李雪玲，顏喆，胡文鋒

(華南農(nóng)業(yè)大學 食品學院應用微生物研究室，廣州 510642)

醬油是一種重要的傳統(tǒng)調(diào)味食品，具有獨特的風味，在亞洲國家有廣泛的應用[1]。醬油除調(diào)味功能外，還具有保健功效，醬油中含有的一些生理活性物質(zhì)具有抗癌、抗白內(nèi)障、抗血小板凝固、抗氧化和抑制組氨酸脫羧酶的作用[2-4]。

米曲霉是一種非常重要的傳統(tǒng)發(fā)酵微生物，特別是在醬油發(fā)酵中更具有不可估量的作用[5]。醬油釀造主要依賴于米曲霉所產(chǎn)生的豐富的蛋白酶、淀粉酶、酯酶等多種酶系來分解原料中的多種成分，從而形成醬油獨特的色、香、味、體。醬油生產(chǎn)米曲霉菌種的性能決定了醬油的品質(zhì)及原料利用率，因此，醬油生產(chǎn)中選育優(yōu)良的米曲霉菌株至關(guān)重要，它關(guān)系到醬油產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量[6]。

由于各種因素的影響，譬如長期的移種和保藏，醬油生產(chǎn)中使用的米曲霉菌種會出現(xiàn)退化、變異，丟失某些重要形態(tài)特征或良好生產(chǎn)性能，造成生產(chǎn)不穩(wěn)定、低產(chǎn)。因此，在未發(fā)生退化前就應該適時進行米曲霉菌種的復壯篩選，以保持其原有的優(yōu)良性能。而傳統(tǒng)的復壯篩選工藝流程繁瑣，需要耗費大量人力、物力才能夠達到預期目標。本研究在傳統(tǒng)復壯篩選工藝的基礎上，建立氨基酸態(tài)氮得率的實驗模型，同時對米曲霉菌落形態(tài)特征與氨基酸態(tài)氮得率的關(guān)系也進行了大量的對比研究及驗證以高效選育優(yōu)良菌株，為減少復篩的工作量，提高復壯篩選的效率和質(zhì)量，提升釀造醬油品質(zhì)提供了一定的借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 出發(fā)菌株

米曲霉(Aspergillusoryzae)：廣東珠江橋生物科技股份有限公司菌種保藏中心提供。

1.1.2 原料與試劑

面粉、豆粕、麥糠、食鹽：均由廣東珠江橋生物科技股份有限公司提供；化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

1.1.3.1 豆汁斜面培養(yǎng)基

大豆經(jīng)低溫浸泡過夜、反復加水煮汁3 h后得到豆汁，調(diào)整其濃度，加入無機鹽制成豆汁斜面培養(yǎng)基，121 ℃滅菌20 min。

1.1.3.2 酪蛋白培養(yǎng)基

干酪素4.00 g，MgSO4·7H2O 0.50 g，Na2HPO41.07 g，KH2PO40.36 g，瓊脂粉20.00 g，蒸餾水1000 mL，pH 6.5～7.0，121 ℃滅菌20 min。

1.1.3.3 種曲培養(yǎng)基

面粉20 g，麩皮80 g，水80～100 mL，250 mL三角瓶裝濕料20 g，121 ℃滅菌30 min。

1.1.3.4 大曲培養(yǎng)基

面粉200 g，豆粕700 g，麩皮100 g，水600 mL，121 ℃滅菌20 min。

1.2 實驗方法

1.2.1 制備單孢子懸浮液

將米曲霉出發(fā)菌株接種于豆汁斜面培養(yǎng)基，于30 ℃培養(yǎng)3～5 d。選取生長良好的斜面菌種，用10 mL無菌水洗下斜面上的孢子，倒入含有玻璃珠的100 mL無菌三角瓶中，磁力攪拌5 min以分散孢子，然后用血球計數(shù)板計數(shù)，進行相應梯度稀釋后制成不同濃度的孢子懸浮液。

1.2.2 初篩

采用稀釋平板法篩選米曲霉：吸取酪蛋白培養(yǎng)基置于直徑9 cm的平皿中，將上述稀釋至適當濃度的孢子懸浮液添加在酪蛋白平板上，用滅菌的玻璃刮板涂布均勻，于32 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)72 h，每個平皿的菌落數(shù)以6～8個為宜，觀察菌落形態(tài)特征，測量菌落直徑(d)、透明圈直徑(D)，計算K值(K=D/d)。

1.2.3 復篩1.2.3.1 中性蛋白酶活力測定

按照行業(yè)標準SB/T 10317-1999的方法測定酶活力[7]。酶活力定義：在40 ℃條件下，每1 g曲在1 min水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸為1個酶活力單位。

