李文嘉 徐 彬 王琳燚 付 趁 王改利 馬慧慧 孫全友 鄧 文 白 杰 席燕燕 魏鳳仙 李紹鈺

(河南省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，鄭州 450002)

21世紀以來，我國生產(chǎn)力急劇升高，人民生活水平日益改善，人均肉蛋消費比例穩(wěn)步上升。肉雞養(yǎng)殖業(yè)在我國當今畜牧業(yè)生產(chǎn)中占有相當比重，年出欄量約為80億只。特別是2018年以來非洲豬瘟肆虐，生豬供應急劇下降，導致豬肉價格飛漲，人們轉(zhuǎn)而對雞肉的需求日益增高。然而，在養(yǎng)殖過程中，企業(yè)為降低成本，采用高密度集約化的飼養(yǎng)方式使得肉雞生理和環(huán)境壓力驟升[1]，病害頻發(fā)。因此，企業(yè)常在飼糧中添加少量抗生素以預防常見疾病，提高生產(chǎn)效率，維持動物健康[2-3]。但隨著抗生素的廣泛應用，其弊端日益突顯，例如長期使用抗生素會降低機體免疫力，并導致致病菌的耐藥性越來越強[4]；攝食含有抗生素的畜禽產(chǎn)品，最終通過食物鏈匯集于人體，威脅人類健康[5]；此外，劉菲等[6]研究發(fā)現(xiàn)，集約化家禽飼養(yǎng)場是抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes，ARGs)的重要來源。

自2020年7月1日起，我國已實行飼料全面禁抗，然而近幾年各種病害頻發(fā)，我國畜牧業(yè)發(fā)展面臨著嚴峻的挑戰(zhàn)。因此，迫切需要尋找一種或多種抗生素替代品，能起到增強動物自然防御功能的作用，而沒有抗生素所帶來的弊端，如耐藥性、藥物殘留等問題。近年來，龍須菜(Gracilarialemaneiformis)已成為我國四大經(jīng)濟栽培海藻之一，是一種傳統(tǒng)的可食用海藻，從龍須菜中提取的多糖也越來越受到人們的重視。研究指出，龍須菜多糖(Gracilarialemaneiformispolysaccharides，GLP)具有抗氧化[7-8]、抗腫瘤[9-10]、免疫調(diào)節(jié)[11]、降血糖[12]、改善腸道菌群等多種生物學功能[13]。然而，有關(guān)龍須菜多糖在肉雞上的應用罕見報道。在其他海藻多糖的研究中，郭曉波等[14]研究發(fā)現(xiàn)，海藻多糖可改善仔豬小腸上皮細胞屏障功能，促進緊密連接蛋白的表達；而薩仁娜[15]研究發(fā)現(xiàn)，海藻多糖對肉雞的生長無顯著影響，但可提高其淋巴細胞轉(zhuǎn)化率。

因此，伴隨著我國畜牧行業(yè)集約化、規(guī)模化程度的不斷提高，如何在提高畜產(chǎn)品產(chǎn)量的同時，提升產(chǎn)品品質(zhì)、減少環(huán)境污染成為畜牧行業(yè)亟待解決的問題?；邶堩毑硕嗵窃诳鼓[瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等方面的最新研究成果，針對肉雞集約化生產(chǎn)中所面臨的高應激、環(huán)境差、免疫力低下、抗生素積累等問題，本研究擬從調(diào)節(jié)肉雞的抗氧化能力、提高其免疫功能和改善其生長性能為切入點，為龍須菜多糖替代抗生素在實際生產(chǎn)中的應用以及研制復合新型抗生素替代品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

采用完全隨機試驗設計，選取1日齡、平均體重為(43.47±0.29) g的健康愛拔益加(AA)肉仔雞288只，隨機分成3個組，每組6個重復，每個重復16只雞(公母各占1/2)，各組體重無顯著差異(P>0.05)。每個重復放入1個籠(0.9 m×1.0 m)中。基礎(chǔ)飼糧采用玉米-豆粕型飼糧，參照《雞飼養(yǎng)標準》(NY/T 33—2004)配制成粉狀配合飼糧，其組成及營養(yǎng)水平見表1。對照(CON)組飼喂基礎(chǔ)飼糧，龍須菜多糖和抗生素(ANTI)組分別飼喂在基礎(chǔ)飼糧中添加0.1%龍須菜多糖和10 mg/kg抗生素的試驗飼糧。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎(chǔ))

