王常高，杜馨，林建國(guó)，趙澤鑫，蔡俊

(湖北工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，工業(yè)微生物湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢 430068)

小龍蝦，又稱克氏原鰲蝦或淡水小龍蝦，不僅營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，而且肉質(zhì)鮮美、食用方式多樣，深受廣大消費(fèi)者喜愛(ài)。近年來(lái)，小龍蝦的養(yǎng)殖和消費(fèi)量都呈現(xiàn)不斷增長(zhǎng)的趨勢(shì)，使得小龍蝦已經(jīng)成為我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖品種[1-3]。然而，目前小龍蝦的可食用部分——蝦尾蛋白仁僅占整個(gè)蝦體重量的1/3，每食用或生產(chǎn)1噸的蝦仁將產(chǎn)生2～3噸的蝦頭蝦殼副產(chǎn)物。蝦頭蝦殼副產(chǎn)物以前直接扔掉，不僅浪費(fèi)資源，且造成環(huán)境的污染，之后逐漸開(kāi)始加以利用，早期只是將其簡(jiǎn)單干燥粉碎后添加到各種飼料中，附加值不高[4]。后來(lái)利用酸堿等化學(xué)法從中提取甲殼素使其利用價(jià)值得到提升，但因新的環(huán)境污染而被限制使用[5]。

近年來(lái)，研究人員不斷嘗試?yán)酶鞣N發(fā)酵法、酶法、萃取法等生化方法來(lái)開(kāi)發(fā)利用蝦頭蝦殼中的各種有效成分，既可減少環(huán)境污染，又可使資源得到充分利用[6]。蝦仁加工廠產(chǎn)生的蝦頭蝦殼等副產(chǎn)物中含有豐富的蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、磷脂、蝦青素、甲殼素、礦物質(zhì)等多種營(yíng)養(yǎng)性和功能性有效成份[7-11]。將蝦仁加工廠余留的新鮮蝦頭蝦殼作為原材料，利用酶解或微生物發(fā)酵作用，可用來(lái)制備各種新型調(diào)味料，不僅具有良好的營(yíng)養(yǎng)和增鮮調(diào)味作用，而且具有一定的功能性作用[12-15]。為提高蝦頭蝦殼中有效成分的利用率，本研究對(duì)蝦頭蝦殼功能性醬油釀造用菌種——米曲霉(滬釀3.042)進(jìn)行了多次誘變選育，以提高其在以蝦頭蝦殼為主料的基質(zhì)中的生長(zhǎng)適應(yīng)性和產(chǎn)酶水平。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

米曲霉(滬釀3.042)：本實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。

1.1.2 蝦頭蝦殼原料

潛江市熟制冷藏蝦仁加工廠提供的烘干蝦頭蝦殼粉碎產(chǎn)品(顆粒大小2～3 mm)，先用有機(jī)酸進(jìn)行浸泡脫鈣處理，洗滌抽濾后于冰箱中保藏備用。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面種子培養(yǎng)基：察氏酵母膏瓊脂(CYA)。

初篩用酪素平板培養(yǎng)基：A：Na2HPO4·7H2O 1.1 g，干酪素4 g，KH2PO40.36 g，MgSO40.05 g，酪素水解液0.3 mL，水1000 mL，瓊脂粉20 g；B：稱取 BaCl25 g用牛皮紙包好。將A與B分開(kāi)滅菌后，在無(wú)菌條件下趁熱混勻，倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)制成平板，于121 ℃滅菌 20 min。

復(fù)篩用固體培養(yǎng)基：脫鈣后的濕蝦頭蝦殼粉90 g，麩皮10 g，水50 mL，于121 ℃滅菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 孢子懸浮液制備

取保藏菌株接種于新鮮的斜面種子培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)3 d，取兩環(huán)活化孢子于盛有玻璃珠和pH 7.0無(wú)菌磷酸緩沖液的三角瓶中，振蕩20 min，得單孢子懸液。懸液用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整孢子懸液濃度為106個(gè)/mL左右。

1.2.2 誘變處理方法

紫外線(UV)誘變：各取孢子懸液15 mL放入5個(gè)90 mm無(wú)菌玻璃平皿中，在磁力攪拌作用下，用紫外燈(30 W，40 cm)取不同時(shí)間分別進(jìn)行照射處理，繪制UV的致死曲線。選取75%左右致死率的時(shí)間再進(jìn)行孢子懸液誘變處理，適當(dāng)稀釋后涂酪素平板。

硫酸二乙酯(DES)誘變處理：取經(jīng)UV誘變篩選后所得變異菌株，用不同劑量的DES誘變處理，測(cè)定DES對(duì)變異菌株的誘變致死率，根據(jù)致死率選擇合適的DES誘變劑量處理變異菌株的孢子懸液，加25% Na2S2O3溶液中止誘變反應(yīng)，將處理后的懸液適當(dāng)稀釋后涂酪素平板。

