趙祖艷 楊運(yùn)南 劉日亮 張?jiān)讫?胡 浩 鄭衛(wèi)江* 姚 文

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)消化道微生物實(shí)驗(yàn)室，江蘇省消化道營(yíng)養(yǎng)與動(dòng)物健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210095；2.江蘇遠(yuǎn)山生物技術(shù)有限公司，鹽城 224001)

仔豬在早期斷奶期間由于環(huán)境、采食方式的改變，加之腸道發(fā)育尚不完善，容易引發(fā)腸道免疫系統(tǒng)功能性紊亂，從而導(dǎo)致腹瀉，并使其采食量和日增重下降[1]。因此，斷奶仔豬的高腹瀉率將導(dǎo)致機(jī)體發(fā)育遲緩，甚至死亡，嚴(yán)重影響經(jīng)濟(jì)效益[2]。促生長(zhǎng)飼用抗生素以往作為飼料添加劑在畜禽養(yǎng)殖中廣泛應(yīng)用，主要目的是預(yù)防疾病、刺激畜禽生長(zhǎng)和提高飼料轉(zhuǎn)化率[3]。然而，由于飼用抗生素的長(zhǎng)期不規(guī)范使用，細(xì)菌耐藥性及抗生素殘留等問(wèn)題逐漸暴露；一方面添加促生長(zhǎng)飼用抗生素已沒(méi)有促生長(zhǎng)作用，另一方面還嚴(yán)重威脅公眾衛(wèi)生及人類健康[4]。根據(jù)我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部規(guī)定，自2020年7月1日起，飼料生產(chǎn)企業(yè)停止生產(chǎn)含飼用抗生素的商品飼料[5]。因此，在飼料禁抗的背景下，亟需尋找一種安全、有效的促生長(zhǎng)飼用抗生素替代物來(lái)緩解早期斷奶導(dǎo)致的仔豬腹瀉率升高和生長(zhǎng)性能的降低。

益生菌、益生元或合生素被認(rèn)為是抗生素的理想替代品之一[6]。凝結(jié)芽孢桿菌是芽孢桿菌屬的革蘭氏陽(yáng)性菌，菌體形態(tài)呈桿狀，兼性厭氧，最適溫度為37～45 ℃，最適pH為6.6～7.0；該菌可分解糖類產(chǎn)生L-乳酸，具有耐酸、耐鹽、耐熱、易培養(yǎng)和易保存的特性[7]。與其他不產(chǎn)乳酸的芽孢桿菌相比，凝結(jié)芽孢桿菌更有利于恢復(fù)胃腸道的微生態(tài)平衡并提高機(jī)體免疫力[8]。研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加2×106和2×107CFU/g凝結(jié)芽孢桿菌均可提高斷奶仔豬的膽固醇代謝，維持腸道完整性，減輕氧化應(yīng)激和腹瀉[9]。此外，凝結(jié)芽孢桿菌的孢子具有很強(qiáng)的抵抗力、復(fù)活力和穩(wěn)定性，能在胃的酸性環(huán)境中活化，最終在腸道中萌發(fā)并繁殖[10-11]。由于凝結(jié)芽孢桿菌在胃腸道中的高度穩(wěn)定性、無(wú)毒作用以及高效性而被稱為“益生菌之王”[12]。乳果糖是由半乳糖和果糖組成的化學(xué)益生元，能以原型到達(dá)結(jié)腸并被腸道菌群分解代謝[13]。體外發(fā)酵結(jié)果顯示，與同濃度的菊粉和低聚果糖相比，乳果糖分解產(chǎn)生的乳酸濃度更高[14]。此外，0.5%乳果糖在增強(qiáng)乳酸桿菌和雙歧桿菌生長(zhǎng)繁殖方面表現(xiàn)出更好的益生作用[15]。研究表明，飼喂0.05%或0.10%乳果糖均可改善斷奶仔豬生長(zhǎng)性能和養(yǎng)分表觀消化率，同時(shí)減少糞便中大腸桿菌數(shù)量和氨氣的排放量[16]。

