林文軒,敖靈,董蔚,孫嘯濤,劉淼,沈才洪,張宿義,鄧波

1(北京工商大學,食品質(zhì)量與安全北京實驗室,北京,100048) 2(瀘州老窖股份有限公司,四川 瀘州,646000)3(中國輕工業(yè)釀酒分子工程重點實驗室(北京工商大學),北京,100048)

白酒又名燒酒,以曲類、酵母等為糖化發(fā)酵劑,利用糧谷類經(jīng)過蒸煮、糖化發(fā)酵、蒸餾、貯存、勾調(diào)而成。2019 年,白酒銷售量達1 714.7萬kL[1]。白酒中2%的微量成分形成了風格迥異的醬、濃、清等12種香型。因此,對于不同香型、產(chǎn)區(qū)、企業(yè)生產(chǎn)白酒的關(guān)鍵風味物質(zhì)及其生成途徑研究成為大家關(guān)注的熱點。

截至2017 年,研究人員已在白酒中成功檢測出揮發(fā)性化合物1 874 種[2],這些微量成分種類繁多,含量分布范圍廣。白酒中的高含量化合物通常對白酒特征香氣貢獻突出,如酯、醇、酸類等。酒體中的酯類物質(zhì)是香氣的主體成分,對酒體的果香或花香起決定性作用；醇類如乙醇、丙醇、丁醇在白酒中含量很高,是白酒醇香的來源；酸類物質(zhì)在酒體中表現(xiàn)為酸味,適量的有機酸能夠掩蓋白酒中的苦澀味,改善白酒風味[3]。某些低含量化合物同樣會對酒體香氣有貢獻,如含硫、含氮以及呋喃類化合物等,它們雖然在白酒中的含量并不高,但閾值低,香氣活力值高,對白酒的整體風味同樣有著重要的貢獻。2017 年,NIU等[4]應用液液萃取法結(jié)合氣相色譜火焰光度檢測器(gas chromatography-flame photometric detector,GC-FPD)對清香型白酒進行分析,結(jié)果表明雖然二甲基三硫醚和3-巰基己基乙酸酯含量低,但是香氣活性值高,對清香型白酒有重要貢獻。在后續(xù)研究中,有研究者發(fā)現(xiàn),在老化過程中,隨著白酒中微量成分的改變,白酒風格會發(fā)生顯著的變化,同樣證明了2%的微量組分對酒體香氣的突出貢獻[5]。

為了保證對上述微量成分的準確檢出,自20世紀60 年代起,分析方法穩(wěn)步發(fā)展。分析方法由操作簡單、檢出限高發(fā)展為專一性好、省時、環(huán)保。目前雖已有部分文獻對白酒中風味物質(zhì)的分析方法進行總結(jié),但只是概述了常見的前處理方法。本文對近年來應用于白酒領(lǐng)域的前處理方法進行梳理,詳細歸納出各自的特點及應用情況；此外,介紹了新的前處理方法的發(fā)展趨勢,以期為進一步提升白酒品質(zhì)提出建議。

1 白酒分析中常見的前處理方法

1.1 直接進樣法

直接進樣法是一種將不經(jīng)過處理的微量酒樣直接注入進樣器的方法,適合對白酒中的高含量化合物,如酸、醇、酯類等骨架成分定性及定量分析[6-8]。該方法操作簡單且可保留酒樣中的所有成分,具有真實性高、重現(xiàn)性好等優(yōu)勢,但不適合于含量相對較低的微量組分分析。由于酒樣未經(jīng)除水處理,在儀器分析時酒樣中的水會在進樣口處受熱氣化膨脹,同時與待測物競爭色譜柱上的烷氧基,形成活性位點,進而縮短色譜柱的使用壽命。

直接進樣法常與氣相色譜火焰離子化檢測器(gas chromatography-flame ionization detector,GC-FID)聯(lián)用對白酒中的高含量骨架成分進行分析[8-9]。為了擴大直接進樣法的檢測范圍,研究人員將直接進樣法與更高精密度的氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(ultra-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)聯(lián)用對白酒中的風味物質(zhì)進行分析。已有文獻表明,直接進樣法與GC-MS聯(lián)用適合對白酒中相對含量較低的醇類、酯類、酸類和部分烷烴、醛類、酮類分析[10]。2020年,YAN等[11]應用直接進樣法結(jié)合UPLC-MS/MS實現(xiàn)了對27 種醬香、濃香、清香型白酒中的吡嗪類化合物的分析,檢出限低至6.0×10-7g/L。直接進樣法與不同儀器聯(lián)用的檢測結(jié)果見表1。