1.2.3.2 醬醪發(fā)酵指標測定

總酸、氨基酸態(tài)氮的檢測按照GB/T 18186-2000《釀造醬油》的方法進行[8]。

1.2.3.3 孢子發(fā)芽率測定

按照行業(yè)標準SB/T 10316-1999的方法測定發(fā)芽率[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 米曲霉菌株的初篩

從酪蛋白平板上挑選出菌落直徑d、透明圈直徑(D)和K值(K=D/d)在不同范圍的菌落，并記錄相應菌落的孢子特征。根據(jù)d、D、K值及菌落孢子的特征將挑選出的菌落分成A，B，C，D，E，F(xiàn) 6個類別，每種類別選取1個典型的菌株(見表1)。將6類菌株分別接種于豆汁試管斜面，30 ℃培養(yǎng)72 h，菌種形態(tài)特征見圖1。

表1 初篩米曲霉菌株的各項指標Table 1 The indexes of Aspergillus oryzae strainin preliminary screening

圖1 初篩米曲霉菌株的菌落形態(tài)特征Fig.1 The colony morphological characteristics of Aspergillus oryzae strain in preliminary screening

由圖1可知，E菌落孢子較多，菌絲致密，F(xiàn)菌落孢子多，菌絲薄、疏，A，B，C，D 4個菌落孢子少，菌絲稀疏。通過測定這些菌株三角瓶、制曲階段的中性蛋白酶活以及低鹽發(fā)酵放油的氨基酸態(tài)氮指標，復篩優(yōu)良的米曲霉菌株。

2.2 優(yōu)良米曲霉菌株的復篩

2.2.1 菌株三角瓶成曲中性蛋白酶活力的測定

將初篩挑選出的6株斜面菌種分別接種到三角瓶培養(yǎng)基進行擴大培養(yǎng)，32 ℃培養(yǎng)72 h，三角瓶成曲檢測中性蛋白酶酶活，結(jié)果見圖2。E，F(xiàn)兩個菌株三角瓶成曲的中性蛋白酶活力明顯比對照菌株高約1000 U/g，其中E菌株提高幅度較大。

圖2 米曲霉復篩菌株三角瓶成曲的中性蛋白酶活力Fig.2 The activity of neutral protease of rescreened Aspergillus oryzae strain in triangular flask

2.2.2 菌株制曲中性蛋白酶活力的測定

模擬大生產(chǎn)條件進行小規(guī)模制曲，檢測制曲成曲的中性蛋白酶活力，結(jié)果見圖3。E，F(xiàn)兩個菌株制曲成曲的中性蛋白酶活力分別為2480，2300 U/g，比對照菌株分別高13.76%和5.5%，可見通過復壯篩選能夠篩選出中性蛋白酶活力顯著提高的菌株。

圖3 米曲霉復篩菌株制曲成曲中性蛋白酶活力Fig.3 The activity of neutral protease of rescreenedAspergillus oryzae strain in finished koji

2.2.3 復篩菌株低鹽發(fā)酵放油氨基酸態(tài)氮含量的測定

按照低鹽固態(tài)發(fā)酵法，將復篩挑選出的菌株做低鹽發(fā)酵，檢測低鹽發(fā)酵總酸、氨基酸態(tài)氮，結(jié)果見圖4和圖5。E菌株在三角瓶、制曲階段的中性蛋白酶活力最高，低鹽發(fā)酵放油的氨基酸態(tài)氮也較高，比對照高8.4%，可見E菌株蛋白質(zhì)分解能力最強，提高了原料的利用率，該菌株為選育出的優(yōu)良高產(chǎn)菌。

圖4 復篩菌株低鹽發(fā)酵頭油總酸含量Fig.4 The total acid content of first oil of rescreened strain by low-salt fermentation

圖5 復篩菌株低鹽發(fā)酵頭油氨基酸態(tài)氮含量Fig.5 The amino acid nitrogen content of first oil of rescreened strains by low-salt fermentation

2.2.4 多元線性回歸分析

以菌落直徑d和K值為自變量，以氨基酸態(tài)氮得率為因變量，用SPSS軟件建模，進行多元線性回歸分析。經(jīng)分析，回歸方程的相關(guān)系數(shù)R=0.963，決定系數(shù)R2=0.927，經(jīng)方差分析，F(xiàn)=19.184，P=0.020，回歸方程有效，見表2和表3。

表2 回歸方程方差分析表Table 2 The variance analysis of regression equation ANOVAb

表3 回歸分析檢驗結(jié)果Table 3 The testing results of regression analysis coefficientsa

回歸得到不同菌落的氨基酸態(tài)氮得率水平(U)與K值和菌落直徑d之間的關(guān)系為：U=0.035d+0.332K+0.060(式1)，式中菌落直徑d相當于比生長速率，K相當于單個孢子的氨基酸態(tài)氮得率系數(shù)，對于不同的菌株其比生長速率和氨基酸態(tài)氮得率系數(shù)不同，因此它們的d值和K值也不同，根據(jù)式1可以從酪蛋白平板上的菌落直徑d和K值判斷菌落的氨基酸態(tài)氮得率水平。

