王新惠，孫勁松，丁悅，劉力嘉，潘攀，張雅琳，劉洋*

(1.成都大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，成都 610106；2.宜賓學(xué)院固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點(diǎn)實驗室，四川 宜賓 644000)

芽菜是我國的一種傳統(tǒng)腌制菜，可搭配各種家常菜食用，因其方便食用、鮮香可口、營養(yǎng)豐富受到廣大消費(fèi)者的青睞。芽菜由芥菜的嫩莖劃成絲后曬干，加鹽和香料，裝壇密封，自然發(fā)酵而成。芽菜又分為甜芽菜和咸芽菜，發(fā)酵前加入紅糖的屬于甜芽菜，不加紅糖的是咸芽菜，而宜賓芽菜屬于甜芽菜。傳統(tǒng)工藝發(fā)酵生產(chǎn)的宜賓芽菜具有發(fā)酵周期長[1]、含鹽量較高、風(fēng)味不穩(wěn)定等缺點(diǎn)[2]。值得注意的是在芽菜發(fā)酵中微生物起著至關(guān)重要的作用，芽菜質(zhì)地和風(fēng)味的變化高度都依賴于發(fā)酵環(huán)境微生物，發(fā)酵菌群會賦予芽菜風(fēng)味的形成，并且有助于亞硝酸鹽降解等。目前，已有學(xué)者對芽菜中微生物群落的結(jié)構(gòu)和組成進(jìn)行初步的研究，左勇等[3]通過高通量測序技術(shù)檢測出宜賓芽菜發(fā)酵過程中優(yōu)勢菌屬是芽孢桿菌屬(Bacillusspp.)；白光劍等[4]通過高通量測序技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)在芽菜中的優(yōu)勢菌門為變形菌門(Proteobacteria)和硬壁菌門(Firmicute)；尹曦[5]通過非培養(yǎng)方法發(fā)現(xiàn)宜賓芽菜中主要的乳酸菌為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、堅強(qiáng)腸球菌(Enterococcusdurans)和戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)，可見研究學(xué)者對芽菜中的菌群有了初步的研究，但是對于不同芽菜之間微生物結(jié)構(gòu)的差異性研究較少。

為了解成品散裝宜賓芽菜之間的微生物群落結(jié)構(gòu)組成的差別，通過高通量測序技術(shù)對同一市場上出售的3種不同品牌的散裝宜賓芽菜進(jìn)行研究，以期能錨定不同品牌散裝芽菜中的優(yōu)勢菌群，并且探究成品散裝芽菜的微生物安全性，為后續(xù)進(jìn)一步深入研究宜賓芽菜奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

散裝芽菜采購自成都市十陵鎮(zhèn)久貿(mào)綜合市場，取3種不同品牌的散裝宜賓芽菜樣品，分別命名為M1、M2和M3。所有樣品均為無菌采樣，使用無菌塑封袋包裝后置于-80 ℃冰箱中保存待用。

1.2 試劑與儀器

無水乙醇和液氮：成都新金山化工有限公司；乙二胺四乙酸(EDTA)、鹽酸、磷酸三鈉、氯化鈉、氯仿、異戊醇等：均購于成都市科隆化學(xué)品有限公司。

E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit提取試劑盒 美國Omega公司；QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN)凝膠回收試劑盒；Qubit 2.0熒光計 ThermoFisher公司；HiSeq Rapid SBS Kit v2 (FC-402-4023 500 Cycle)測序試劑盒、HiSeq測序儀 美國Illumina公司；Applied Biosystems?Gene Amp?PCR System 9700 PCR儀；臺式冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司。

1.3 樣品DNA提取和PCR擴(kuò)增

使用特定的DNA提取試劑盒進(jìn)行基因組DNA提取后，使用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA。16S 引物使用：515F(5＇-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3＇)和806R(5＇-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3＇)[6]。以稀釋后的基因組 DNA 為模板，根據(jù)測序區(qū)域的選擇，使用帶 Barcode 的特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 每一個25 μL的擴(kuò)增體系包括1×PCR buffer、1.5 mmol/L MgCl2、0.4 μmol/L dNTPs、正向和反向引物各1.0 μmol/L、0.5 U KOD-Plus-Neo酶(TOYOBO)和10 ng模板。 PCR程序包括起始 94 ℃ 1 min,然后30個循環(huán)(變性 94 ℃ 20 s，退火 54 ℃ 30 s 和延伸72 ℃ 30 s)，最后 72 ℃ 5 min。每個樣本進(jìn)行3個PCR技術(shù)重復(fù)。PCR 1/6體積的 6× loading buffer 混合，使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。取目的條帶用來回收，回收使用 QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN)。使用Qubit 2.0 Fluorometer (Thermo Scientific)定量，最后等摩爾量混合。根據(jù) PCR 擴(kuò)增圖譜，擴(kuò)增后的條帶比較清晰明顯且條帶位置一致，背景干凈，DNA濃度達(dá)到了擴(kuò)增要求。建庫使用 TruSeq DNA PCR-Free Sample Prep Kit，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過定量和文庫檢測合格后，使用HiSeq 2500平臺PE250模式測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用FLASH[7]拼接雙端序列?；贐arcode從reads中拆分出各樣品序列。截去Barcode序列得到原始數(shù)據(jù)，然后使用Trimmomatic[8]進(jìn)行質(zhì)控。嵌合體去除使用Uchime算法[9]，得到有效數(shù)據(jù)Clean Reads。基于Usearch 軟件，使用UPARSE 算法[10]在97%的一致性水平上進(jìn)行OTU聚類，挑選每個OTU中出現(xiàn)頻數(shù)最高的序列作為OTU的代表序列。利用UCLUST分類法[11]和SILVA數(shù)據(jù)庫[12]進(jìn)行注釋分析，對各樣本做均一化處理，以樣品中數(shù)據(jù)量最少的為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行重抽樣。使用R語言[13]進(jìn)行群落組成分析、Alpha多樣性分析、Beta分析、相關(guān)性分析等，使用ggplot2作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 散裝芽菜中細(xì)菌群落α-多樣性分析