表1 應用直接進樣法測定白酒中風味物質(zhì)的種類、檢出限、定量限及回收率

1.2 液萃取法

1.2.1 液液萃取法(liquid-liquid extraction,LLE)

液液萃取法是一種利用待測物與基質(zhì)在溶劑中溶解度不同去除基質(zhì)而保留待測組分的前處理方法。與直接進樣法相比,LLE克服了直接進樣法縮短色譜柱使用壽命的不足,具有易于操作、檢出種類多、回收率高的優(yōu)點,是目前最常用的樣品前處理方法之一。但是,該方法仍存在樣品用量過大、耗時長的缺點,并且低沸點化合物在濃縮過程中易損失。

2006 年,FAN等[12]首次應用調(diào)pH液液萃取法結(jié)合氣相色譜-嗅聞(gas chromatography-olfactometry,GC-O)和GC-MS對五糧液和劍南春酒樣中的揮發(fā)性香氣化合物進行分析,鑒定出5 種吡嗪類化合物。2007 年,進一步應用LLE-GC-MS對茅臺酒中的吡嗪類化合物進行檢測,共鑒定出27 種吡嗪類化合物[13]。隨著液液萃取法的發(fā)展,諸多研究人員發(fā)現(xiàn)萃取溶劑的種類影響萃取結(jié)果。通過對萃取溶劑的類型進行優(yōu)化,可實現(xiàn)待測酒樣中不同極性化合物的高效檢出。目前萃取劑種類多樣,其中二氯甲烷因具有廣譜的溶解能力,以及相對較低的毒性和反應惰性,成為常用萃取劑[14]。而為了對白酒中的強極性化合物進行分析,2017 年,NIU等[4]應用LLE結(jié)合GC-O和GC-FPD對5 種清香型白酒進行分析,萃取溶劑采用極性強的2-辛醇,結(jié)果成功提取出80 種香氣化合物。在實際檢測中,由于白酒微量成分的復雜性,很難僅使用一種萃取劑同時萃取多種待測物,通過應用多種萃取劑進行酒樣的多次萃取能有效提高待測化合物的萃取效率[15]。

1.2.2 液液微萃取法(liquid-liquid microextraction,LLME)

LLME是一種微型化的液液萃取法,樣品在分散劑的作用下迅速從水相轉(zhuǎn)移至萃取劑。與傳統(tǒng)液液萃取法相比,LLME在加快萃取平衡速率、提高萃取效率的同時,減少了因萃取時間過長而導致低沸點化合物的損失。

LLME常用于對白酒中的脂肪酸類化合物分析[16-17]。2015 年,FAN等應用LLME-GC-MS,建立了白酒中脂肪酸類物質(zhì)的快速檢測方法。結(jié)果表明,白酒中脂肪酸類化合物的回收率可達85%以上,檢出限在1.9×10-4～2.9×10-3g/L[16]。2020 年,WANG等對該方法進行改進,同樣應用LLME-GC-MS對茅臺酒中的酚類、脂肪酸類化合物進行分析,成功定量出8 種化合物,檢出限在7.0×10-10～8.7×10-4g/L,定量限為2.3×10-9～1.7×10-3g/L[17]。

為了提高LLME的萃取效率,研究人員一直在進行改進。2014 年,LIAN等[18]采用表面活性劑/渦旋輔助液液微萃取(vortex-assisted liquid-liquid microextraction,VSLLME)處理酒樣,以己酸作為萃取劑,成功分離并檢測出5 種鄰苯二甲酸酯(phthalic acid esters,PAEs)。2018 年,DONG等[19]應用VSLLME-GC-MS首次實現(xiàn)對濃香型白酒中3-甲基吲哚的鑒定。液液萃取法測定白酒中風味物質(zhì)的應用如表2所示。

表2 應用液液萃取法測定白酒中風味物質(zhì)的種類、檢出限及回收率

1.3 固相萃取法(solid-phase extraction,SPE)

SPE是一種利用白酒中風味物質(zhì)在固定相與流動相分配平衡不同而分離的前處理方法。相比液液萃取法,SPE具有萃取液用量少,重復性好的優(yōu)點。已有文獻報道應用該方法實現(xiàn)了對酒中揮發(fā)性酚類、內(nèi)酯類和酚酸類物質(zhì)的檢測[23]。然而,該方法成本高,過程相對復雜,對固定相材料要求高(固定相材料與待測物的極性相近,否則,萃取效果會因為分析物未在固定相上保留而受影響)。

