劉 建 ，鄒 輝 ，羅志文 ，李愛民 ，呂培茹 ，劉紅波 ，鞠翠芳 ，岳慧潔 ，劉 燊 *，王 闖 ，3

（1.江西正邦養(yǎng)殖有限公司，江西 南昌 330096；2.河南創(chuàng)源生物技術(shù)有限公司，河南 鄭州 451475 ；3.江西正邦農(nóng)業(yè)科學(xué)院，江西 南昌 330096）

動(dòng)物育種主要有三項(xiàng)內(nèi)容，一是純種選育，二是雜交利用，三是新品種培育[1]，其中在豬的繁育體系中，最常見的是杜洛克、長白、大白等的純種豬選育與“杜長大”雜交模式。常規(guī)育種通過有性繁殖方式進(jìn)行，基因往下游傳遞的周期長、資金成本高，培育效率低。豬體細(xì)胞核移植，又稱克隆，是一種無性繁殖技術(shù)，可以大規(guī)模復(fù)制生產(chǎn)性能優(yōu)秀的種豬，從而加快群體的擴(kuò)繁和遺傳改良進(jìn)程[2-3]。然而，豬的克隆技術(shù)還存在諸多問題，例如整體效率偏低，出生易畸形，后期存活困難等，雖有不少單位在嘗試種公豬克隆技術(shù)應(yīng)用[4-5]，但離生產(chǎn)上規(guī)?；瘧?yīng)用還有一定差距。此次試驗(yàn)將常規(guī)育種與克隆技術(shù)相結(jié)合，將克隆豬應(yīng)用于純種擴(kuò)繁，以評估克隆豬自身及其后代的生產(chǎn)性能，為克隆杜洛克種公豬在生豬產(chǎn)業(yè)上的應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

研究中，細(xì)胞建系、重構(gòu)胚生產(chǎn)等在河南創(chuàng)源生物技術(shù)有限公司完成，胚胎移植、生產(chǎn)性能測定等在江西正邦養(yǎng)殖有限公司某原種豬場完成。

1.1 試驗(yàn)材料

供體豬是根據(jù)父系指數(shù)、達(dá)100 kg體重日齡、體型指標(biāo)等篩選得到的2頭性能優(yōu)秀的杜洛克公豬（DDZBBK517006801和DDZBBK516084606），胚胎移植受體母豬為純種長白母豬，與配母豬為杜洛克擴(kuò)繁群母豬。

根據(jù)父系指數(shù)、達(dá)100 kg體重日齡、體型等生產(chǎn)性能指標(biāo)，選擇2頭杜洛克公豬（DDZBBK517006801和DDZBBK516084606）作為候選公豬，建立細(xì)胞系，其信息見表1。

表1 供體杜洛克種公豬生產(chǎn)性能

細(xì)胞建系試劑盒、胚胎培養(yǎng)與操作試劑盒等由河南創(chuàng)源生物技術(shù)有限公司配置，相關(guān)試劑、藥品除特別注明外，均購自Sigma公司。

主要儀器和耗材有：體式顯微鏡（Nikon）、超低溫冰箱（中科都菱）、顯微操作儀（Nikon）、電融合儀（ECM-2001）、豬活體保定電子籠秤（TCS-300）、超聲測膘儀（My Lab Touch）等；12孔培養(yǎng)板、4孔培養(yǎng)板、15 mL/50 mL離心管等細(xì)胞培養(yǎng)耗材均為Corning公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 供體細(xì)胞分離培養(yǎng)

采集供體豬耳部組織，4 ℃低溫將樣本帶回實(shí)驗(yàn)室，利用細(xì)胞建系試劑盒標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行細(xì)胞分離培養(yǎng)、凍存和擴(kuò)增傳代，待供體細(xì)胞達(dá)到80%匯合度后，抑制1～2 d內(nèi)使用，且供體細(xì)胞一般使用1～3代以內(nèi)。

