劉文浩，徐曉云，吳婷，徐若瀅，劉浩越

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢 430070)

小龍蝦，學(xué)名克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)，也稱紅螯蝦和淡水小龍蝦，是我國(guó)重要的淡水經(jīng)濟(jì)蝦[1]。小龍蝦肉質(zhì)有彈性，味道鮮美，風(fēng)味獨(dú)特，具備蛋白質(zhì)含量高、脂肪和膽固醇含量低等特點(diǎn)，富含鎂、鋅、碘、硒和蝦青素等對(duì)人體健康有益的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，受到消費(fèi)者的廣泛喜愛[2-3]。但是小龍蝦的水分、蛋白質(zhì)含量高，加之運(yùn)輸和儲(chǔ)藏過程中的溫度波動(dòng)和環(huán)境影響，易滋生微生物腐敗變質(zhì)，導(dǎo)致貨架期較短[4-6]。鄧靈等[7]研究發(fā)現(xiàn)熟制小龍蝦中主要有蠟樣芽孢桿菌與蘇云金芽孢桿菌；周濤等[8]在不同溫度存放即食小龍蝦，探究了其微生物菌群變化，在4 ℃貯藏條件下優(yōu)勢(shì)菌群為海洋桿菌屬和希瓦氏菌屬，在25 ℃貯藏條件下的優(yōu)勢(shì)菌群為哈撒韋氏菌屬、芽孢桿菌屬、狹義梭菌屬，兩種貯藏溫度下優(yōu)勢(shì)腐敗菌不同；于曉慧等[9]從儲(chǔ)藏末期即食小龍蝦中分離出的優(yōu)勢(shì)腐敗菌為檸檬酸桿菌。

常見的蝦類產(chǎn)品防腐保鮮方法有低溫儲(chǔ)藏、加熱殺菌、輻照殺菌、真空包裝、氣調(diào)包裝、食品防腐劑的添加等，其中添加食品防腐劑能夠在保證食品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和風(fēng)味的同時(shí)起到抑菌、抗氧化的作用，可有效防止腐敗變質(zhì)，延長(zhǎng)產(chǎn)品貨架期。目前天然抑菌劑和化學(xué)防腐劑相比具有安全性高和抑菌譜廣等優(yōu)點(diǎn)，按照來源可分為動(dòng)物源、植物源和微生物源三類，有不同的應(yīng)用范圍和特點(diǎn)，就即食食品延長(zhǎng)貨架期來說，具備較高的研究?jī)r(jià)值[10-11]。ε-聚賴氨酸鹽酸鹽是鏈霉菌屬發(fā)酵過程中的代謝產(chǎn)物，經(jīng)分離提取精制而獲得，是一種生物防腐劑具有抑菌能力強(qiáng)，抑菌范圍廣、水溶性好、熱穩(wěn)定性強(qiáng)等特點(diǎn)[12]，根據(jù)GB 2760-2014添加限量為0.30 g/kg。李秋瑩等[13]綜述了ε-聚賴氨酸在水產(chǎn)品中不同的應(yīng)用方式和抑菌機(jī)理，能有效保持水產(chǎn)品的新鮮程度，延長(zhǎng)貨架期；楊華等[14]制備了ε-聚賴氨酸鹽酸鹽微膠囊并將其應(yīng)用在美國(guó)紅魚魚片中，具有較好的保鮮性能和長(zhǎng)效抑菌性。

因此，本研究對(duì)即食小龍蝦中的腐敗菌進(jìn)行分離鑒定，通過單因素抑菌試驗(yàn)確定ε-聚賴氨酸鹽酸鹽的最佳抑菌濃度，并應(yīng)用在產(chǎn)品中，通過對(duì)15 ℃存放過程中菌落總數(shù)、大腸菌群、Aw、TVB-N、TBARS的研究，分析了天然保鮮劑對(duì)小龍蝦的保鮮效果及貨架期的影響，為進(jìn)一步研究小龍蝦及其制品的防腐保鮮提供了一定科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

即食小龍蝦(原料小龍蝦經(jīng)油炸、鹵制、攤晾、氣調(diào)包裝等環(huán)節(jié)制作)：某醬鹵食品有限公司提供；平板計(jì)數(shù)瓊脂、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂、煌綠乳糖膽鹽瓊脂、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯：北京陸橋技術(shù)股份有限公司；DNA提取試劑盒：武漢擎科生物有限公司；ε-聚賴氨酸鹽酸鹽：浙江新銀象生物工程有限公司；D-異抗壞血酸鈉：諸城華源生物工程有限公司；甲基紅、溴甲酚綠、2-硫代巴比妥酸：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為分析純。