目前常用的固定相材料為C18,當酒樣流過固定相時,待測物與C18碳鏈因疏水作用而被吸附,然后經(jīng)洗脫液沖洗分離待測物[24]。隨著固相萃取技術(shù)的發(fā)展,研究人員開發(fā)了不同類型的固定相[23,25],其中HLB固定相(改性的苯乙烯二乙烯基苯共聚物)因?qū)O性、非極性化合物均有很好的保留效果,而被廣泛應用。

磁性固相萃取過程如圖1 所示[26]。磁性吸附劑是該技術(shù)的重點,吸附劑主要包括使吸附劑具備磁性的磁源以及用來吸附待測分析物的涂層。目前,該方法已經(jīng)廣泛應用于環(huán)境領(lǐng)域,并且開始在白酒領(lǐng)域應用。2020 年,DONG等[27]應用磁性固相萃取結(jié)合HPLC-MS/MS實現(xiàn)對濃香型白酒中的吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid,IAA)和吲哚-3-丙酸(indolyl-3-propionic acid,IPA)的高效、快速檢測。為了保證對上述2種吲哚類衍生物的準確檢出,該研究者合成了一種新型磁性聚丙烯胺改性氧化石墨烯作為萃取吸附劑。結(jié)果表明,該方法對IAA和IPA的萃取效率高,回收率可達71.5%～110.5%。該方法具有樣品和試劑消耗低、靈敏度高、精密度好且耗時短的優(yōu)點。

1.4 固相微萃取法(solid-phase microextraction,SPME)

固相微萃取法是一種在SPE基礎(chǔ)上發(fā)展的集富集、分離、檢測為一體的前處理方法。它利用具有吸附萃取功能的萃取頭,在樣品與萃取頭之間建立萃取平衡從而實現(xiàn)分離、富集的目的。具體萃取過程如圖2 所示。SPME具有檢出種類多[10],即時現(xiàn)場采樣,萃取時間和解吸時間短的優(yōu)點。但是作為現(xiàn)階段先進的前處理手段,SPME存在萃取頭價格昂貴的缺點。

表3 應用固相萃取法測定白酒中風味物質(zhì)的種類、檢出限及回收率

圖2 固相微萃取法的流程圖

1.4.1 固相微萃取(solid-phase microextraction,HS-SPME)

HS-SPME和浸入式固相微萃取(direct immersion-solid phase microextraction,DI-SPME),其中,頂空固相微萃取在白酒風味分析中被廣泛應用。HS-SPME將萃取頭置于酒樣上空進行吸附,避免了復雜的基質(zhì)和難揮發(fā)化合物對結(jié)果的干擾。缺點是白酒中大量的乙醇容易揮發(fā),會影響低沸點氣味化合物的檢測。

影響SPME萃取效率的因素包括萃取時間、溫度、pH以及萃取頭的極性,萃取頭的極性影響萃取化合物的種類,PDMS萃取頭對非極性化合物萃取效果較好[29]。PA萃取頭適合萃取極性強的化合物[30]。中極性的DVB/CAR/PDMS萃取頭對相對分子質(zhì)量在40～275的化合物都有很好的吸附效果,已有文獻報道應用DVB/CAR/PDMS萃取頭實現(xiàn)了對辛酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯等白酒中含量高的香氣化合物[31]和揮發(fā)性含硫化合物[32]、呋喃類[33]、醛酮類、羰基化合物[16]的提取。

1.4.2 固相微萃取方法的改進

SPME的缺點是萃取量不足。為了提高萃取效率,一種基于SPME的SPME ARROW設(shè)備受到人們的注意。相比SPME,SPME ARROW在相對較寬的不銹鋼棒上涂有更厚的萃取相涂層,因此它具有更大的表面積,吸附速度更快。箭頭設(shè)計保護吸附材料,壽命更長。傳統(tǒng)SPME使用的涂層SPME ARROW也可使用[34]。在對白酒中的風味物質(zhì)進行分析時,相比固相萃取法SPME ARROW靈敏度更高,適合對低含量的揮發(fā)性香氣化合物的分析。固相微萃取法與不同的儀器聯(lián)用檢測結(jié)果見表4。