1.2.2 卵母細(xì)胞收集和體外成熟

豬卵巢采集于當(dāng)?shù)赝涝讏觯⌒迈r卵巢并立即置于盛有33～35 ℃生理鹽水的保溫瓶中，3 h內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室，用10 mL注射器（12號針頭）抽吸大約3～7 mL的卵泡液。在顯微鏡下挑選胞質(zhì)均勻的卵母細(xì)胞并于Washcome medium P1.0液中洗3次，之后在卵母細(xì)胞成熟液Matcome medium P1.0中洗2次并置于4孔培養(yǎng)板中，于38.5 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱體外成熟42～45 h。顯微鏡下挑選成熟好的胞質(zhì)均勻且含有第一極體的卵母細(xì)胞備用。

1.2.3 重構(gòu)胚構(gòu)建以及體外發(fā)育測試

在Mancome medium P1.0顯微操作液中用固定針固定MⅡ期卵母細(xì)胞，用15～18 μm去核針吸取極體附近的胞質(zhì)，而后，利用活細(xì)胞熒光染料Hochest33342進(jìn)行染色，熒光顯微鏡下挑選成功去核的卵母細(xì)胞作為受體胞質(zhì)；在顯微鏡下對細(xì)胞大小均勻，折光性好、細(xì)胞表面光滑的供體細(xì)胞進(jìn)行透明帶下注射完成胚胎體外構(gòu)建。將構(gòu)建好的重構(gòu)胚置于融合液Fusioncome medium P1.0中，用電融合儀ECM2001進(jìn)行電融合、激活（場強(qiáng)為100 V/mm，3次脈沖，脈沖時(shí)間為30 μs）。之后將融合、激活后的重構(gòu)胚轉(zhuǎn)移到添加細(xì)胞松弛素的Blacome medium P1.0胚胎培養(yǎng)液中，CO2培養(yǎng)箱（38.5 ℃、5%CO2）培養(yǎng)3 h，此后再移入Blacome medium P1.0胚胎培養(yǎng)液，克隆胚胎體外培養(yǎng)到0.5～2 d運(yùn)輸?shù)截i場進(jìn)行胚胎移植。

1.2.4 克隆胚胎體內(nèi)移植以及克隆豬生產(chǎn)

選擇斷奶3～5 d的代孕母豬，并在代孕母豬發(fā)情高峰期開始后2 d內(nèi)進(jìn)行胚胎移植，手術(shù)前1 d下午停喂，手術(shù)當(dāng)天將構(gòu)建完成的克隆胚胎置Transcome medium P1.0胚胎移植液中，在12 h內(nèi)將克隆胚胎從輸卵管傘部緩慢注入輸卵管。每頭份克隆胚胎數(shù)量在150～180枚左右，胚齡約為0.5～2 d。術(shù)后受體母豬單欄飼養(yǎng)，連續(xù)5 d注射抗生素以防炎癥發(fā)生，移植后密切觀察愈后情況。分別于胚胎移植后的21～28 d進(jìn)行第一次孕檢、49～56 d進(jìn)行第二次孕檢。114 d后，記錄代孕豬分娩頭數(shù)和產(chǎn)仔數(shù)。

1.2.5 精液采集與配種

種豬飼養(yǎng)至8月齡利用假畜臺進(jìn)行調(diào)教，調(diào)教成功后手工采精。采集的精液樣品立即運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室，參照《豬人工授精技術(shù)規(guī)程（NY/T 636-2002）》進(jìn)行，配種參照江西正邦養(yǎng)殖有限公司《母豬配種技術(shù)規(guī)范》企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

1.2.6 生產(chǎn)性能測定

種豬生產(chǎn)性能測定按照《種豬生產(chǎn)性能測定技術(shù)規(guī)程（NY/T 822-2019）》的規(guī)定，活體背膘厚測定個(gè)體重應(yīng)為（100±5）kg；測定時(shí)，使用保定器或籠秤將待測個(gè)體站立保定于保定器或籠秤中并保持背腰相對平直。

1.3 數(shù)據(jù)分析處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析和多重比較分析（Duncan法），以P＜0.05作為顯著性差異，P＜0.01作為極顯著性差異的判定標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果均采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果