用回歸方程建立模型的方法可以更準確地判斷菌株的氨基酸態(tài)氮得率水平與菌落直徑d和K值之間的關(guān)系，可見菌落直徑和K值都相對較大時，該菌株的氨基酸態(tài)氮得率水平也較高。

2.2.5 篩選菌株菌落形態(tài)特征的回歸分析

E，F(xiàn)兩個菌株三角瓶、制曲的中性蛋白酶活力和低鹽發(fā)酵放油的氨基酸態(tài)氮水平都明顯比對照菌株高，其中E菌株的優(yōu)勢更為明顯，為復篩得到的高產(chǎn)菌株。

由表1和圖1可知，E，F(xiàn)兩個菌落孢子都比較多，但F的菌絲不如E的致密、厚，由此可見初篩挑選菌落時，要將菌落直徑、K值和菌落形態(tài)特征三者結(jié)合起來作為評價標準，重點挑選孢子多和菌絲致密、厚的菌落，采用此評價標準可以大大提高菌株篩選的效率和準確性。

2.2.6 優(yōu)良菌株穩(wěn)定性研究

將E菌株進行5次斜面?zhèn)鞔恳淮泵婢N同時接種于三角瓶種曲培養(yǎng)基中進行菌種培養(yǎng)，每傳代一次檢測三角瓶菌種的中性蛋白酶活力和發(fā)芽率[10]，結(jié)果見圖6和圖7。

圖6 優(yōu)良菌株的遺傳穩(wěn)定性Fig.6 The genetic stability of superior strains

圖7 優(yōu)良菌株的連續(xù)傳代的發(fā)芽率Fig.7 The germination rate of continuous passage of superior strains

由圖6可知，E菌株經(jīng)過5代連續(xù)傳代培養(yǎng)，其三角瓶成曲的中性蛋白酶活力均保持在7900 U/g以上，而且酶活力變化不大，該菌株保持了較好的產(chǎn)酶穩(wěn)定性[11]，每一代的酶活力都優(yōu)于出發(fā)菌株(酶活7014 U/g)。由圖7可知，三角瓶成曲的發(fā)芽率均保持在94.0%以上，每一代的發(fā)芽率都優(yōu)于出發(fā)菌株(發(fā)芽率89.6%)，綜合復篩與遺傳穩(wěn)定性實驗結(jié)果可知該菌株同時擁有較高的酶活力與穩(wěn)定的遺傳穩(wěn)定性[12]。

3 結(jié)論

該研究通過醬油釀造優(yōu)良米曲霉菌株的初篩和復篩，選育出E菌株為高產(chǎn)優(yōu)良菌株，該菌株在三角瓶、制曲階段的中性蛋白酶活力以及低鹽發(fā)酵放油的氨基酸態(tài)氮指標都具有明顯的優(yōu)勢。在此基礎上建立了米曲霉氨基酸態(tài)氮得率的篩選模型，得到了氨基酸態(tài)氮得率與K值和菌落直徑d的關(guān)系，建立回歸方程U=0.035d+0.332K+0.060，米曲霉氨基酸態(tài)氮得率的高低可以通過酪蛋白平板上的菌落直徑大小和K值來確定，菌落直徑和K值都相對較大時，該菌株的氨基酸態(tài)氮得率水平也較高，通過菌落直徑d和K值可以初步判斷菌株發(fā)酵放油的氨基酸態(tài)氮水平，減少了復篩的工作量，提高了復壯篩選的效率和準確性。

研究結(jié)果表明，可以通過酪蛋白平板上的菌落形態(tài)特征判斷菌株的產(chǎn)酶能力和發(fā)酵放油的氨基酸態(tài)氮水平，一般菌落孢子較多、菌絲較厚的菌株產(chǎn)酶能力強，氨基酸態(tài)氮得率高，將K值和菌落直徑結(jié)合起來挑選菌株，采用此方法選育菌株，選育準確性和效率都較高。

篩選出的優(yōu)良菌株的傳代穩(wěn)定性是重要的參考標準，如果菌株在傳代過程中的酶活迅速降低，證明篩選出的菌株很容易退化。

采用蛋白酶活力高的優(yōu)良菌株釀造醬油，不僅可以提高原料的利用率，而且能減少釀造工業(yè)的污染。采用米曲霉氨基酸態(tài)氮得率的篩選模型選育高效優(yōu)良的菌株，可以為實際生產(chǎn)中制曲菌種的選擇提供依據(jù)，并為制曲菌株的選育研究提供參考。