆豬效率，羅學(xué)明等認為可以選擇早裂的胚胎進行移植，因為初次卵裂時間可以作為豬克隆胚胎發(fā)育潛能的標識[11]；薛振華等優(yōu)化胚胎移植時間，認為最佳移植時期是受體母豬處于排卵期，并獲得了88.89%的情期受胎率（28 d）和68.75%的妊娠分娩率[12]。逯心玉等比較了2頭克隆公豬與供核公豬的情期受胎率、與配母豬繁殖性能（窩產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)、斷奶活仔數(shù)等）、后代仔豬生產(chǎn)性能（初生重、斷奶重、平均日增重等）等指標，顯示其不存在顯著性差異，克隆可以作為種公豬快速擴繁手段，印證了“克隆豬具有正常的繁殖性能，且保留了供體優(yōu)秀的遺傳性能，可以作為優(yōu)秀種公豬進行生產(chǎn)應(yīng)用”觀點[4]。

此次研究選擇2頭100 kg體重日齡140 d以內(nèi)的杜洛克公豬為核供體豬，探討其優(yōu)秀生產(chǎn)性能可否通過克隆進行傳遞。試驗中，獲得10頭調(diào)教成功的克隆公豬，其100 kg體重日齡157.07±6.54 d，明顯低于核供體公豬，與同期杜洛克公豬100 kg體重日齡（156.20±5.23 d）無顯著性差異?？寺」i后代，初生重1.61±0.33 kg、斷奶重7.56±1.65 kg、校正100 kg體重日齡159.26±8.27 d，校正背膘厚9.41±1.47 mm，也與同時期普通杜洛克公豬后代無顯著性差異。同時，背膘厚等性狀上，克隆公豬后代與同時期的其他杜洛克后代比較，各項性狀值均無顯著差異。上述結(jié)果說明，優(yōu)秀的生產(chǎn)性能并沒有通過克隆傳遞給后代，其中原因可能核供體豬選擇不夠準確，也可能是克隆過程影響了生產(chǎn)性能發(fā)揮。

研究建立了種豬克隆快速擴繁技術(shù)平臺，但常規(guī)選育的克隆公豬及其后代生產(chǎn)性能與普通公豬及其后代無顯著差異，需要進一步提高選擇準確性、提高克隆效率及其存活率，才能滿足克隆應(yīng)用于終端公豬生產(chǎn)的產(chǎn)業(yè)要求。