合生素是指以增效形式將益生元和益生菌結(jié)合使用的生物制劑，其效果往往優(yōu)于單獨(dú)使用益生元或益生菌[17]。合生素可通過(guò)益生元增強(qiáng)益生菌在腸道的附著和繁殖，從而改善動(dòng)物生長(zhǎng)性能，提高飼料轉(zhuǎn)化率[18]。目前，有關(guān)乳果糖和凝結(jié)芽孢桿菌合生素在斷奶仔豬上應(yīng)用的研究還較少。因此，本試驗(yàn)旨在探究乳果糖和凝結(jié)芽孢桿菌合生素對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能、腹瀉率、養(yǎng)分表觀消化率、血液常規(guī)指標(biāo)和血清生化指標(biāo)的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

金霉素(有效成分含量15%)購(gòu)自上海某飼料有限公司；乳果糖(杜密克乳果糖口服液，乳果糖含量667 mg/mL)購(gòu)自荷蘭某公司；凝結(jié)芽孢桿菌(活菌數(shù)1×109CFU/g)由江蘇某生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選取24頭27～28日齡“杜×長(zhǎng)×大”三元雜交斷奶閹公豬，初始體重為(9.09±0.12) kg，隨機(jī)分為對(duì)照組(n=12)、試驗(yàn)Ⅰ組(n=6)和試驗(yàn)Ⅱ組(n=6)。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧(不含抗生素)，試驗(yàn)Ⅰ組飼喂基礎(chǔ)飼糧+75 mg/kg的金霉素，試驗(yàn)Ⅱ組飼喂基礎(chǔ)飼糧+乳果糖和凝結(jié)芽孢桿菌合生素(10 g/kg的乳果糖和2×109CFU/kg的凝結(jié)芽孢桿菌)。試驗(yàn)期29 d?；A(chǔ)飼糧營(yíng)養(yǎng)需要參照NRC(2012)，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

續(xù)表1項(xiàng)目 Items含量 Content鈣 Ca0.75總磷 TP0.74

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)在揚(yáng)州優(yōu)佳創(chuàng)試驗(yàn)豬場(chǎng)進(jìn)行。所有仔豬單欄飼養(yǎng)，每欄配有1個(gè)料槽和1個(gè)飲水器，每天07:00、14:00和18:00喂料，喂料量以每天06:30料槽中有少量剩余料為宜。試驗(yàn)期間所有仔豬自由飲水，消毒程序按豬場(chǎng)常規(guī)方法進(jìn)行。每天清掃圈舍，以保持圈內(nèi)清潔。

1.4 測(cè)定指標(biāo)和方法

1.4.1 生長(zhǎng)性能

試驗(yàn)以欄為單位，準(zhǔn)確記錄每日采食量，于試驗(yàn)第1、15和29天06:30對(duì)試驗(yàn)仔豬進(jìn)行空腹稱重，計(jì)算第1～2周、第3～4周及第1～4周的平均日增重(ADG)和平均日采食量(ADFI)，并根據(jù)ADFI和ADG計(jì)算料重比(F/G)。

1.4.2 糞便評(píng)分和腹瀉率

仔豬糞便評(píng)分參照Walsh等[19]的方法：每天早、中、晚3個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀察仔豬糞便情況并對(duì)其進(jìn)行評(píng)分。糞便評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：糞便堅(jiān)硬為1分，糞便輕微柔軟為2分，糞便軟、部分成形為3分，糞便呈松散、半液體狀為4分，糞便呈水狀或黏液狀為5分。當(dāng)評(píng)分大于或等于4時(shí)認(rèn)定為腹瀉，腹瀉率[20]計(jì)算公式如下：

腹瀉率(%)=[腹瀉仔豬頭次/
(試驗(yàn)組仔豬數(shù)×試驗(yàn)天數(shù))]×100。

1.4.3 養(yǎng)分表觀消化率

采用四分法收集飼糧，65 ℃烘干至恒重，粉碎過(guò)40目篩，于-20 ℃保存。試驗(yàn)期第25～29天，每天08:00—12:00采集每頭仔豬新鮮糞便于自封袋中，并加入10%的硫酸固氮，混勻后置于-20 ℃保存。試驗(yàn)結(jié)束后，將每頭仔豬的全部糞樣混合均勻，放置于烘箱中65 ℃烘干至恒重，粉碎過(guò)40目篩，密封保存并置于4 ℃保存。飼糧和糞便中的養(yǎng)分含量測(cè)定參照《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)》，飼糧養(yǎng)分表觀消化率采用外源指示劑法測(cè)定，試驗(yàn)飼糧和糞便中二氧化鈦(TiO2)含量采用分光光度法[21]測(cè)定。計(jì)算公式[22]如下：