1.1.2 儀器

DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HWS-260恒溫恒濕箱 寧波樂電儀器制造有限公司；SW-CJ-2D雙人超凈工作臺(tái) 浙江蘇凈凈化設(shè)備有限公司；DK-98-Ⅱ電 熱恒溫水浴鍋 天津泰斯特儀器有限公司；SHA-A恒溫振蕩器 常州天瑞儀器有限公司；GI54DP高壓滅菌器 廈門致微儀器有限公司；UV759紫外可見分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；TDZ5-WS離心機(jī) 湖南平凡科技有限公司；AR224CN電子天平 奧豪斯儀器有限公司；HD-3A水分活度測(cè)量?jī)x 無錫華科儀器儀表有限公司；KDN-103A自動(dòng)定氮儀 上海纖檢儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 氣調(diào)包裝即食小龍蝦中腐敗菌的分離純化

按GB/T 4789.2-2010中的方法略有改動(dòng)，將樣品稀釋液取0.1 mL涂布于已滅菌的NA營(yíng)養(yǎng)瓊脂，同時(shí)做空白對(duì)照，每組樣品做3組平行。于37 ℃恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)48 h 后，選取菌落數(shù)在30～300的稀釋度進(jìn)行計(jì)數(shù)。

根據(jù)菌落形態(tài)、革蘭氏染色結(jié)果進(jìn)行分類，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上劃線分離(重復(fù)3次劃線純化)，于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，挑取典型單一菌落于-20 ℃磁珠保存。

1.2.2 腐敗菌的16S rDNA鑒定

1.2.2.1 提取細(xì)菌基因組DNA

將低溫保藏的菌種用LB培養(yǎng)基于37 ℃振蕩培養(yǎng)18 h活化，用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA，具體步驟根據(jù)試劑盒使用說明書。

1.2.2.2 PCR擴(kuò)增

用16S通用引物，2 μL的27F(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)，2 μL的1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)對(duì)DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR參數(shù)設(shè)置為98 ℃預(yù)變性2 min，98 ℃變性10 s，57 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃終延伸5 min，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)PCR產(chǎn)物。

1.2.2.3 由武漢擎科生物有限公司測(cè)序

對(duì)獲得的序列在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST序列分析，選取相似度高的基因序列，采用MEGA 7.0軟件分析構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 保鮮劑對(duì)腐敗菌的抑制作用

對(duì)分離純化的兩種菌進(jìn)行活化和復(fù)壯。從磁珠保藏管中分別取出一顆磁珠放入含有100 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的錐形瓶中，于恒溫水浴搖床37 ℃，150 r/min培養(yǎng)18 h，菌液濃度約為108CFU/mL。

對(duì)ε-聚賴氨酸鹽酸鹽按照0.10，0.15，0.20，0.25，0.30 g/kg濃度梯度用無菌水配制成100 mL的抑菌液備用。

根據(jù)顧勝[15]的方法有所改動(dòng)，活化菌液濃度約為108CFU/mL，在無菌操作下稀釋6～7倍(至可計(jì)數(shù))，分別吸取同等體積的菌液和抑菌液到試管中混勻，同時(shí)將相同體積的菌液與營(yíng)養(yǎng)肉湯混勻做空白對(duì)照，各取0.1 mL至培養(yǎng)平皿中，倒入已滅菌冷卻至45～50 ℃的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，充分混勻，凝固后倒置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察計(jì)數(shù)。統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)，計(jì)算抑菌率，抑菌率=(空白組菌落數(shù)-抑菌組菌落數(shù))÷空白組菌落數(shù)×100%。

1.2.4 保鮮劑的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

ε-聚賴氨酸鹽酸鹽按照配比加入到小龍蝦的鹵制中，以不加保鮮劑的小龍蝦為對(duì)照。在15 ℃儲(chǔ)藏中測(cè)定產(chǎn)品的感官、菌落總數(shù)、大腸菌群、TBARS值、TVB-N值、Aw值驗(yàn)證保鮮劑對(duì)小龍蝦的保鮮效果。

1.2.5 指標(biāo)測(cè)定1.2.5.1 感官評(píng)定

采取滿分10分的評(píng)分制度[16-17]，由6名感官評(píng)定人員參與評(píng)鑒，對(duì)氣調(diào)包裝即食小龍蝦從肉質(zhì)、外觀、氣味3個(gè)方面進(jìn)行分析，當(dāng)評(píng)分在6分以下則表示感官品質(zhì)較差、不可接受，具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 The sensory evaluation criteria

