曾文婷 覃紹敏 吳健敏* 梁小莉 白安斌 劉金鳳 陳鳳蓮 秦樹(shù)英 馬 玲

(1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧 530004；2.廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所，廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530001；3.廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧 530007)

纖維素是植物中主要的多糖化合物[1]，廣泛存在于秸稈、稻草、谷物、豆類(lèi)、麥類(lèi)及其加工產(chǎn)品等動(dòng)物飼料中[2]。然而，植物細(xì)胞壁的復(fù)雜結(jié)構(gòu)嚴(yán)重阻礙了富含纖維素的植物在畜牧業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用[3]，為了解決這一問(wèn)題，常使用纖維素酶將植物細(xì)胞壁等植物纖維降解為葡萄糖，以提高其利用率和轉(zhuǎn)化率。微生物是纖維素酶的主要來(lái)源，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，迄今為止，國(guó)內(nèi)外共報(bào)道了約53個(gè)屬的幾千個(gè)菌株可產(chǎn)纖維素酶，包括細(xì)菌、真菌、放線菌等[4]。幾乎所有哺乳動(dòng)物，包括草食性哺乳動(dòng)物，自身不能產(chǎn)生纖維素酶，而是依靠腸道微生物的幫助來(lái)消化纖維素，因此，哺乳動(dòng)物腸道中有豐富的纖維素降解菌資源。此外，動(dòng)物來(lái)源的纖維素降解菌在粗纖維飼料應(yīng)用上有天然的優(yōu)勢(shì)，其大多是腸道固有菌，較容易適應(yīng)畜禽體內(nèi)的腸道內(nèi)環(huán)境并發(fā)揮作用。因此，從動(dòng)物腸道中篩選獲得有效的纖維素降解菌，對(duì)粗纖維飼料的開(kāi)發(fā)利用具有重要意義。

動(dòng)物源纖維素降解菌的研究主要集中在植食性動(dòng)物上，其腸道和糞便是纖維素降解菌的重要來(lái)源，研究表明，反芻動(dòng)物瘤胃中存在的白色瘤胃球菌(Ruminococcusalbus)、黃色瘤胃球菌(Ruminococcusflavefaciens)和產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌(Fibrobactersuccinogenes)是公認(rèn)的瘤胃三大優(yōu)勢(shì)纖維素降解菌[5]；何靜等[6]在雙峰駝的瘤胃內(nèi)容物中分離獲得1株纖維素降解菌，該菌株能明顯分解纖維素。此外，在大熊貓[7-8]、豬[9]等雜食性動(dòng)物的糞便或腸道中也分離到了產(chǎn)纖維素酶的細(xì)菌，這些細(xì)菌普遍集中在瘤胃球菌屬、梭菌屬、擬桿菌屬、普雷沃氏菌屬、纖維桿菌屬、芽孢桿菌屬和毛螺旋菌屬。

竹鼠(Rhizomys)又稱(chēng)竹鼬、竹根鼠、芒貍等，是一種皮肉兼用且營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值較高的珍貴特種動(dòng)物[10]。竹鼠以采食植物性食物為主，對(duì)粗纖維和木質(zhì)素的消化率較高，耐粗飼，是所有飼養(yǎng)動(dòng)物中粗纖維利用率最高的動(dòng)物，并且是唯一和大熊貓類(lèi)似，能在腸道中高效降解纖維素的單胃哺乳動(dòng)物。研究表明，大熊貓?bào)w內(nèi)并不存在編碼纖維素酶的基因，而是依靠腸道內(nèi)微生物進(jìn)行食物中纖維素的降解[11]。雖然未見(jiàn)對(duì)竹鼠進(jìn)行全基因組測(cè)序的報(bào)道，但可以推測(cè)，竹鼠腸道內(nèi)微生物對(duì)食物中纖維素的降解應(yīng)該起到了關(guān)鍵的作用。目前，從竹鼠體內(nèi)分離纖維素降解菌的研究鮮有報(bào)道，僅寧俊平[12]從竹鼠體內(nèi)分離到7株兼性厭氧的纖維素降解菌以及曹曉燕[13]從竹鼠體內(nèi)分離到2株具有纖維素酶活性的嚴(yán)格厭氧的細(xì)菌，證實(shí)竹鼠體內(nèi)也存在能分解纖維素的細(xì)菌。上述研究均集中在對(duì)厭氧菌的分離。本試驗(yàn)改進(jìn)傳統(tǒng)的纖維素降解菌初篩方法，旨在從竹鼠腸道內(nèi)容物中篩選獲得具有較高纖維素酶活性的需氧菌，以期為秸稈、象草等高粗纖維含量飼料的開(kāi)發(fā)利用提供候選菌株。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品來(lái)源