某養(yǎng)分表觀消化率(%)=100×[1-(c/d)×(b/a)]。

式中：a為飼糧中該養(yǎng)分含量(%)；b為糞便中該養(yǎng)分含量(%)；c為飼糧中TiO2含量(%)；d為糞便中TiO2含量(%)。

1.4.4 血液常規(guī)指標(biāo)和血清生化指標(biāo)

于試驗(yàn)第29天進(jìn)行空腹采血，制備血清。利用血細(xì)胞分析儀(Mindray BC-5120，邁瑞醫(yī)療國(guó)際股份有限公司)檢測(cè)血液常規(guī)指標(biāo)，包括白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)(LYM)、淋巴細(xì)胞比率(LYM%)、中性細(xì)胞計(jì)數(shù)(NEU)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)和血紅蛋白(HGB)含量。利用全自動(dòng)生化分析儀(Hitachi-7020，日本日立公司)檢測(cè)血清中總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLOB)、總膽紅素(TBIL)、葡萄糖(GLU)、膽固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)含量及谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰基轉(zhuǎn)移酶(GGT)活性，試劑盒均購(gòu)于美康生物科技股份有限公司。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

所得數(shù)據(jù)在Excel 2016進(jìn)行整理后，采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，并利用Duncan氏法進(jìn)行多重比較；腹瀉率采用卡方檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)以平均值(mean)和均值標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)表示，以P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 乳果糖和凝結(jié)芽孢桿菌合生素對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的影響

由表2可知，第1天、第15天和第29天，3組之間體重均無(wú)顯著差異(P>0.05)。第1～2周，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)Ⅰ組的ADG和ADFI分別提高了10.15%和3.30%，試驗(yàn)Ⅱ組ADG和ADFI分別提高了12.64%和5.53%，但3組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)；試驗(yàn)Ⅱ組的F/G顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，且與試驗(yàn)Ⅰ組無(wú)顯著差異(P>0.05)。第3～4周和第1～4周，3組之間ADG、ADFI和F/G均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表2 乳果糖和凝結(jié)芽孢桿菌合生素對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的影響

2.2 乳果糖和凝結(jié)芽孢桿菌合生素對(duì)斷奶仔豬糞便評(píng)分和腹瀉率的影響

由表3可知，第1～2周、第3～4周和第1～4周，3組之間糞便評(píng)分無(wú)顯著差異(P>0.05)。第1～2周，3組之間腹瀉率無(wú)顯著差異(P>0.05)；第3～4周，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組的腹瀉率顯著降低(P<0.05)，且試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)；第1～4周，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組的腹瀉率也有不同程度下降，但3組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表3 乳果糖和凝結(jié)芽孢桿菌合生素對(duì)斷奶仔豬糞便評(píng)分和腹瀉率的影響

2.3 乳果糖和凝結(jié)芽孢桿菌合生素對(duì)斷奶仔豬養(yǎng)分表觀消化率的影響

由表4可知，3組之間的干物質(zhì)、粗纖維、粗灰分、鈣和總磷表觀消化率無(wú)顯著差異(P>0.05)。試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組的總能和粗脂肪的表觀消化率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，且試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。試驗(yàn)Ⅰ組的粗蛋白質(zhì)表觀消化率顯著高于對(duì)照組(P>0.05)，但試驗(yàn)Ⅱ組與其他2組無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表4 乳果糖和凝結(jié)芽孢桿菌合生素對(duì)斷奶仔豬養(yǎng)分表觀消化率的影響

2.4 乳果糖和凝結(jié)芽孢桿菌合生素對(duì)斷奶仔豬血液常規(guī)指標(biāo)和血清生化指標(biāo)的影響

由表5可知，3組之間WBC、LYM、LYM%、NEU、RBC和HGB含量均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