1.2.5.2 菌落總數(shù)的測(cè)定

按照GB 4789.2-2016中食品微生物菌落總數(shù)的測(cè)定方法實(shí)行。

1.2.5.3 大腸菌群的測(cè)定

按照GB 4789.3-2016中食品微生物大腸菌群的平板計(jì)數(shù)法實(shí)行。

1.2.5.4 水分活度(Aw)的測(cè)定

按照GB 5009.238-2016中食品水分活度的水分活度儀擴(kuò)散法實(shí)行。

1.2.5.5 揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)的測(cè)定

按照GB 5009.228-2016中食品中揮發(fā)性鹽基氮的自動(dòng)凱氏定氮儀法實(shí)行。

1.2.5.6 脂質(zhì)過氧化(TBARS)的測(cè)定

稱取10 g 絞碎均勻的蝦肉，加入50 mL 7.5%三氯乙酸和0.1% EDTA，振蕩30 min后過濾，取上清液5 mL加入5 mL TBA 溶液，沸水浴加熱40 min，冷卻后 4000 r/min離心20 min，取上清液加入5 mL氯仿，搖勻靜置分層，取上清液在532 nm處比色[18-19]。TBARS值計(jì)算公式如下：

TBARS/(mg/kg)=A532÷W×9.48。

式中: A532為待測(cè)液在532 nm處的吸光度值；W為樣品質(zhì)量，g。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)采取3組平行，用SPSS 21和Excel軟件處理數(shù)據(jù)，用Origin作圖，采用NCBI網(wǎng)站和MEGA 7軟件分析16S rDNA測(cè)序結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 平板菌落計(jì)數(shù)和腐敗菌的分離

即食小龍蝦肉經(jīng)均質(zhì)、濃度梯度稀釋后，測(cè)定菌落總數(shù)和大腸菌群，結(jié)果見圖1。15 ℃的氣調(diào)包裝即食小龍蝦在第2天大腸菌群超過2 lg CFU/g，根據(jù)GB 10136-2015，已超標(biāo)，不能食用。

圖1 即食小龍蝦菌落數(shù)Fig.1 The bacterial colony count of ready-to-eat crayfish

根據(jù)菌落形態(tài)、革蘭氏染色結(jié)果對(duì)平板上的菌落進(jìn)行分類，并計(jì)算所占比例，結(jié)果見表2。對(duì)腐敗菌劃線分離，保藏備用。

表2 腐敗菌的形態(tài)特征及比例Table 2 The morphological characteristics and proportion of spoilage bacteria

2.2 16S rDNA鑒定

對(duì)篩選得到的兩株菌進(jìn)行DNA提取，利用通用引物進(jìn)行PCR序列擴(kuò)增，產(chǎn)物凝膠電泳圖見圖2，條帶單一明亮，大小約為1200 bp。

圖2 菌株擴(kuò)增凝膠電泳圖Fig.2 Gel electrophoresis of strain amplification

對(duì)PCR產(chǎn)物測(cè)序，得到基因序列在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST序列分析，選取相似度在98%以上的菌株用MEGA 7軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖3。

圖3 菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strains

由圖3可知，兩株菌歸類為弗氏檸檬酸桿菌，將其命名為弗氏檸檬酸桿菌J1和弗氏檸檬酸桿菌J2。

2.3 ε-聚賴氨酸鹽酸鹽對(duì)腐敗菌的抑菌效果

ε-聚賴氨酸鹽酸鹽作為一種廣譜抑菌劑，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、真菌均有抑制作用，它是通過破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞壁膜的完整性，造成物質(zhì)外滲，影響蛋白質(zhì)合成等正常生理功能，抑制微生物生長(zhǎng)[20-21]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ε-聚賴氨酸鹽酸鹽對(duì)弗氏檸檬酸桿菌J1和J2均具有較強(qiáng)的抑制作用，在低濃度添加量0.1 g/kg時(shí)就可達(dá)到抑菌率100%，未超出GB 2760-2014的添加限量0.30 g/kg，可作為單一防腐劑使用。

2.4 天然保鮮劑的保鮮效果應(yīng)用結(jié)果

即食小龍蝦在存放過程中由于溫度波動(dòng)，脂肪和蛋白質(zhì)氧化等容易滋生微生物，引起產(chǎn)品腐敗，根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)室研究基礎(chǔ)添加1.5% D-異抗壞血酸鈉能夠有效降低醬鹵產(chǎn)品的氧化程度，因此添加0.01% ε-聚賴氨酸鹽酸鹽和1.5% D-異抗壞血酸鈉可達(dá)到抑制微生物生長(zhǎng)和抗氧化的目的，延長(zhǎng)氣調(diào)包裝即食小龍蝦在(15±2) ℃儲(chǔ)藏條件下的貨架期。

2.4.1 感官評(píng)價(jià)