廣西桂林市某竹鼠養(yǎng)殖場(chǎng)成年健康竹鼠腸道內(nèi)容物。

1.1.2 主要試劑

革蘭氏染色液、芽孢染色液、莢膜染色液、普通營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基、LB瓊脂培養(yǎng)基、MRS液體培養(yǎng)基、MRS瓊脂培養(yǎng)基、TSA瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、PDA瓊脂培養(yǎng)基為北京陸橋技術(shù)股份有限公司產(chǎn)品，細(xì)菌微量生化管為杭州濱和微生物試劑有限公司產(chǎn)品，細(xì)菌DNA抽提試劑盒為北京康為世紀(jì)公司產(chǎn)品，羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、CMC-Na瓊脂培養(yǎng)基、CMC-Na剛果紅培養(yǎng)基為山東拓普生物科技有限公司產(chǎn)品，DNA Ladder Marker、PCR Mix為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品，微晶纖維素為COOLABER生物科技有限公司產(chǎn)品，D-水楊苷為源葉生物有限公司產(chǎn)品，3，5-二硝基水楊酸(DNS)為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品，其他常規(guī)試劑均為分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基及主要溶液

鮮血瓊脂培養(yǎng)基：將無(wú)菌脫纖維羊血按照5%的量加入到冷卻至55～60 ℃的普通瓊脂培養(yǎng)基中，混合后倒入平板中冷卻至室溫。

種子培養(yǎng)基：氯化鈉5 g，牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH。

發(fā)酵培養(yǎng)基：CMC-Na/微晶纖維素/D-水楊苷10 g，磷酸氫二鉀1 g，硫酸鎂0.5 g，硫酸銨2 g，氯化鈉2.5 g，酵母粉2.5 g，蛋白胨5 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH。

濾紙培養(yǎng)基：濾紙條(每條：1.0 cm×3.6 cm，約0.03 g)5 g，酵母粉2 g，磷酸二氫鉀 0.5 g，硫酸鎂0.5 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH。

DNS試劑：稱(chēng)取DNS(10±1) g，置于約600 mL水中，逐漸加入氫氧化鈉10 g，在50 ℃水浴中攪拌溶解，再依次加入酒石酸甲鈉200 g、苯酚(重蒸)2 g和無(wú)水亞硫酸鈉5 g，待全部溶解并澄清后，冷卻至室溫，用水定容至1 L，過(guò)濾。濾液貯存于棕色試劑瓶中，于暗處放置7 d后使用。

1.2 樣品處理

稱(chēng)取竹鼠腸道內(nèi)容物1.0 g，轉(zhuǎn)移至盛有100 mL無(wú)菌水的三角瓶中，在80 ℃電熱恒溫振蕩水浴鍋中振蕩30 min，分別取上清液1 mL于LB、MRS和普通營(yíng)養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)12 h后，取1 mL發(fā)酵液于裝有9 mL無(wú)菌水的試管中，進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)謩e取10-4、10-5、10-6稀釋液200 μL，分別涂布到LB、MRS、TSA、普通營(yíng)養(yǎng)、麥康凱、CMC-Na、PDA和鮮血瓊脂平板上，每個(gè)稀釋梯度3個(gè)重復(fù)，涂布后的平板置于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h。

1.3 菌株純化及纖維素降解菌的初篩

在培養(yǎng)基上，分別挑取單個(gè)不同形態(tài)的菌在平板上劃線純化，直到平板上只有單菌落生長(zhǎng)為止。

將剛果紅平板打孔，孔徑為0.5 cm，對(duì)單個(gè)純化后的菌落進(jìn)行稀釋。用移液槍將其轉(zhuǎn)移到剛果紅平板的孔中，單個(gè)菌落重復(fù)3次，在37 ℃下培養(yǎng)24 h后用游標(biāo)卡尺測(cè)量剛果紅平板上透明圈的直徑，選取透明圈直徑(除去打孔孔徑)(D)與菌落直徑(d)比值(D/d值)較大的菌株進(jìn)行復(fù)篩。