2.1 耳組織成纖維細(xì)胞系建立

解凍的豬耳組織采取酶消化法分離出原代細(xì)胞，分離的細(xì)胞培養(yǎng)3 d可見爬出小三角形、梭形細(xì)胞，6～8 d呈梭形、三角形的細(xì)胞呈優(yōu)勢生長，為典型的成纖維狀，第6～8天細(xì)胞匯合度80%以上進(jìn)行傳代，經(jīng)過消化傳代1次后即可得到富集的成纖維細(xì)胞。見圖1。

圖1 杜洛克耳組織細(xì)胞建系

2.2 重構(gòu)胚生產(chǎn)與胚胎移植

重構(gòu)胚體外培養(yǎng)1～2 d后，并在胚胎移植前對克隆胚胎進(jìn)行鏡檢，可見部分胚胎已經(jīng)卵裂，如圖2。挑選形態(tài)和發(fā)育較好的胚胎進(jìn)行移植，自然發(fā)情第1天或第2天的母豬用作受體（以出現(xiàn)壓背靜立反射為發(fā)情的第0天），移植方法為手術(shù)法輸卵管深部移植。胚胎移植后28 d，進(jìn)行超聲波妊娠檢測。

圖2 杜洛克耳細(xì)胞作為核供體生產(chǎn)的重構(gòu)胚

2.3 供核種公豬的生產(chǎn)性能分析

供核公豬DDZBBK516084606分別由3頭母豬代孕（LLZBBK616004011、LLZBBK617002109和LLZBBK617003411），共產(chǎn)公仔豬20頭，其中有6頭公豬用于調(diào)教配種；供核公豬DDZBBK517006801分別由4頭母豬代孕（LLCNKG1150L3121、LLZBBK617001605、LLZBBK617001609和LLZBBK617003306），共產(chǎn)公仔豬19頭，其中有4頭公豬用于調(diào)教配種。詳見表2。采集克隆仔豬尾組織與供核公豬、受體母豬等進(jìn)行盲樣處理，并經(jīng)過50 K基因芯片鑒定親緣關(guān)系，證明克隆豬與供核公豬基因型一致，與受體母豬無親緣關(guān)系。

表2 克隆種公豬及后代的存活 頭

存活的10頭公豬進(jìn)行性狀分析，克隆豬初生重1.57±0.38 kg、斷奶重6.85±1.51 kg、校正體重100 kg日齡157.07±6.54 d，校正背膘厚8.84±1.82 mm，左乳頭數(shù)6.40±0.69個(gè)，右乳頭數(shù)6.20±0.42個(gè)，與同時(shí)期的普通杜洛克公豬均無顯著性差異（表3）。與其供核公豬相比，校正100 kg體重日齡的天數(shù)相差較大（157.07±6.54 d Vs 132.8、138.8 d）。

表3 克隆公豬與同期普通杜洛克公豬性狀比較

2.4 克隆豬后代的生產(chǎn)性能

10頭克隆公豬調(diào)教完成后，2頭用于正常生產(chǎn)，8頭出現(xiàn)少精、密度稀、活力差等現(xiàn)象被淘汰。配種后，獲得的59頭克隆公豬后代，其初生重1.61±0.33 kg、斷奶重7.65±1.65 kg、校正100 kg體重日齡159.26±8.27 d，校正背膘厚9.41±1.47 mm，與同時(shí)期的普通公豬后代均無顯著性差異。后代按性別分組，克隆公豬與普通公豬所產(chǎn)的公豬和母豬，其相關(guān)性能指標(biāo)也無顯著性區(qū)別。僅在右乳頭數(shù)指標(biāo)上，克隆公豬后代（6.34±0.48個(gè)）顯著低于普通公豬后代（6.60±0.66個(gè)）。詳見表4。