由表3可知，隨著存放時(shí)間延長(zhǎng)，對(duì)照組和保鮮劑處理組的感官評(píng)分逐漸降低，但處理組下降的程度明顯小于對(duì)照組。對(duì)照組在1～3 d，實(shí)驗(yàn)組在1～5 d時(shí)小龍蝦的組織結(jié)構(gòu)完整，肉質(zhì)緊實(shí)有彈性，體表顏色鮮紅，氣味正常，無明顯變化，處于一級(jí)和二級(jí)鮮度，感官可接受。對(duì)照組到第4天，處理組到第6天，感官評(píng)分<6，此時(shí)小龍蝦結(jié)構(gòu)變得松散，蝦肉發(fā)硬發(fā)黑，外殼變暗紅，出現(xiàn)黑色斑點(diǎn)，略帶異常氣味，感官不可接受，認(rèn)定小龍蝦已經(jīng)腐敗變質(zhì)。說明ε-聚賴氨酸鹽酸鹽和D-異抗壞血酸鈉維持了小龍蝦的感官品質(zhì)，抑制了存放過程中微生物的滋生，起到了較好的防腐保鮮效果，延長(zhǎng)了產(chǎn)品的貨架期。

表3 感官評(píng)分Table 3 The sensory evaluation scores

2.4.2 菌落總數(shù)和大腸菌群

由圖4和圖5可知，在儲(chǔ)藏過程中即食小龍蝦的大腸菌群和菌落總數(shù)逐漸增加，對(duì)照組明顯高于保鮮劑處理組。根據(jù)GB 10136-2015和李肖嬋的研究[22]，大腸菌群數(shù)2 lg CFU/g和菌落總數(shù)5 lg CFU/g為貨架期終點(diǎn)。對(duì)照組在第2天時(shí)大腸菌群數(shù)已超過2 lg CFU/g，產(chǎn)品不能食用；處理組在1～4 d時(shí)大腸菌群和菌落總數(shù)都<10，第5天開始微生物生長(zhǎng)，第6天時(shí)大腸菌群數(shù)到3.6 lg CFU/g，菌落總數(shù)達(dá)到5.1 lg CFU/g，小龍蝦已經(jīng)腐敗。與對(duì)照組相比，保鮮劑明顯延緩了微生物的生長(zhǎng)，保證了即食小龍蝦的存放，貨架期延長(zhǎng)了4 d。

圖4 大腸菌群變化Fig.4 Changes of coliform

圖5 菌落總數(shù)變化Fig.5 Changes of the total number of bacterial colony

2.4.3 TVB-N變化

由圖6可知，小龍蝦在存放中揮發(fā)性鹽基氮的含量逐漸升高，且對(duì)照組的含量顯著高于保鮮處理組。根據(jù)GB 2733-2015和于曉慧的研究，將TVB-N值20 mg/100 g作為腐敗臨界值，對(duì)照組在1～3 d內(nèi)揮發(fā)性鹽基氮的含量持續(xù)上升，達(dá)到21.6 mg/100 g。處理組在1～4 d內(nèi)緩慢增長(zhǎng)，由于微生物的生長(zhǎng)分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生鹽基氮類物質(zhì)，在第6天達(dá)到22.3 mg/100 g，產(chǎn)品不可食用。因此，保鮮劑的處理能夠抑制即食小龍蝦中微生物的生長(zhǎng)，減緩揮發(fā)性鹽基氮值的升高，有效延長(zhǎng)了產(chǎn)品的貨架期。

圖6 TVB-N值變化Fig.6 Changes of TVB-N values

2.4.4 TBARS值的變化

由圖7可知，TBARS值與即食小龍蝦的儲(chǔ)藏時(shí)間呈正相關(guān)，這是由于在存放過程中小龍蝦中的不飽和脂肪酸不斷被氧化產(chǎn)生醛和酮等過氧化物[23]，使TBARS值升高。對(duì)照組明顯高于保鮮劑處理組，是由于ε-聚賴氨酸鹽酸鹽抑制微生物的生長(zhǎng)分解脂肪，D-異抗環(huán)血酸鈉抑制脂質(zhì)的過氧化，減緩了TBARS值的增長(zhǎng)，起到了保鮮的作用。

圖7 TBARS值變化Fig.7 Changes of TBARS values

3 結(jié)論

通過對(duì)15 ℃下儲(chǔ)存的氣調(diào)包裝即食小龍蝦中腐敗菌進(jìn)行分離篩選，16S rDNA序列鑒定得到優(yōu)勢(shì)腐敗菌為弗氏檸檬酸桿菌；研究了ε-聚賴氨酸鹽酸鹽對(duì)腐敗菌的抑制作用，使用量在0.1～0.3 g/kg范圍內(nèi)均能達(dá)到100%抑菌率；添加了0.01% ε-聚賴氨酸鹽酸鹽和1.5% D-異抗壞血酸鈉的氣調(diào)包裝即食小龍蝦在(15±2) ℃條件下，能夠有效保持小龍蝦的感官品質(zhì)，明顯減少了微生物數(shù)量的增長(zhǎng)，減緩了TVB-N含量、TBARS值的上升速率，保持了產(chǎn)品的新鮮程度，使即食小龍蝦的貨架期由原來的2 d延長(zhǎng)到6 d。