1.2 試驗材料

試驗所用龍須菜多糖購自廣州某生物科技有限公司，有效含量為50%，主要成分為瓊二糖、瓊膠糖前體、6-OCH3-瓊二糖、6-OS03-瓊二糖等；抗生素為美國某有限公司提供，含50%的維吉尼亞霉素。

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗于河南省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所尉氏養(yǎng)殖基地進行，試驗飼糧為粉料，肉雞采用雙層籠養(yǎng)方式進行飼養(yǎng)。試驗期間肉雞自由采食和飲水，按正常免疫程序進行免疫接種。雞舍內(nèi)采用23 h人工光照，1 h黑暗處理，溫度由1日齡時的34 ℃逐步降低至21日齡時的24 ℃，然后保持大致穩(wěn)定。試驗期42 d，分為1～21日齡和22～42日齡2個階段。

1.4 樣品采集及指標測定

1.4.1 生長性能指標

試驗開始時對1日齡肉仔雞按組稱取其初始體重，并記錄。分別于21和42日齡時，空腹3 h后以每重復為單位測定肉仔雞的體重，同時統(tǒng)計各組給料量、剩余料量及雞只死亡數(shù)量，計算平均日采食量、平均日增重和料重比。

1.4.2 血清抗氧化和免疫指標

分別于21和42日齡時，從每個重復隨機選取2只體重相近的肉雞，利用乙二胺四乙酸(EDTA)真空管由翅靜脈采血2～3 mL，3 000 r/min離心15 min，-80 ℃分裝保存。血清中總抗氧化能力(T-AOC)，超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)活性及丙二醛(MDA)含量的測定均采用南京建成生物工程研究所試劑盒，按照試劑盒說明書要求進行操作，并用Biotech酶標儀進行檢測。同時，采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)競爭法測定血清中免疫球蛋白及細胞因子含量，包括免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素-1β(IL-1β)，測定步驟參照試劑盒說明書進行(南京建成生物工程研究所)。

1.4.3 腸道黏膜采集和炎癥因子指標

用戊巴比妥鈉稀釋液(30 mg/mL)將上述取完血清的肉雞麻醉致死。雞處死后迅速剖開腹腔，取出腸道(十二指腸)，置于冰上剖開腸段，用事先準備好的無菌生理鹽水稍作沖洗，后用無菌載玻片刮取腸道黏膜至凍存管中，隨后放入液氮保存。

表2 熒光定量PCR引物序列

1.4.4 免疫器官指數(shù)

將上述麻醉致死的肉雞分別采摘脾臟、胸腺、法氏囊，并剔除附著組織，用濾紙吸干血水后稱鮮重，計算其免疫器官指數(shù)。計算公式為：

免疫器官指數(shù)(g/kg)=免疫器官鮮重(g)/
宰前空腹活重(kg)。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

所有試驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間出現(xiàn)顯著差異時再用Duncan氏法進行多重比較。數(shù)據(jù)以“平均值±標準誤”表示。P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 龍須菜多糖對肉雞生長性能的影響

由表3可知，1～21日齡時，各組肉雞的末重、平均日增重和平均日采食量均無顯著差異(P>0.05)，對照組的料重比顯著高于龍須菜多糖和抗生素組(P<0.05)。22～42日齡時，龍須菜多糖和抗生素組肉雞的末重和平均日增重顯著高于對照組(P<0.05)，料重比顯著低于對照組(P<0.05)；各組的平均日采食量無顯著差異(P>0.05)。

表3 龍須菜多糖對肉雞生長性能的影響

2.2 龍須菜多糖對肉雞免疫器官指數(shù)的影響

由表4可知，21日齡時，龍須菜多糖組肉雞的脾臟指數(shù)顯著高于對照組和抗生素組(P<0.05)，抗生素組的法氏囊指數(shù)顯著低于對照組和龍須菜多糖組(P<0.05)。42日齡時，各組肉雞的脾臟指數(shù)無顯著差異(P>0.05)；抗生素組的胸腺指數(shù)顯著低于對照組(P<0.05)；龍須菜多糖組的法氏囊指數(shù)顯著高于對照組(P<0.05)，但與抗生素組相比無顯著差異(P>0.05)。

表4 龍須菜多糖對肉雞免疫器官指數(shù)的影響

2.3 龍須菜多糖對肉雞血清抗氧化指標的影響

由表5可知，21日齡時，對照組肉雞血清中MDA含量最高，且顯著高于龍須菜多糖組(P<0.05)，抗生素組血清中MDA含量高于龍須菜多糖組，但差異不顯著(P>0.05)；龍須菜多糖組血清中GSH-Px活性顯著高于對照組和抗生素組(P<0.05)。42日齡時，龍須菜多糖組肉雞血清中SOD和GSH-Px活性顯著高于對照組和抗生素組(P<0.05)；血清中MDA含量以龍須菜多糖組最低，且顯著低于其余2組(P<0.05)。各組肉雞血清中T-AOC和CAT活性均無顯著差異(P>0.05)。