挑取D/d值較大的菌落培養(yǎng)，在平板上反復(fù)劃線純化并培養(yǎng)4～5代后，將純化培養(yǎng)后的菌種加甘油于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 產(chǎn)酶特性研究

1.4.1 發(fā)酵液的制備

取純化培養(yǎng)好的各平板菌種接種于種子培養(yǎng)基，于37 ℃、220 r/min恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)14～16 h。取液體菌種，按1%的接種量分別接種于以3種底物(CMC-Na、微晶纖維素、D-水楊苷)為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基和濾紙培養(yǎng)基中，于37 ℃、180 r/min恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)24 h，在8 000 r/min條件下離心5 min，去除菌體，取上清液，得粗酶液[14]。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別吸取不同濃度(0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mg/mL)的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5 mL、緩沖溶液1.5 mL和DNS試劑3 mL于各標(biāo)準(zhǔn)管(每樣做3個(gè)平行)中，混勻。將標(biāo)準(zhǔn)管同時(shí)置于沸水浴中，反應(yīng)10 min。取出，迅速冷卻至室溫，用純水定容至25 mL，蓋塞，混勻。用10 mm比色杯，在分光光度計(jì)波長(zhǎng)540 nm處測(cè)量吸光度(OD)值。以葡萄糖量為橫坐標(biāo)，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得線性回歸方程。線性回歸系數(shù)在0.999 0以上時(shí)方可使用。

1.4.3 纖維素酶活性的測(cè)定

內(nèi)切葡聚糖酶(Cen)、外切葡聚糖酶(Cex)、β-葡萄糖苷酶(BG)和濾紙酶(FPA)活性的測(cè)定按李日強(qiáng)等[15]的方法進(jìn)行。分別吸取各菌株粗酶液、緩沖溶液和DNS試劑于各標(biāo)準(zhǔn)管(每樣做3個(gè)平行)中，混勻。將標(biāo)準(zhǔn)管同時(shí)置于沸水浴中，反應(yīng)10 min。取出，迅速冷卻至室溫，用純水定容至25 mL，蓋塞，混勻。用10 mm比色杯，在分光光度計(jì)波長(zhǎng)540 nm處測(cè)量OD值，以滅活后的粗酶液作為空白對(duì)照。以(50.0±0.1) ℃、pH為6.0時(shí)1 min水解纖維素底物產(chǎn)生出相當(dāng)于1 μmol葡萄糖的還原糖量為1個(gè)酶活性單位，以U/mL表示。

1.4.4 培養(yǎng)條件對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響

1.4.4.1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響

將篩選出的菌株按1%接種量接種于種子培養(yǎng)基，于37 ℃、220 r/min恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)14～16 h后，得菌株種子液。取100 μL菌株種子液接入20 mL發(fā)酵培養(yǎng)基(pH為7.0)中，于37 ℃、185 r/min恒溫?fù)u床振蕩發(fā)酵培養(yǎng)6、12、24、36、48、60、72 h，測(cè)定其OD600 nm值和FPA活性。

1.4.4.2 pH對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響

將發(fā)酵培養(yǎng)基pH分別調(diào)至3、4、5、6、7、8、9和10，取菌株種子液100 μL接入20 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37 ℃、185 r/min恒溫?fù)u床振蕩發(fā)酵培養(yǎng)24 h，測(cè)定其OD600 nm值和FPA活性。

1.4.4.3 溫度對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響

取菌株種子液100 μL接入20 mL發(fā)酵培養(yǎng)基(pH為7.0)中，分別于30、37、43、50、57、65 ℃，185 r/min恒溫?fù)u床振蕩發(fā)酵培養(yǎng)24 h，測(cè)定其OD600 nm值和FPA活性。