表4 克隆公豬后代與同期普通杜洛克公豬后代性狀比較

3 討論

自1997年體細(xì)胞克隆羊“多莉”成功之后，2000年P(guān)olejaeva等首例體細(xì)胞克隆豬[6]，同年Onishi等和Betthauser等也相繼得到了體細(xì)胞克隆豬[7-8]。豬克隆技術(shù)誕生后，在人類疾病模型、抗病豬新品種培育、地方豬品種保護(hù)等方面具有巨大的應(yīng)用前景[9]。與常規(guī)選育、全基因組選育技術(shù)相結(jié)合，豬克隆技術(shù)可對優(yōu)秀種豬進(jìn)行無性復(fù)制擴(kuò)繁，從而可規(guī)?；瘮U(kuò)繁生產(chǎn)高生產(chǎn)性能種豬，延伸優(yōu)秀種豬的利用時(shí)間和空間，縮短育種年限，加快遺傳進(jìn)展和提高養(yǎng)殖效益，凸顯其巨大的應(yīng)用潛力，此次試驗(yàn)基于種公豬的克隆技術(shù)生產(chǎn)克隆豬，并應(yīng)用于實(shí)際規(guī)?；纳a(chǎn)中，具有很強(qiáng)的前沿性和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

然而，截止到目前生產(chǎn)克隆豬的總體效率不到3%，導(dǎo)致了制作克隆豬的成本高，嚴(yán)重束縛著克隆種豬的應(yīng)用推廣[10]。為提高克隆豬效率，羅學(xué)明等認(rèn)為可以選擇早裂的胚胎進(jìn)行移植，因?yàn)槌醮温蚜褧r(shí)間可以作為豬克隆胚胎發(fā)育潛能的標(biāo)識[11]；薛振華等優(yōu)化胚胎移植時(shí)間，認(rèn)為最佳移植時(shí)期是受體母豬處于排卵期，并獲得了88.89%的情期受胎率（28 d）和68.75%的妊娠分娩率[12]。逯心玉等比較了2頭克隆公豬與供核公豬的情期受胎率、與配母豬繁殖性能（窩產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)、斷奶活仔數(shù)等）、后代仔豬生產(chǎn)性能（初生重、斷奶重、平均日增重等）等指標(biāo)，顯示其不存在顯著性差異，克隆可以作為種公豬快速擴(kuò)繁手段，印證了“克隆豬具有正常的繁殖性能，且保留了供體優(yōu)秀的遺傳性能，可以作為優(yōu)秀種公豬進(jìn)行生產(chǎn)應(yīng)用”觀點(diǎn)[4]。

此次研究選擇2頭100 kg體重日齡140 d以內(nèi)的杜洛克公豬為核供體豬，探討其優(yōu)秀生產(chǎn)性能可否通過克隆進(jìn)行傳遞。試驗(yàn)中，獲得10頭調(diào)教成功的克隆公豬，其100 kg體重日齡157.07±6.54 d，明顯低于核供體公豬，與同期杜洛克公豬100 kg體重日齡（156.20±5.23 d）無顯著性差異。克隆公豬后代，初生重1.61±0.33 kg、斷奶重7.56±1.65 kg、校正100 kg體重日齡159.26±8.27 d，校正背膘厚9.41±1.47 mm，也與同時(shí)期普通杜洛克公豬后代無顯著性差異。同時(shí)，背膘厚等性狀上，克隆公豬后代與同時(shí)期的其他杜洛克后代比較，各項(xiàng)性狀值均無顯著差異。上述結(jié)果說明，優(yōu)秀的生產(chǎn)性能并沒有通過克隆傳遞給后代，其中原因可能核供體豬選擇不夠準(zhǔn)確，也可能是克隆過程影響了生產(chǎn)性能發(fā)揮。

研究建立了種豬克隆快速擴(kuò)繁技術(shù)平臺，但常規(guī)選育的克隆公豬及其后代生產(chǎn)性能與普通公豬及其后代無顯著差異，需要進(jìn)一步提高選擇準(zhǔn)確性、提高克隆效率及其存活率，才能滿足克隆應(yīng)用于終端公豬生產(chǎn)的產(chǎn)業(yè)要求。