表5 龍須菜多糖對肉雞血清抗氧化指標的影響

2.4 龍須菜多糖對肉雞血清免疫指標及炎性因子的影響

由圖1可知，在免疫球蛋白方面，各組肉雞血清中IgA含量在21和42日齡時均無顯著差異(P>0.05)；龍須菜多糖組血清中IgG含量在21和42日齡時均為最高，且在42日齡時顯著高于對照組和抗生素組(P<0.05)；抗生素組血清中IgM含量在21和42日齡時均為最低，且顯著低于其他2組(P<0.05)。在炎癥因子方面，龍須菜多糖組肉雞血清中TNF-α含量在21日齡時顯著低于其他2組(P<0.05)，42日齡時顯著低于抗生素組(P<0.05)；龍須菜多糖和抗生素組血清中IL-1β含量在21和42日齡時均顯著低于對照組(P<0.05)，且2組間無顯著差異(P>0.05)。

2.5 龍須菜多糖對肉雞腸道黏膜炎性因子mRNA相對表達量的影響

由圖2可知，21日齡時，龍須菜多糖和抗生素組肉雞腸道黏膜IL-1β的mRNA相對表達量顯著低于對照組(P<0.05)；各組腸道黏膜TNF-α的mRNA相對表達量無顯著差異(P>0.05)。42日齡時，龍須菜多糖組肉雞腸道黏膜IL-1β的mRNA相對表達量最低，且顯著低于其他2組(P<0.05)；龍須菜多糖和抗生素組腸道黏膜TNF-α的mRNA相對表達量顯著低于對照組(P<0.05)。

圖2 龍須菜多糖對肉雞腸道黏膜炎性因子mRNA相對表達量的影響

3 討 論

3.1 龍須菜多糖對肉雞生長性能的影響

畜產(chǎn)品安全是當今食品安全問題中的焦點。企業(yè)為追求生產(chǎn)效率和經(jīng)濟效益，在生產(chǎn)過程中通常采用高密度、集約化的飼養(yǎng)方式，使得肉雞生理和環(huán)境壓力驟升[1]，病害頻發(fā)。因此，在飼糧中添加低劑量的抗生素是解決上述問題的普遍做法，然而隨著我國2020年在畜牧業(yè)中全面禁止抗生素的使用以及人們對養(yǎng)殖動物福利及食品安全的注重，如何實現(xiàn)畜牧業(yè)的綠色安全可持續(xù)發(fā)展是亟待解決的問題。本研究通過在飼糧中添加龍須菜多糖和抗生素觀察其對肉雞的影響，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，龍須菜多糖和抗生素組肉雞22～42日齡時的末重和平均日增重顯著高于對照組，1～21日齡和22～42日齡時的料重比顯著低于對照組。這說明龍須菜多糖的添加對肉雞的生長有一定的促進作用。

關(guān)于龍須菜多糖對肉雞生長等方面的研究罕有報道。胡庭俊等[17]對鳳凰土雞的研究中指出，飼糧中添加0.25 g/kg馬尾藻多糖納米脂質(zhì)體能顯著降低其料重比，提高飼料利用率。楊晉[18]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加400 mg/kg海藻多糖能顯著提高仔豬的日增重，并且降低料重比和腹瀉頻率。另有研究報道，用海藻多糖替代仔豬飼糧中部分乳糖，海藻多糖添加組仔豬的平均日增重和料重比得到顯著改善[19-20]。這可能是由于海藻多糖一方面可以提高飼養(yǎng)動物腸道乳酸菌的數(shù)量，如石莼聚糖可改善腸道微生物區(qū)系，使盲腸乳酸桿菌數(shù)顯著增加，大腸桿菌數(shù)顯著減少[21]，而乳酸菌分泌產(chǎn)生的糖苷酶可以進一步促進飼料的消化吸收和利用[22]；另一方面，海藻多糖可以增加腸絨毛高度，促進腸道中黏蛋白的分泌，提高動物的消化吸收能力，有研究表明，飼糧中添加海藻多糖對仔豬小腸絨毛高度提高具有促進作用[23-24]。

