陳正培，曹倩，蔣熠琤，周小玲，吳錦蘭，崔娜，鞏僖，熊建文

(柳州工學院 食品與化學工程系，廣西 柳州 545616)

酸筍屬于典型的發(fā)酵食品，傳統(tǒng)工藝將新鮮竹筍切塊、洗凈后加入老壇酸水中進行發(fā)酵[1-2]。隨著柳州螺螄粉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，酸筍的市場需求量也迅速增大，逐漸從家庭作坊小規(guī)模制作走向工廠大規(guī)模生產(chǎn)，而新工藝生產(chǎn)的酸筍口感較傳統(tǒng)工藝的差，但傳統(tǒng)工藝又不能滿足大規(guī)模生產(chǎn)的需求，這是當前酸筍行業(yè)發(fā)展急需解決的問題。作為發(fā)酵食品，微生物對其風味的形成至關重要，因此了解傳統(tǒng)酸筍中的微生物群落結構，可為酸筍規(guī)?；a(chǎn)提供參考，優(yōu)化酸筍發(fā)酵的微生物體系，是開發(fā)高品質酸筍的重要途徑。

高通量測序是近年來興起的用于食品微生物多樣性分析的前沿技術，應用非常廣泛[3-6]。崔夢君等[7]采用高通量測序技術分析農(nóng)家醬中的微生物群落，發(fā)現(xiàn)主要的細菌屬有乳酸桿菌屬、棒狀桿菌、芽孢桿菌屬和葡萄球菌屬等。安飛宇等[8]利用宏轉錄組學技術對豆醬自然發(fā)酵過程中的活性菌群及風味物質的關聯(lián)分析表明嗜鹽四聯(lián)球菌、植物乳桿菌、酸魚乳桿菌、蛋白原酶乳桿菌、枯草芽孢桿菌及糞腸球菌與風味物質呈顯著正相關，故將其定義為對風味物質合成有重要影響的核心發(fā)酵微生物種。該技術無需對微生物進行培養(yǎng)，分析結果覆蓋了樣品中的未培養(yǎng)微生物?；?Illumina HiSeq 2500測序平臺可對樣品中的微生物進行物種多樣性、物種豐度分析以及功能基因預測，是分析發(fā)酵食品中微生物群落結構的有力工具。本研究利用該技術對酸筍發(fā)酵液中的細菌多樣性進行了分析，旨在為開發(fā)適用于大規(guī)模生產(chǎn)的新工藝奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酸筍發(fā)酵液分別來自柳州的柳北區(qū)、柳城縣和鹿寨縣，每個地區(qū)各采集6份來自不同家庭的酸筍發(fā)酵液，裝入無菌瓶后于低溫(冰盒)條件下運回實驗室，將各地區(qū)的樣品隨機分為2組，每組3個樣品，并進行等體積混合，得到6個混合樣品，分別為LC1(來自柳城縣)、LC2(來自柳城縣)、LB1(來自柳北區(qū))、LB2(來自柳北區(qū))、LZ1(來自鹿寨縣)、LZ2(來自鹿寨縣)。

細菌基因組DNA提取試劑盒：美國Omega科技公司。

1.2 儀器與設備

5425高速離心機 德國 Eppendorf公司；水平電泳儀 北京六一生物科技有限公司；Master-S15超純水機 上海和泰儀器有限公司；GenoSens1880凝膠成像分析系統(tǒng) 上海勤翔科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

分別取以上6個混合酸筍發(fā)酵液20 mL，12000 r/min離心1 min，離心收集菌體，用無菌生理鹽水洗滌菌體2次，參考Omega Bacterial DNA Kit 說明書提取細菌的總DNA，經(jīng)過濃度測定后，將細菌總DNA于-80 ℃超低溫冰箱中臨時保存，取一定量的總DNA送至測序公司進行高通量測序。

1.3.2 高通量測序1.3.2.1 DNA濃度的檢測

用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總DNA 濃度和純度。

1.3.2.2 PCR擴增及測序

細菌多樣性分析采用16S rDNA基因可變區(qū)(V3～V4)區(qū)域通用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)[9-10]，PCR擴增程序：①95 ℃預變性3 min；②95 ℃變性30 s；③退火溫度下退火15 s；④72 ℃延長30 s；⑤72 ℃延長10 min；②～④循環(huán)30次。擴增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，利用AMPure XT beads 試劑盒對目標片段進行回收純化，構建測序文庫，質檢合格的文庫用Illumina HiSeq 2500進行測序。