由表6可知，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組的血清TBIL含量顯著降低(P<0.05)，且試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。3組之間血清ALP、GGT、ALT和AST活性無(wú)顯著差異(P>0.05)；但與對(duì)照組相比，試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組的血清ALP活性均有所升高。3組之間血清TP、ALB、GLOB、GLU、CHOL、TG、HDL和LDL含量均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表5 乳果糖和凝結(jié)芽孢桿菌合生素對(duì)斷奶仔豬血液常規(guī)指標(biāo)的影響

表6 乳果糖和凝結(jié)芽孢桿菌合生素對(duì)斷奶仔豬血清生化指標(biāo)的影響

3 討 論

3.1 乳果糖和凝結(jié)芽孢桿菌合生素對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能和腹瀉率的影響

研究表明，飼糧中添加3 000 g/t的苯甲酸和400 g/t的凝結(jié)芽孢桿菌或單獨(dú)添加1×107CFU/g凝結(jié)芽孢桿菌均可顯著提高斷奶仔豬ADG，并顯著降低F/G[23-24]。Guerra-Ordaz等[25]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加10 g/kg乳果糖可顯著提高斷奶仔豬ADG和ADFI，并顯著降低F/G。本研究也得到了類似的結(jié)果，即在第1～2周，試驗(yàn)Ⅱ組的F/G顯著低于對(duì)照組，且與試驗(yàn)Ⅰ組無(wú)顯著差異。前期研究認(rèn)為抗生素可抑制腸道微生物的生長(zhǎng)繁殖，減少其抗生長(zhǎng)代謝物的產(chǎn)生及對(duì)養(yǎng)分的破壞，進(jìn)而達(dá)到促生長(zhǎng)的作用[3]。但在本研究中，金霉素對(duì)斷奶仔豬的生長(zhǎng)性能并未產(chǎn)生顯著的促進(jìn)效果；這可能與長(zhǎng)期低劑量促生長(zhǎng)抗生素的添加導(dǎo)致豬場(chǎng)和各階段豬腸道微生物的高耐藥性有關(guān)。本研究中，試驗(yàn)Ⅱ組第1～2周的F/G相較于對(duì)照組顯著降低，其原因可能是乳果糖和凝結(jié)芽孢桿菌合生素可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制病原菌和促進(jìn)有益菌群定植以提高動(dòng)物自身對(duì)養(yǎng)分的消化率，減少有害菌群代謝對(duì)養(yǎng)分的破壞，從而提高飼料轉(zhuǎn)化率[11]，降低F/G。

研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加2×106和2×107CFU/g凝結(jié)芽孢桿菌均可顯著降低斷奶仔豬腹瀉率[9]。目前，鮮有乳果糖在降低動(dòng)物腹瀉率上的研究報(bào)道。陳旭東[26]研究表明，飼糧中單獨(dú)添加0.4%果寡糖和0.2%芽孢桿菌均可顯著降低斷奶仔豬腹瀉率，且二者組和添加組的腹瀉率最低。本研究結(jié)果顯示，第3～4周，試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組的腹瀉率較對(duì)照組顯著降低，且試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組之間無(wú)顯著差異。產(chǎn)生上述結(jié)果的原因可能是金霉素可降低腸道炎癥免疫反應(yīng)，減輕腸源性感染，進(jìn)而緩解仔豬腹瀉[27]。此外，乳果糖和凝結(jié)芽孢桿菌合生素一方面可通過(guò)分泌抗菌肽、凝集素和乳酸等物質(zhì)，抑制有害菌群的生長(zhǎng)繁殖，從而緩解仔豬腹瀉情況[28]；另一方面，補(bǔ)充凝結(jié)芽孢桿菌可減輕斷奶應(yīng)激引起的腸道損傷，降低腸道凋亡蛋白表達(dá)，提高緊密連接蛋白表達(dá)，保護(hù)腸道屏障，進(jìn)而減輕腹瀉[9]。