然而，有關(guān)海藻多糖對動物生長性能影響的報道不盡相同。萬順康等[25]研究發(fā)現(xiàn)，螺旋藻多糖對肉仔雞的平均日采食量、平均日增質(zhì)量和料重比無顯著促進作用。閻桂玲等[26]研究發(fā)現(xiàn)，褐藻酸寡糖對肉雞的生長性能無顯著促進效果，但高劑量添加(2 000 mg/kg)在飼養(yǎng)前期有降低料重比和提高日增重的趨勢。薩仁娜[15]研究發(fā)現(xiàn)，海帶巖藻聚糖對肉雞的生長性能無顯著影響，但可以促進其淋巴細胞轉(zhuǎn)化率。產(chǎn)生不同結(jié)論的原因可能是各個試驗所用的藻類多糖的種類不同、肉雞品種及所處的飼養(yǎng)環(huán)境也略有差異。

3.2 龍須菜多糖對肉雞免疫器官指數(shù)的影響

脾臟、胸腺和法氏囊是禽類的重要免疫器官，它們的正常發(fā)育和形態(tài)完整是機體健康狀態(tài)的一種重要表現(xiàn)，同時也會直接影響機體的免疫狀態(tài)。正常范圍內(nèi)免疫器官的相對重量增加，說明機體細胞的免疫功能增強。本試驗結(jié)果表明，龍須菜多糖對肉雞脾臟、胸腺和法氏囊指數(shù)均有顯著影響，且龍須菜多糖組的免疫器官指數(shù)普遍高于對照組和抗生素組，說明龍須菜多糖對肉雞免疫器官的發(fā)育有一定促進作用，特別是在肉雞生長前期。從數(shù)據(jù)看出，前期龍須菜多糖組的脾臟指數(shù)上升顯著，而抗生素組的免疫器官指數(shù)普遍較低。有研究指出，黃霉素作為飼料添加劑會降低雞的免疫器官指數(shù)，抑制動物的免疫器官發(fā)育[17]。任穎朗等[27]研究發(fā)現(xiàn)，龍須菜多糖能提高光老化小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。Fan等[9]發(fā)現(xiàn)，龍須菜酸性多糖可以增強荷瘤小鼠免疫器官的免疫功能。在肉雞試驗中，薩仁娜[15]研究指出，高劑量海帶巖藻聚糖可顯著促進肉雞脾臟和胸腺發(fā)育；萬順康等[25]在飼糧中添加1 g/kg螺旋藻多糖，發(fā)現(xiàn)肉雞的免疫器官指數(shù)顯著高于未添加組；王燁等[28]通過飲水方式每天補充20 mg/kg海藻多糖，發(fā)現(xiàn)可提高21～42日齡肉雞免疫器官的免疫系數(shù)，尤其是脾臟免疫系數(shù)最為顯著。

本試驗中所設定的肉雞飼養(yǎng)密度較高，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，高飼養(yǎng)密度會導致肉雞的應激加強，體內(nèi)累積較多氧自由基，而氧自由基連鎖反應會損害動物細胞的生物膜及其功能，造成神經(jīng)、組織、器官等損傷，而龍須菜多糖可以通過清除體內(nèi)的自由基改善動物自身的抗氧化功能，從而影響肉雞免疫器官的生長發(fā)育[29]。宮春宇等[30]和楊文鴿等[31]研究認為，龍須菜多糖具有體外清除羥自由基、超氧自由基和過氧化氫的作用。

3.3 龍須菜多糖對肉雞抗氧化能力的影響

本研究結(jié)果顯示，龍須菜多糖可顯著提高肉雞血清中SOD和GSH-Px活性，降低MDA含量，表明龍須菜多糖對肉雞的抗氧化能力有一定提升作用。Guo等[32]將龍須菜多糖與草酸誘導的人近端腎小管上皮細胞共同孵育后，發(fā)現(xiàn)其細胞的SOD活性顯著升高，MDA含量顯著降低，表明龍須菜多糖能提高細胞內(nèi)抗氧化酶活性，減少細胞損傷。陳美珍等[33]報道，龍須菜多糖能夠提高荷瘤小鼠的抗氧化能力。王曉梅等[34]研究發(fā)現(xiàn)，龍須菜多糖具有優(yōu)異的抗氧化活性。石達友等[35]研究發(fā)現(xiàn)，給粵黃雞注射海藻多糖(40 g/L)能顯著提高其血清中SOD活性。這可能是由于龍須菜多糖可以清除體內(nèi)多余的自由基。于敬沂[36]研究發(fā)現(xiàn)，許多海藻多糖都具有清除體內(nèi)或體外活性氧自由基、提高抗氧化酶活性及降低脂質(zhì)過氧化物含量的作用。楊華等[37]研究發(fā)現(xiàn)，采用微波輔助法提取的龍須菜多糖能有效清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基，表明其有抗氧化活性作用。此外，Souza等[38]研究發(fā)現(xiàn)，龍須菜硫酸多糖能減緩自由基的形成。這可能是由于龍須菜多糖具有還原性的半縮醛羥基結(jié)構(gòu)，可以還原/清除自由基[34]，從而提高機體的抗氧化能力。