1.2.3 變異菌株的篩選

酪素平板水解透明圈初篩法：將經(jīng)過(guò)誘變處理后的孢子懸液進(jìn)行不同程度稀釋后涂布于酪素平板，30 ℃培養(yǎng)3 d，從中選取分離好、透明圈大且清晰、孢子致密的菌落，用無(wú)菌牙簽取少量孢子再點(diǎn)種于酪素平板，30 ℃培養(yǎng)3 d，分別測(cè)定各個(gè)單菌落透明圈直徑和菌落直徑，計(jì)算 HC值。HC值=透明圈直徑/菌落直徑。選取HC值較大的菌株進(jìn)行復(fù)篩。

固態(tài)發(fā)酵復(fù)篩法：將經(jīng)過(guò)初篩后所得菌株的孢子懸浮液，分別接種于復(fù)篩固體培養(yǎng)基，攤開(kāi)成1 cm的薄層在雙層紗布上，于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中28 ℃、100%相對(duì)濕度(RH)條件下培養(yǎng)72 h，測(cè)定蛋白酶活力。選取蛋白酶活最高的菌株作為下一步誘變的出發(fā)菌株或作為生產(chǎn)菌株。

1.2.4 蛋白酶活力測(cè)定方法

采用Folin-酚法測(cè)定蛋白酶活力。

準(zhǔn)確稱取鮮曲5 g加50 mL pH 7.2、0.2 mol/L磷酸緩沖液，將曲充分打散，于40 ℃水浴中恒溫浸提1 h，用定性濾紙過(guò)濾，得酶液。酶液用磷酸緩沖液進(jìn)行適當(dāng)稀釋后用Folin-酚法測(cè)其蛋白酶活，同時(shí)測(cè)定鮮曲水分含量。

蛋白酶活力單位定義：在40 ℃、pH 7.2條件下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸的酶量為一個(gè)酶活力單位(U)。

2 結(jié)果與分析

2.1 UV誘變結(jié)果

2.1.1 UV誘變致死曲線

將經(jīng)過(guò)不同時(shí)間UV誘變處理后的孢子懸浮液適當(dāng)稀釋后涂布在CYA平板上，30 ℃培養(yǎng)3 d，根據(jù)平板上長(zhǎng)出的菌落數(shù)與未經(jīng)處理的平板上菌落數(shù)進(jìn)行比較，計(jì)算各照射時(shí)間下的致死率，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 UV誘變致死曲線Fig.1 The lethality curve of UV mutation

一般認(rèn)為，UV誘變?cè)?5%致死率時(shí)正突變率比較高。由圖1可知，照射時(shí)間為120 s時(shí)，該菌株的UV誘變致死率(76%)在75%左右，所以后面的誘變時(shí)間采用120 s。

2.1.2 UV誘變初篩結(jié)果

將米曲霉孢子懸液用紫外線照射120 s后，涂布于酪素平板上，選取15株單菌落分離好、透明圈大且清晰的菌落再點(diǎn)種在酪素平板，培養(yǎng)后測(cè)得各菌落的HC值為：原種1.32、U-11.37、U-21.45、U-31.36、U-41.62、U-51.73、U-61.71、U-71.56、U-81.33、U-91.67、U-101.78、U-111.43、U-121.82、U-131.72、U-141.58、U-151.69。

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，挑選出的15株突變菌株的HC值都比出發(fā)菌株要大一些。為進(jìn)一步驗(yàn)證其產(chǎn)酶水平，從中挑選HC值最大的U-5、U-10、U-12和U-13進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶。

2.1.3 UV誘變復(fù)篩結(jié)果

將經(jīng)過(guò)UV誘變初篩挑選出的4株突變菌株和原種分別接種到復(fù)篩固體培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶，用Folin-酚法檢測(cè)其蛋白酶活，結(jié)果為：原種3128 U/g(干曲)、U-54836 U/g(干曲)、U-105261 U/g(干曲)、U-126749 U/g(干曲)、U-134904 U/g(干曲)。

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，蛋白酶活最高的是U-12，這與初篩的結(jié)果基本是一致的。選取U-12作為出發(fā)菌株進(jìn)行后面的DES誘變處理。

2.2 DES誘變結(jié)果

2.2.1 DES誘變致死率

取U-12孢子懸液各10 mL，分別加入不同劑量的DES醇溶液，以配制成0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1.0%不同的終濃度，充分振蕩分散，于30 ℃振蕩處理2 h，分別加入5 mL 25% Na2S2O3溶液中止誘變反應(yīng)。將處理后的懸液適當(dāng)稀釋后涂CYA平板。與未經(jīng)處理的U-12進(jìn)行比較，根據(jù)平板上長(zhǎng)出的菌落數(shù)計(jì)算出不同濃度下的致死率。結(jié)果為：0%的致死率0%，0.2%的致死率21%，0.4%的致死率58%，0.6%的致死率79%，0.8%的致死率93%，1.0%的致死率100%。