1.5 產(chǎn)纖維素酶菌株的種屬鑒定

1.5.1 生理生化鑒定

取菌液于普通瓊脂培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，37 ℃下培養(yǎng)24 h觀察菌落形態(tài)；采用革蘭氏染色、芽孢染色和莢膜染色法，顯微鏡下觀察菌株形態(tài)；參考《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[16]和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[17]進(jìn)行生化試驗(yàn)，挑取純化培養(yǎng)的單菌落分別接種于生化管中，根據(jù)顏色的變化，判定試驗(yàn)結(jié)果。

1.5.2 分子生物學(xué)鑒定

使用細(xì)菌DNA抽提試劑盒提取細(xì)菌DNA，采用16S rDNA通用引物16sRp1(5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′)和16sRp2(5′-GTGTGACGGGCGGTGTGTAC-3′)，預(yù)計(jì)擴(kuò)增長(zhǎng)度1 380 bp，PCR反應(yīng)體系(25 μL)為：上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，細(xì)菌基因組(208 ng/μL)3 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

利用 Excel 2010對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理，采用SPSS 23.0和GraphPad Prism 7軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選

采用LB、MRS、TSA、普通營(yíng)養(yǎng)、麥康凱、CMC-Na、PDA和鮮血瓊脂平板分離獲得10株菌，依此命名為GL1～10。通過(guò)剛果紅培養(yǎng)基上產(chǎn)生透明圈的大小，篩選能降解纖維素的菌株，如圖1所示，GL-4、GL-5、GL-6和GL-8具有一定的產(chǎn)纖維素酶活性，其中GL-4的透明圈最大，直徑為23.54 mm；GL-6的透明圈最小，直徑為12.49 mm。

圖1 剛果紅培養(yǎng)基上形成的透明圈

通過(guò)測(cè)量透明圈直徑和菌落直徑，計(jì)算得出D/d值，詳見(jiàn)表1。由表中數(shù)據(jù)可知GL-4的D/d值最大，為3.45±0.05；GL-6的D/d值最小，為1.85±0.06。

表1 D/d值結(jié)果

2.2 纖維素酶活性

在篩選出的4株纖維素降解菌GL-4、GL-5、GL-6和GL-8中，GL-4的Cen和FPA活性最高，分別為49.32和25.13 U/mL；GL-8的Cex活性最高，為30.59 U/mL；GL-5的BG活性最高，為35.08 U/mL(圖2)。

圖2 纖維素酶活性測(cè)定結(jié)果

2.3 培養(yǎng)條件對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響

選擇產(chǎn)CMC和FPA活性最高的菌株GL-4進(jìn)行最佳培養(yǎng)條件篩選。

溫度對(duì)產(chǎn)酶能力的影響見(jiàn)圖3-a。GL-4的生長(zhǎng)性能(OD600 nm)和產(chǎn)酶能力(FPA活性)在30～37 ℃時(shí)隨溫度升高而升高，在37～57 ℃時(shí)隨溫度升高而急劇降低，在57 ℃時(shí)菌株不再生長(zhǎng)和產(chǎn)酶。上述結(jié)果說(shuō)明菌株GL-4產(chǎn)纖維素酶的最適溫度為37 ℃。

培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶能力的影響見(jiàn)圖3-b。對(duì)于GL-4，0～6 h是生長(zhǎng)調(diào)整期，6～36 h是對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，36～48 h是穩(wěn)定期，48 h后進(jìn)入衰亡期。發(fā)酵時(shí)間在0～24 h時(shí)，GL-4的產(chǎn)酶能力隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，并在24 h時(shí)達(dá)到頂峰，之后產(chǎn)酶能力隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)逐步降低，所以菌株GL-4的最佳培養(yǎng)時(shí)間為24 h。培養(yǎng)時(shí)間在0～24 h時(shí)，生長(zhǎng)曲線與FPA活性活性曲線的變化呈正相關(guān)，培養(yǎng)24 h之后，2個(gè)曲線的變化沒(méi)有明顯的相關(guān)性。

圖3 不同培養(yǎng)條件對(duì)菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)酶能力的影響

pH對(duì)產(chǎn)酶能力的影響見(jiàn)圖3-c。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為3～4時(shí)，GL-4的生長(zhǎng)性能和產(chǎn)酶能力隨著pH的升高而升高；在pH為4～6時(shí)，隨pH的升高稍微有所降低；之后又隨著pH的升高而升高，在pH為8時(shí)達(dá)到峰值；當(dāng)pH達(dá)到9時(shí)，菌株失活而無(wú)法產(chǎn)生纖維素酶。結(jié)果顯示，菌株GL-4在弱堿性的環(huán)境下能很好的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶，其產(chǎn)纖維素酶的最適pH為8。