3.4 龍須菜多糖對肉雞免疫指標及炎性因子的影響

免疫球蛋白是參與體液免疫的主要抗體，其在血清中的含量是判斷動物體液免疫功能的重要指標之一。本研究發(fā)現(xiàn)，龍須菜多糖組肉雞血清中IgG和IgM含量顯著上升，這說明龍須菜多糖對肉雞的體液免疫有促進作用。類似的研究在龍須菜多糖灌胃荷瘤小鼠研究中發(fā)現(xiàn)，龍須菜多糖可顯著増強B細胞活性，使機體分泌較高水平的腫瘤特異性IgG抗體，提高機體的體液免疫能力[39]。Okai等[40]和Choi等[41]對海帶多糖的研究中進一步發(fā)現(xiàn)，熱水提取的海帶多糖能誘導小鼠脾淋巴細胞增殖，提高脾細胞的DNA合成能力，同時使B淋巴細胞數(shù)量增加，其所分泌的抗體IgM和IgG數(shù)量也隨之增多。萬順康等[25]報道，飼糧中添加螺旋藻多糖可使肉雞血清中IgG含量顯著升高，高劑量添加組(1.0和1.5 g/kg)血清中IgA和IgM含量顯著升高。Leonard等[23]在妊娠第107天到哺乳第26天母豬飼糧中添加海藻多糖，發(fā)現(xiàn)泌乳母豬初乳中IgA和IgG含量得到顯著提高。

炎癥反應是一個極其復雜的過程，適度的炎癥反應有助于動物機體的恢復，然而過于強烈或持久的炎癥反應則會對正常的細胞和組織造成一定的損傷。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，龍須菜多糖組肉雞血清中TNF-α和IL-1β含量及腸道黏膜TNF-α和IL-1β的mRNA相對表達量與對照組相比顯著降低。造成這種現(xiàn)象的原因可能是以下2個方面：一方面，由于對照組肉雞受持久的高密度環(huán)境應激影響開始產(chǎn)生免疫應答，由此產(chǎn)生較多細胞因子，而過多的細胞因子對機體是有害的；另一方面，龍須菜多糖的添加可以降低炎癥反應，使炎癥因子含量及表達量下降。諸多研究指出海藻多糖具有免疫調(diào)節(jié)作用，例如在對豬的研究中發(fā)現(xiàn)，用海藻多糖治療脂多糖(LPS)刺激后的斷奶仔豬，可以顯著降低其回腸TNF-α的mRNA相對表達量[23]；在飼糧中添加400 mg/kg海藻多糖能顯著上調(diào)仔豬空腸黏膜抗炎性因子白細胞介素-10(IL-10)的mRNA表達，并使促炎性因子IL-6和TNF-α的mRNA表達顯著下調(diào)[18]。這可能是由于海藻多糖能夠通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-1(AP-1)激活等機制下調(diào)誘導型一氧化氮合酶(iNOS)及環(huán)氧合酶(COX-2)的mRNA表達，從而抑制炎癥介質(zhì)一氧化氮及前列腺素E2(PGE2)的釋放，發(fā)揮其抗炎作用[42-43]。在小鼠的研究中，同樣也發(fā)現(xiàn)海藻多糖不僅能降低機體促炎性因子IL-6、TNF-α和IL-1β的分泌，還能提高抗炎性因子IL-10和轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)的mRNA相對表達量，從而恢復細胞因子的平衡，起到抗炎的作用[44,29]。在相關(guān)腸胃炎癥模型中，Choi等[45]發(fā)現(xiàn)，巖藻多糖能降低阿司匹林誘導的急性胃潰瘍模型大鼠血清中IL-6含量，減輕胃黏膜損傷；Brito等[42]研究指出，在大鼠腸炎模型中，Gracilariabirdiae硫酸化多糖能夠抑制促炎因子TNF-α和IL-1β的分泌，并減弱髓過氧化物酶(MPO)活性，從而減少腸道炎性細胞浸潤，改善腸道組織損傷。

4 結(jié) 論

飼糧中添加0.1%龍須菜多糖能提高肉雞的生長性能和飼料利用率，提升機體的抗氧化能力和免疫功能，并能在一定程度上緩解肉雞的腸道炎性反應。