1.3.2.3 數(shù)據(jù)分析

利用FLASH軟件，通過Overlap對樣品的Reads進行拼接，得到Raw Tags數(shù)據(jù)；利用Trimmomatic軟件對Raw Tags進行過濾[11]，得到高質量的Clean Tags；利用Uchime軟件鑒定并去除嵌合體序列，得到Effective Tags；使用QIIME(Version 1.8.0)軟件中的 Uclust[12]對Tags在97%的相似度水平下進行聚類，獲得OTU，并基于Silva細菌分類學數(shù)據(jù)庫對OTU進行分類學注釋。利用Uclust 軟件對OTU 進行聚類分析，并選擇OTU 數(shù)目變化與Uclust 參數(shù)之間最佳近似值。并對物種豐度進行分析，同時根據(jù)NCBI提供的已有微生物物種的分類學數(shù)據(jù)庫，使用Megan軟件將測序得到的物種豐度信息回歸至數(shù)據(jù)庫的分類學系統(tǒng)關系樹中[13]。采用主坐標分析法(principal coordinates analysis，PCoA)分析各樣品主因子。利用Metastats軟件對組間的物種豐度數(shù)據(jù)進行T檢驗；得到p值，了解組間主要的差異物種。最后使用PICRUSt軟件通過比對16S測序數(shù)據(jù)獲得的物種組成信息，推測樣本中的功能基因組成，從而分析不同樣本或分組之間在功能上的差異。

2 結果分析

2.1 各地區(qū)樣品中的OTU數(shù)分布

通過對細菌16S rDNA進行基因測序，結果見圖1，6個測序樣品共獲得480，136對Reads，雙端Reads拼接、過濾后共產(chǎn)生344216條Clean Tags，其中柳北區(qū)樣品產(chǎn)生128617條Clean Tags，柳城縣樣品產(chǎn)生105335條Clean Tags，鹿寨縣樣品產(chǎn)生110261條Clean Tags。所有序列均按97%相似度歸為OTU，共聚合了191個OTU，柳北區(qū)樣品的OTU數(shù)顯著低于鹿寨縣和柳城縣樣品的OTU數(shù)，鹿寨縣和柳城縣樣品OTU數(shù)無顯著差異。分析不同地區(qū)樣品間的共有物種和特有物種數(shù)，結果見圖2。3個地區(qū)共有的OTU為48個，柳北區(qū)特有的OTU占比6.5%，鹿寨縣特有的OTU占比1.0%，柳城縣特有的OTU占比1.1%。

圖1 不同地區(qū)樣品的OTU數(shù)分布圖Fig.1 OTU number distribution diagram of samples from different regions

圖2 不同地區(qū)樣品的Venn圖Fig.2 Venn diagram of samples from different regions

2.2 各地區(qū)酸筍樣品中的物種分布

在屬水平上分析鹿寨、縣柳北區(qū)和柳城縣酸筍中的細菌物種豐度，篩選豐度大于0.1%的物種，結果見表1。在3個地區(qū)樣品中豐度大于0.1%的屬共有16個，分別為乳桿菌屬、氣斯卡多維亞氏菌屬、不動桿菌屬、泛菌屬、擬桿菌屬、擬普雷沃菌屬、志賀氏菌屬、艾克曼菌屬、瘤胃梭菌屬、嗜膽菌屬、普雷沃氏菌屬、阿里葉柄菌屬、羅斯氏菌屬、梭狀芽孢桿菌屬、瘤胃球菌屬、弓(形)桿菌屬、葡萄球菌屬。其中乳桿菌屬占比最大，在3個地區(qū)的樣品中豐度均超過了90%，是柳州酸筍中的主要優(yōu)勢菌，其中柳北地區(qū)樣品的含量最高，達到96.11%。在柳北地區(qū)的酸筍樣品中，滿足豐度大于0.1%的物種只有5種，鹿寨地區(qū)有8種，柳城地區(qū)有10種，柳城與鹿寨的物種分布更為相似。

表1 柳州地區(qū)酸筍物種豐度Table 1 The species abundance of sour bamboo shoots in Liuzhou area %

續(xù) 表

2.3 Mega分類樹分析

根據(jù)NCBI提供的已有微生物物種的分類學數(shù)據(jù)庫，使用Megan軟件將測序得到的物種豐度信息回歸至數(shù)據(jù)庫的分類學系統(tǒng)關系樹中，結果見圖3。來自柳城、鹿寨和柳北3個地區(qū)的酸筍樣品中原核微生物主要分布在9個門、13個綱、23個目、36個科和75個屬。在科水平上，主要分布在乳桿菌科、毛螺菌科和瘤胃菌科中。