2.4 產(chǎn)纖維素酶菌株的鑒定

選擇D/d值較大，且產(chǎn)纖維素酶活性較高的菌株GL-4、GL-5和GL-8進(jìn)行鑒定。

2.4.1 形態(tài)學(xué)鑒定

3株菌在普通瓊脂培養(yǎng)基平板上的形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果(表2)顯示，GL-4和GL-8菌落形態(tài)相似，呈邊緣整齊、表面光滑凸起的圓形菌落；鏡檢結(jié)果(表2、圖4)顯示，3株菌均為革蘭氏陽(yáng)性短桿菌。

表2 菌株的形態(tài)結(jié)構(gòu)

圖4 GL-4的顯微形態(tài)

2.4.2 生化鑒定

生化鑒定結(jié)果見(jiàn)表3。3株菌的生化試驗(yàn)結(jié)果大致相似，均能利用明膠、葡萄糖、蔗糖、淀粉和過(guò)氧化氫，分解糖類(lèi)產(chǎn)生乙酰基甲醇，不能利用木糖、阿拉伯糖、吲哚、硝酸鹽和枸櫞酸鹽，不能分解糖類(lèi)產(chǎn)酸。另外，3株菌中僅GL-8可利用甘露醇。生化試驗(yàn)結(jié)果符合芽孢桿菌的生化特性，初步確定3株菌均為枯草芽孢桿菌。

表3 生化鑒定結(jié)果

續(xù)表3項(xiàng)目 Items菌株 StrainsGL-4GL-5GL-8甘露醇 Mannitol--+枸櫞酸鹽 Citrate---乙酰甲基甲醇 V.P. +++甲基紅 MR-VP---淀粉 Starch+++過(guò)氧化氫 H2O2+++

2.4.3 16S rDNA鑒定

采用PCR方法擴(kuò)增菌株GL-4、GL-5和GL-8的16S rDNA序列，將克隆測(cè)序后序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，并用MEGA 7.0軟件構(gòu)建16S rDNA的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。BLAST比對(duì)結(jié)果顯示，GL-4、GL-5和GL-8的16S rDNA基因與枯草芽孢桿菌的基因序列一致性均大于98%。使用MEGA 7.0軟件進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果顯示，GL-4、GL-5和GL-8分別位于3個(gè)不同的枯草芽孢桿菌分支(圖5)，表明這3株菌均為枯草芽孢桿菌，與生理生化鑒定結(jié)果一致。

Bacillus sp.：芽孢桿菌屬；Bacteria：細(xì)菌；Uncultured Bacillus sp. clone RB-77：不可培養(yǎng)芽孢桿菌克隆 RB-77；Bacillus subtilis：枯草芽孢桿菌；Bacillus subtilis subsp.：枯草芽孢桿菌亞種；Bacillus cereus：蠟樣芽孢桿菌；Bacillus tequilensis：特基拉芽孢桿菌；Bacillus licheniformis：地衣芽孢桿菌；Bacillus pumilus：短小芽孢桿菌；Bacillus anthracis：炭疽芽孢桿菌；strain：菌株。