Alpha指數(shù)用來表征樣本的物種豐富程度[14]。3種芽菜中細(xì)菌群落多樣性和豐度見表1。ACE和Chao1指數(shù)常用來估算細(xì)菌菌落的豐富度，結(jié)果表明樣本M2的細(xì)菌菌群豐度最低，而樣本M1和M3中細(xì)菌菌群豐度相差較小。Shannon香衣指數(shù)和辛普森指數(shù)表示的是細(xì)菌菌群多樣性，辛普森指數(shù)值越大，說明細(xì)菌菌落多樣性越低，結(jié)果表明對比可得樣本M2的細(xì)菌群落多樣性最低。研究結(jié)果可知，不同芽菜間細(xì)菌群落的多樣性和豐度存在差異，主要源于芽菜發(fā)酵環(huán)境的差異性。

表1 3種散裝芽菜中細(xì)菌群落豐度和多樣性Table 1 Bacterial community abundance and diversity of three kinds of sprouts in bulk

2.2 細(xì)菌菌群韋恩圖分析

對3種樣品之間的OTU種類進(jìn)行分析比較得到韋恩圖見圖1。樣品M1、M2、M3一共得到791個OTUs，M1中有490個OTUs，M2中有375個OTUs，M3中有508個OTUs，其中共有的OTUs為176，表明3種不同品牌的散裝芽菜之間細(xì)菌菌落結(jié)構(gòu)差異較大。

圖1 3種散裝芽菜的OTU韋恩圖分析Fig.1 OTU Venn diagram analysis of three kinds of sprouts in bulk

2.3 細(xì)菌群落在門水平的結(jié)構(gòu)分析

3種散裝芽菜的細(xì)菌群落在門水平上的結(jié)構(gòu)見圖2。樣本M1共檢測出18個門，其中厚壁菌門(Firmicutes，44.93%)在細(xì)菌中占比最多，此外，擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)和廣古菌門(Euryarchaeota)在細(xì)菌中總占比為39.9%，樣本M2共檢測出14個門，豐度排名前三的是厚壁菌門(63.09%)、擬桿菌門(17.29%)和變形菌門(8.83%)，樣本M3共檢測出19個門，優(yōu)勢菌門是厚壁菌門(Firmicutes)40.26%、擬桿菌門(Bacteroidetes)20.90%、廣古菌門(Euryarchaeota)14.26%、變形菌門(Proteobacteria)8.24%。厚壁菌門是3種樣品中的優(yōu)勢菌門，擬桿菌門次之。同時，M2中厚壁菌門的相對豐度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他兩個樣品。

圖2 3種散裝芽菜的細(xì)菌群落在門水平的分布Fig.2 Distribution of bacterial communities in three kinds of sprouts in bulk at the phylum level