為防止U-12回復(fù)突變，同時(shí)為進(jìn)一步提高其產(chǎn)酶水平，后面的誘變采用0.8%的高致死率劑量進(jìn)行誘變處理。

2.2.2 DES誘變初篩結(jié)果

取U-12孢子懸液用0.8%的DES處理，適當(dāng)稀釋后涂布于酪素平板，培養(yǎng)后選取12株單菌落分離好、透明圈大且清晰的菌落再點(diǎn)種于酪素平板，培養(yǎng)后分別測(cè)得各菌落的HC值為：U-121.80、UD-11.88、UD-21.86、UD-31.94、UD-41.85、UD-52.54、UD-62.23、UD-72.76、UD-81.90、UD-91.97、UD-101.88、UD-112.48、UD-12。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，從中選取HC值最大的4株突變菌株UD-5、UD-6、UD-7、UD-11進(jìn)行后面的固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶復(fù)篩。

2.2.3 DES誘變復(fù)篩結(jié)果

將DES誘變初篩的4株突變菌株和U-12及原種的孢子懸液分別接種到復(fù)篩固體培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶，用Folin-酚法分別檢測(cè)其蛋白酶活，結(jié)果為：原種3436 U/g(干曲)、U-126693 U/g(干曲)、UD-59752 U/g(干曲)、UD-68920 U/g(干曲)、UD-711059 U/g(干曲)、UD-119327 U/g(干曲)。

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，UD-7的蛋白酶活最高，干基酶活達(dá)到11059 U/g，比U-12和原種的蛋白酶活都有顯著提高。故后面選取UD-7突變菌株進(jìn)行制曲及釀造工藝條件的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)研究。

2.3 UD-7遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將UD-7共進(jìn)行7次試管斜面?zhèn)鞔囵B(yǎng)，每傳代一次，將其孢子懸液接種至復(fù)篩固體培養(yǎng)基進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶，用Folin-酚法分別檢測(cè)其蛋白酶活，結(jié)果為：第Ⅰ代11210 U/g(干曲)、第Ⅱ代11078 U/g(干曲)、第Ⅲ代11432 U/g(干曲)、第Ⅳ代10986 U/g(干曲)、第Ⅴ代11105 U/g(干曲)、第Ⅵ代11350 U/g(干曲)、第Ⅶ代11097 U/g(干曲)。

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，經(jīng)過(guò)7次傳代培養(yǎng)，UD-7的蛋白酶活水平都能保持在11000 U/g左右，沒(méi)有太大的變化，說(shuō)明UD-7具有較好的遺傳穩(wěn)定性，這為后面的進(jìn)一步研究及今后的工業(yè)化生產(chǎn)打下了良好的基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

米曲霉(滬釀3.042)是我國(guó)醬油生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用的最經(jīng)典生產(chǎn)菌種，在以豆粕、花生粕、麩皮等植物性蛋白為主要原料的基質(zhì)上生長(zhǎng)良好，產(chǎn)蛋白酶活水平高，生產(chǎn)轉(zhuǎn)化率高，醬油產(chǎn)品鮮香味濃郁[16-18]。本項(xiàng)目研究發(fā)現(xiàn)，米曲霉在以蝦頭蝦殼粉等動(dòng)物性蛋白為主要原料的基質(zhì)上長(zhǎng)勢(shì)不太好，產(chǎn)蛋白酶活水平也不太高。為使該菌株適應(yīng)蝦頭蝦殼粉等動(dòng)物性蛋白生長(zhǎng)環(huán)境，提高其產(chǎn)蛋白酶活水平，從而提高原料中蛋白質(zhì)等有效成分的轉(zhuǎn)化利用率，先對(duì)米曲霉菌種進(jìn)行了多輪的誘變選育。

通過(guò)UV誘變，得到了一株蛋白酶活較高的突變菌株U-12，其在以蝦頭蝦殼粉為主要原料的固體培養(yǎng)基上的蛋白酶產(chǎn)酶水平達(dá)到了6749 U/g(干曲)，比出發(fā)菌株滬釀3.042(3128 U/g)提高了116%。在U-12的基礎(chǔ)上再通過(guò)DES誘變，得到了一株蛋白酶活最高的突變菌株UD-7，其在以蝦頭蝦殼粉為主要原料的固體培養(yǎng)基上的蛋白酶產(chǎn)酶水平達(dá)到11059 U/g(干曲)，比U-12(6693 U/g)提高了65%，比出發(fā)菌株滬釀3.042(3436 U/g)提高了222%。通過(guò)7次傳代培養(yǎng)和固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶，其產(chǎn)蛋白酶活水平變化幅度不大，說(shuō)明其具有較好的遺傳穩(wěn)定性，這為后面的制曲和釀造研究過(guò)程打下了良好的基礎(chǔ)。