3 討 論

3.1 纖維素降解菌的分離篩選

剛果紅染色法是用于纖維素降解菌初篩的經(jīng)典方法，Ghezelbash等[18]采用的傳統(tǒng)剛果紅染色法是先在平板上培養(yǎng)細(xì)菌，再用剛果紅進(jìn)行染色，這個(gè)方法在用氯化鈉進(jìn)行清洗的過(guò)程中容易產(chǎn)生菌落脫落現(xiàn)象，造成菌落之間發(fā)生混雜，導(dǎo)致無(wú)法獲得準(zhǔn)確結(jié)果，且該方法操作繁瑣，不利于細(xì)菌的大量篩選。本研究對(duì)該方法進(jìn)行了部分改進(jìn)，在制備平板時(shí)即加入剛果紅，并在平板上進(jìn)行打孔，然后將菌落稀釋后加入孔內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h即可測(cè)量透明圈直徑。整個(gè)過(guò)程不需要對(duì)平板進(jìn)行清洗，克服了傳統(tǒng)方法的不足，試驗(yàn)結(jié)果更加準(zhǔn)確，且操作簡(jiǎn)便。本研究通過(guò)改進(jìn)的剛果紅染色法從竹鼠腸道內(nèi)容物中初步篩選獲得4株纖維素降解菌，通過(guò)測(cè)定纖維素酶活性，最終獲得3株產(chǎn)纖維素酶活性較強(qiáng)的菌株GL-4、GL-5和GL-8，經(jīng)鑒定均為枯草芽孢桿菌。GL-4的纖維素酶總活性高于寧俊平[12]和曹曉燕[13]在竹鼠腸道內(nèi)分離出的酪酸梭狀芽孢桿菌、沙雷氏菌、肺炎克伯雷氏菌等厭氧菌，其中最高的Cen活性為0.502 9 U/mL；也高于沈琦等[19]和樊程等[8]分別在豬和大熊貓的糞便中分離的解淀粉芽胞桿菌，前者Cen活性為7.64 U/mL，后者FPA活性為0.228 3 U/mL。

3.2 纖維素酶活性測(cè)定

纖維素酶降解纖維素的過(guò)程被認(rèn)為是3種酶協(xié)同作用的結(jié)果，有觀點(diǎn)認(rèn)為，纖維素酶發(fā)揮作用首先由Cen在纖維素分子內(nèi)部的無(wú)定形區(qū)進(jìn)行酶切產(chǎn)生新的末端，然后由Cex以纖維二糖為單位從末端進(jìn)行水解,每次切下1個(gè)纖維二糖分子，最后由BG將纖維二糖以及短鏈的纖維寡糖水解為葡萄糖。纖維素酶的3種組分作用的底物不同，Cen的水解底物包括羧甲基纖維素和磷酸溶脹纖維素等無(wú)定形纖維素；Cex的水解底物包括棉纖維和微晶纖維素等結(jié)晶度較高的纖維素；BG的水解底物是纖維寡糖和纖維二糖[20]。本試驗(yàn)對(duì)初篩菌株的3種纖維素酶和總酶(FPA)的活性均進(jìn)行了測(cè)定，能全面評(píng)估菌株的纖維素降解能力，結(jié)果顯示GL-4的FPA和Cen活性最高，說(shuō)明該菌株對(duì)于多種成分的纖維素底物和無(wú)定形纖維素底物有較強(qiáng)的降解解能力；GL-8的Cex活性最高，說(shuō)明該菌株對(duì)葡聚糖和纖維二糖有較強(qiáng)的降解解能力；GL-5的BG活性最高，說(shuō)明該菌株對(duì)纖維寡糖和纖維二糖的降解能力較強(qiáng)。因此，在后續(xù)的應(yīng)用研究中，可根據(jù)不同的發(fā)酵原料，選擇其中的1個(gè)或多個(gè)菌株混合使用，達(dá)到最佳的纖維素降解效果。

根據(jù)本試驗(yàn)中纖維素酶活性測(cè)定結(jié)果可知，不同菌株所產(chǎn)纖維素酶活性存在差異，同一株菌所產(chǎn)纖維素酶活性在不同碳源存在時(shí)也存在差異，本研究獲得的菌株GL-4是目前竹鼠源分離菌中產(chǎn)纖維素酶活性最強(qiáng)的細(xì)菌，對(duì)常見(jiàn)的4種纖維素底物均有較好的降解能力。