圖3 酸筍樣品的Mega分類樹Fig.3 Mega taxonomic tree of sour bamboo shoot samples

2.4 主成分分析

在屬水平上對來自柳北、柳城和鹿寨的6個樣品進行主成分分析，經(jīng)過提取因子后，PCoA-PC1占比為86.85%，PCoA-PC2占比8.45%。分析各樣品在兩個主成分上的差異，結果見圖4。各地區(qū)樣品組內(nèi)在PC1上均保持一致，除柳北的樣品外，來自柳城和鹿寨的各樣品在PCoA-PC2上有明顯的差異。導致這種結果的原因可能是酸筍發(fā)酵的主要物種只有乳桿菌屬，其他物種并不是酸筍發(fā)酵的關鍵菌種，因此其在不同樣品中的豐度有較大的差異。

圖4 屬水平上的PCoA分析Fig.4 PCoA analysis at the genus level

2.5 組間顯著性差異分析

利用Metastats對柳北、柳城和鹿寨的樣品進行兩兩比較，分析屬水平上導致組間差異的微生物，結果見表2。在屬水平上鹿寨與柳北的酸筍樣品中原核微生物的種類非常相似，只有梭桿菌屬(Fusobacterium)有顯著差異。柳城的酸筍樣品與柳北和鹿寨的樣品差異較大，主要體現(xiàn)在梭狀芽孢桿菌(Clostridium)、甘藍油菜菌屬(Brassicanapus)、普氏菌屬(Prevotella)、 泛菌屬(Pantoea)4個屬上。

表2 地區(qū)間有顯著差異的菌株Table 2 Significantly different strains from different regions

2.6 組間功能基因的差異性分析

使用PICRUSt軟件通過比對16S測序數(shù)據(jù)獲得的物種組成信息，推測樣本中的功能基因組成，結果見圖5。通過KEGG代謝途徑的差異分析，觀測不同分組的樣品之間微生物群落的功能基因在代謝途徑上的差異和變化，結果各組之間均無顯著性差異。3組樣品中共發(fā)現(xiàn)了39種功能基因，其中糖類代謝基因的豐度約為15%～18%，氨基酸代謝基因豐度為7%～12%、酯類代謝基因豐度約為3%～5%。

圖5 酸筍發(fā)酵液中的功能基因分析Fig.5 Functional genes infermentation broth of sour bamboo shoots

3 結論

本研究以柳州3個地區(qū)的傳統(tǒng)發(fā)酵酸筍為研究對象，采用 Illumina MiSeq 2500高通量測序技術分析樣品中細菌菌群組成情況。結果表明，不同地區(qū)酸筍樣品在物種多樣性上有一定的差異，柳北的樣品與鹿寨的樣品細菌群落結構更為相似，但與柳城的樣品存在較大差異，值得進一步研究。酸筍中存在的優(yōu)勢菌為乳桿菌屬，其豐度達到90%以上，與其他發(fā)酵食品相似，劉怡萱等[14]發(fā)現(xiàn)乳桿菌屬作為優(yōu)勢菌存在于西藏農(nóng)牧區(qū)牦牛酸奶中，孫慧君等[15]發(fā)現(xiàn)其作為優(yōu)勢菌存在于錦州地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵小菜中。毛螺菌屬和瘤胃菌屬也較為豐富，瘤胃菌屬可以發(fā)酵纖維素和纖維二糖，可能是使酸筍變軟的主要種群，同時也可以產(chǎn)生乙酸、甲酸等有機酸，所有樣品中均有志賀氏菌和葡萄球菌的存在，豐度較低，并不會引起人的疾病，但也應引起人們的注意，可能存在一定安全風險。經(jīng)過功能基因分析，糖代謝的基因豐度最大，達到15%～18%，可能是微生物能適應在低可溶性糖環(huán)境下發(fā)酵的原因，氨基酸代謝相關的基因豐度達到7%～12%，它在賦予酸筍鮮味上起了重要作用。該技術在廣西酸筍細菌多樣性分析中的應用，較為全面地解析了廣西酸筍中的細菌群落結構，為今后開發(fā)復合發(fā)酵菌劑、優(yōu)化酸筍發(fā)酵體系提供了理論依據(jù)。