3.2 乳果糖和凝結(jié)芽孢桿菌合生素對(duì)斷奶仔豬養(yǎng)分表觀消化率的影響

臨床試驗(yàn)顯示，服用凝結(jié)芽孢桿菌(1×107CFU/d)28 d后施加益生元低聚果糖或低聚半乳糖可通過(guò)促進(jìn)腸道有益菌群繁殖、增加短鏈脂肪酸的產(chǎn)生改善機(jī)體健康，效果優(yōu)于單獨(dú)使用凝結(jié)芽孢桿菌[29]。Maathuis等[30]用體外裝置模擬胃腸道消化環(huán)境發(fā)現(xiàn)，凝結(jié)芽孢桿菌(2×109CFU/g)可增強(qiáng)乳糖、果糖和蛋白質(zhì)的消化。乳果糖可經(jīng)結(jié)腸細(xì)菌，尤其是雙歧桿菌代謝，產(chǎn)生短鏈脂肪酸[14]。短鏈脂肪酸可調(diào)節(jié)參與能量代謝(如脂質(zhì)代謝)的腸道上皮基因表達(dá)，并促進(jìn)腸道的發(fā)育[31]。研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加15%乳果糖可通過(guò)改善糖脂代謝、增加雙歧桿菌等有益菌豐度維持高鹽飲食小鼠腸道微環(huán)境健康[32]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，金霉素可提高斷奶仔豬總能、粗蛋白質(zhì)和粗脂肪表觀消化率。前期研究也發(fā)現(xiàn)，金霉素可直接或間接降低腸壁厚度，增加腸道吸收面積，促進(jìn)養(yǎng)分吸收[3]。乳果糖和凝結(jié)芽孢桿菌合生素也可以顯著提高斷奶仔豬總能、粗脂肪表觀消化率，粗蛋白質(zhì)、粗灰分、鈣和總磷表觀消化率也不同程度的提高，且與金霉素?zé)o顯著差異。乳果糖和凝結(jié)芽孢桿菌合生素對(duì)斷奶仔豬消化率提高的具體作用機(jī)制還尚不明確，需要后期進(jìn)一步研究。

3.3 乳果糖和凝結(jié)芽孢桿菌合生素對(duì)斷奶仔豬血液常規(guī)指標(biāo)和血清生化指標(biāo)的影響

孫梅等[33]在0.2%復(fù)合芽孢桿菌制劑對(duì)斷奶仔豬血液常規(guī)指標(biāo)的影響中發(fā)現(xiàn)，血液WBC、RBC和HGB含量無(wú)顯著變化。Zhao等[34]研究顯示，0.10%果聚糖與0.10%甘露寡糖單獨(dú)添加及0.05%果聚糖與0.05%甘露寡糖組和添加對(duì)斷奶仔豬血液WBC、LYM和RBC均無(wú)顯著影響。本試驗(yàn)結(jié)果也顯示，3組之間血液常規(guī)指標(biāo)無(wú)顯著差異，表明乳果糖和凝結(jié)芽孢桿菌合生素的添加均對(duì)斷奶仔豬機(jī)體血常規(guī)無(wú)負(fù)面影響。

TBIL與肝臟功能密切相關(guān)，可反映肝臟細(xì)胞損傷情況和肝臟的代謝水平[35]。研究表明，每日2次灌服500 mg/kg BW的乳果糖可降低采食鐮刀菌污染玉米的斷奶仔豬血清TBIL含量和AST活性[36]。飼喂5%菊粉和1×109CFU/d凝結(jié)芽孢桿菌合生素可通過(guò)減少血清ALT、AST活性和TBIL含量的積累顯著降低重金屬隔對(duì)大鼠肝臟和腎臟的損傷[37]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組的血清TBIL含量顯著降低，且試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組之間無(wú)顯著差異。以上結(jié)果表明，乳果糖和凝結(jié)芽孢桿菌合生素可一定程度減輕肝臟損傷。

4 結(jié) 論

綜上所述，在無(wú)抗飼糧中添加乳果糖和凝結(jié)芽孢桿菌合生素可降低斷奶仔豬腹瀉率，顯著提高總能和粗脂肪表觀消化率，降低血清TBIL含量，對(duì)斷奶仔豬F/G有一定改善作用。