3.3 不同培養(yǎng)條件對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響

纖維素降解菌的產(chǎn)酶能力受到培養(yǎng)條件的影響，培養(yǎng)基的pH和培養(yǎng)溫度的改變均影響菌株的生長(zhǎng)，從而間接影響產(chǎn)酶能力，在強(qiáng)酸強(qiáng)堿和高溫條件下，菌株無(wú)法生長(zhǎng)及產(chǎn)酶。根據(jù)本研究結(jié)果，培養(yǎng)時(shí)間在0～24 h時(shí)，菌株GL-4的生長(zhǎng)與產(chǎn)酶能力呈正相關(guān)，即隨著菌量的增加，產(chǎn)酶量也隨之增加，并且在培養(yǎng)24 h時(shí)達(dá)到最高，24 h后，菌株依然處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，但產(chǎn)酶能力卻不再升高，直到48 h后，兩者又重新呈正相關(guān)。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的可能原因如下：1)GL-4的生長(zhǎng)曲線與殷曉敏等[21]的研究大致相同，但其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，達(dá)30 h，在24 h后隨著菌株生長(zhǎng)代謝的增強(qiáng)，培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不斷被消耗，菌株死亡率上升，產(chǎn)酶量下降；2)GL-4對(duì)溫度的變化較敏感，除37 ℃培養(yǎng)外，在其他溫度培養(yǎng)24 h后，其產(chǎn)酶能力均不高，在細(xì)菌發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中的溫度升高可能也會(huì)導(dǎo)致纖維素酶活性的降低，這與菌株的熱穩(wěn)定性有關(guān)[22]；3)GL-4在pH為4～8時(shí)，其所產(chǎn)纖維素酶活性一直保持較高狀態(tài)，但當(dāng)培養(yǎng)基pH離開(kāi)這個(gè)區(qū)間后，纖維素酶活性急劇下降，根據(jù)劉陽(yáng)等[23]的研究，枯草芽孢桿菌在發(fā)酵時(shí)會(huì)產(chǎn)生乳酸，從發(fā)酵開(kāi)始分泌直至48 h到達(dá)峰值，乳酸的生成導(dǎo)致培養(yǎng)基的pH發(fā)生改變，從而使纖維素酶活性發(fā)生改變。本研究中，GL-4在培養(yǎng)基pH為4～8時(shí)，纖維素酶活性均較高，這與Irfan等[24]的研究結(jié)果一致，說(shuō)明芽孢桿菌的產(chǎn)酶能力在一定pH范圍內(nèi)保持穩(wěn)定。本試驗(yàn)中GL-4的最適pH為8，與崔海洋等[25]的研究結(jié)果一致。

本研究?jī)H改變單一條件來(lái)分析培養(yǎng)條件對(duì)GL-4產(chǎn)酶能力的影響，未考慮各培養(yǎng)條件間相互影響的情況，有一定的局限性。柴秀娟等[26]采用響應(yīng)曲面回歸分析法對(duì)菌株進(jìn)行產(chǎn)酶條件優(yōu)化，優(yōu)化效果明顯。響應(yīng)曲面回歸分析法是一種通過(guò)對(duì)影響過(guò)程的因子及其交互作用進(jìn)行評(píng)價(jià)來(lái)優(yōu)化過(guò)程的有效方法[27]，可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)單因素變量?jī)?yōu)化試驗(yàn)的不足。下一步，我們將使用響應(yīng)曲面法進(jìn)一步優(yōu)化產(chǎn)酶條件，使分離菌株更好的在飼料發(fā)酵中發(fā)揮作用。

4 結(jié) 論

① 本試驗(yàn)從竹鼠腸道內(nèi)容物中獲得了3株纖維素降解菌——GL-4、GL-5和GL-8，經(jīng)形態(tài)特征、生化特性和分子生物學(xué)鑒定，確定均為枯草芽孢桿菌。

② 3株纖維素降解菌所產(chǎn)纖維素酶的活性有一定差異，GL-4的D/d值最大，為3.45±0.05，其Cen和FPA活性最高，分別為49.32和25.13 U/mL；GL-8的Cex活性最高，為30.59 U/mL；GL-5的BG活性最高，為35.08 U/mL。

③ 對(duì)GL-4進(jìn)行培養(yǎng)條件優(yōu)化，該菌株具有培養(yǎng)pH范圍廣和耐高溫的特點(diǎn)，在培養(yǎng)基pH為3～8、溫度為50 ℃時(shí)仍具有產(chǎn)酶能力。該菌株產(chǎn)酶的最適條件為發(fā)酵時(shí)間24 h、發(fā)酵培養(yǎng)基pH 8和發(fā)酵溫度37 ℃，是一株可用作粗纖維飼料添加劑的優(yōu)良候選菌株。