2.4 細(xì)菌群落在屬水平的結(jié)構(gòu)分布

從屬的水平對3種散裝芽菜的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，見圖3。樣本M1中豐度較高的菌屬有乳酸桿菌屬(Lactobacillusspp.，27.57%)、甲烷短桿菌屬(Methanobrevibacterspp， 3.68%)、擬桿菌屬(Bacteroidesspp.，2.92%)、明串珠菌屬(Leuconostocspp.，2.74%)。樣本M2中豐度較高的菌屬有乳酸桿菌屬(41.61%)、明串珠菌屬(5.11%)、擬桿菌屬(3.76%)。樣本M3中豐度較高的菌屬為乳酸桿菌屬(25.64%)、甲烷短桿菌屬(4.05%)、擬桿菌屬(3.54%)、Lachnospiraceae NK4A136 group(2.77%)。結(jié)果表明，乳酸桿菌屬是3種散裝芽菜中的優(yōu)勢菌屬，乳酸桿菌屬具有嗜酸的特點(diǎn)，所以廣泛存在發(fā)酵腌制的蔬菜中[15]，并且能縮短發(fā)酵時間，提高產(chǎn)品的風(fēng)味和營養(yǎng)價值。明串珠菌屬也存在于3種散裝芽菜中，有研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)在芽菜自然發(fā)酵過程中，明串珠菌屬在發(fā)酵初期是優(yōu)勢菌屬[16]，隨著發(fā)酵時間的增加，其含量逐漸降低，乳桿菌屬成為最優(yōu)勢菌屬。魏斯氏菌屬(Weissellaspp.)是參與食品發(fā)酵的重要微生物，在M1中占比1.20%，在M2中占比2.12%，在M3占比為0.26%，可以產(chǎn)生有機(jī)酸、酯類等，能賦予產(chǎn)品獨(dú)特的風(fēng)味，此外還可以提高發(fā)酵食品的安全性[17]。樣本M3中存在的納白菌屬(Natrialbaspp.，1.97%)、鹽球菌屬(Halococcusspp.，1.93%)、鹽紅菌屬(Halorubrumspp.， 0.62%)和Halostagnicolaspp.(0.4%)是必須在高鹽環(huán)境下生存的古菌[18]，可能是因為樣品M3的鹽含量較高。值得注意的是，3種芽菜中也發(fā)現(xiàn)了致病腐敗菌，樣本M1中假單胞菌屬(Pseudomonasspp.)含量較高，一般用來制作泡菜的新鮮蔬菜表面都附著假單胞菌屬，有研究表明假單胞菌屬可產(chǎn)生生物胺，還能還原硝酸鹽產(chǎn)生亞硝酸鹽等有害物質(zhì)，影響發(fā)酵蔬菜的安全性[19]。其次發(fā)現(xiàn)了嗜冷桿菌屬(Psychrobacterspp.)，是一種典型的腐敗菌屬，在低溫下能大量繁殖，導(dǎo)致食品腐敗[20]。同時，3種芽菜中都檢測出了腸桿菌屬(Enterobacterspp.)，腸桿菌屬中細(xì)菌大部分屬于致病菌，比如陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes)、聚團(tuán)腸桿菌(Enterobacteragglomerans)等，常在土壤、污水、腐爛蔬菜和乳制品中被發(fā)現(xiàn)，會危害人體健康。葡萄球菌屬(Staphylococcusspp.)中的金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)會產(chǎn)生腸毒素，導(dǎo)致食品中毒[21]。樣本M1中還檢測出腸球菌屬(Enterococcusspp.，0.04%)，具有致病性，容易在年老及虛弱人群身上產(chǎn)生感染，導(dǎo)致敗血癥[22]。

圖3 3種散裝芽菜在屬水平豐度熱圖Fig.3 Heat map of abundance of three kinds of sprouts in bulk at genus level

傳統(tǒng)的制作芽菜工藝中，通過自然發(fā)酵的芽菜風(fēng)味差、發(fā)酵周期長、微生物質(zhì)量差，主要是因為發(fā)酵環(huán)境中優(yōu)勢菌屬不明顯，并且原輔料中附有的腐敗致病菌會導(dǎo)致有害物質(zhì)亞硝酸鹽、生物胺的積累，影響產(chǎn)品的食用安全性。

2.5 PCA主成分分析

對3種芽菜中的細(xì)菌菌群進(jìn)行PCA主成分分析，結(jié)果見圖4。第一軸(PC1)和第二軸(PC2)的物種累計百分比方差分別為57%和43%，相加為100%。3種樣本之間的距離較遠(yuǎn)，說明3種芽菜中的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)有較大的差異。

圖4 PCA分析Fig.4 PCA analysis

3 結(jié)論

本研究通過高通量測序分析三種不同品牌的散裝芽菜中細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)差異。結(jié)果表明，樣本M2中細(xì)菌菌群豐度最低，但是細(xì)菌菌群多樣性最高。M1、M2、M3一共得到791個OTUs，其中共有的OTUs為176。從門水平上對3種芽菜中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)3種樣品中的優(yōu)勢菌門為厚壁菌門；從屬水平上進(jìn)行分析，乳酸桿菌屬在3種芽菜中均為優(yōu)勢菌屬，且M2中乳酸桿菌屬的相對豐度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他兩個樣品。同時發(fā)現(xiàn)了一些腐敗致病菌屬，如假單胞菌屬、嗜冷桿菌屬、葡萄球菌屬等。

芽菜中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異性可能是因為生產(chǎn)過程、原材料和保存環(huán)境的差異造成的。在3種芽菜中均發(fā)現(xiàn)了腐敗致病菌屬，結(jié)果表明在傳統(tǒng)工藝下制作的芽菜的微生物安全較差，以期通過本文的研究為后續(xù)進(jìn)一步提升產(chǎn)品質(zhì)量和食用安全性奠定基礎(chǔ)，從而保障消費(fèi)者的權(quán)益。