表4 應用固相微萃取法測定白酒中風味物質(zhì)的種類、檢出限、定量限及回收率

1.5 其他方法

攪拌棒吸附萃取法(stir bar sorptive extraction,SBSE)是在SPME方法的基礎(chǔ)上演化而來的。它是一種將表面具有吸附劑的磁力攪拌棒置于酒樣中吸附待測組分,然后進行解吸分離的前處理方法。與SPME相比,SBSE固定相體積大,具有萃取容量大,萃取劑用量少,經(jīng)濟環(huán)保的優(yōu)點。目前,非極性PDMS在SBSE中廣泛應用[35]。然而,截止至今,該方法可用的涂層種類少、價格昂貴,因此應用受限。

溶劑輔助風味蒸發(fā)(solvent assisted flavor evaporation,SAFE)是一種從復雜的白酒基質(zhì)中溫和地提取揮發(fā)組分的方法。由于在萃取過程中,萃取體系溫度保持在室溫,因此該方法有力地保護了熱敏性的組分,能夠完整地呈現(xiàn)白酒中自然的香氣。2016 年,宮俐莉等分別應用HS-SPME和SAFE結(jié)合GC-MS對古井貢酒酒醅中的揮發(fā)性化合物進行分析,結(jié)果表明SAFE更適合萃取醇類和脂肪酸類[36]。然而,該方法最大的缺點在于對人員操作要求高,并且整套系統(tǒng)價格昂貴,萃取時間過長,限制了其在白酒前處理中的應用。

同時蒸餾萃取法通過將樣品和萃取溶劑同時加熱至沸,揮發(fā)性組分首先被蒸餾出來,然后樣品蒸汽和溶劑蒸汽在冷凝器中冷凝完成萃取。該方法具有中高沸點成分萃取回收率較高,萃取液中沒有難揮發(fā)性成分,不會污染色譜柱的優(yōu)點。但由于長時間沸騰蒸餾,樣品原有組分可能會發(fā)生變化,產(chǎn)生新的化合物。同時蒸餾萃取法是否適合對白酒的分析檢測還有待考究[37-38]。

此外,超臨界二氧化碳萃取法、吹掃捕集法、分子蒸餾法在白酒風味分析中也有一定的應用。XU等[39]應用超臨界二氧化碳萃取法實現(xiàn)酒糟中酯類和酸類化合物的高效、準確檢出。胡國棟等[40]應用吹掃捕集法結(jié)合GC-MS從白酒中定性了74 種化合物。江思瑤等應用分子蒸餾結(jié)合HPLC實現(xiàn)了對白酒中乳酸的提取分析[41]。

2 前處理新技術(shù)

現(xiàn)有的白酒前處理方法仍存在眾多的局限性,人們迫切需要開發(fā)一種快速、準確、成本低,滿足企業(yè)日常檢測需要的萃取技術(shù)。目前前處理新技術(shù)的開發(fā)主要集中在對現(xiàn)有前處理方法如固相微萃取、固相萃取和液液萃取法進行改進。

磁性固相微萃取是在SPME的基礎(chǔ)上將磁性納米粒子與SPME裝置結(jié)合的新型萃取方法。與SPME相比,磁性納米粒子沒有固定在固相微萃取裝置的針尖上,而是在萃取過程中分散在溶液體系中,充分吸附待測物,最后利用SPME裝置在針尖富集磁性材料和待測物,這種萃取形式提高了萃取的效率。2018 年,YU等應用磁性固相微萃取結(jié)合表面增強拉曼散射(surface enhanced raman scattering,SERS)實現(xiàn)了對保健酒中枸櫞酸西地那非快速、高效的檢測,為了提高檢測的準確性,該研究者成功制備了Fe3O4@SiO2@Ag@NH2納米粒子作為吸附劑,萃取過程如圖3 所示。該方法檢出限可達1.0×10-8mol/L,整個過程僅需10 min。具有萃取效率高,檢測時間短的優(yōu)勢[42]。

圖3 磁性固相微萃取法的流程圖

2019 年,DIAZ在液液萃取的基礎(chǔ)上,探索了一種以乙酸乙酯作為萃取劑的鹽析液液萃取法,可在微量水平上測定龍舌蘭酒中的酚類,醛類和內(nèi)酯類。該方法回收率在92.1%～116.0%,檢出限在1.8×10-6～1.4×10-5g/L。相比固相萃取法該方法具有回收率高,分離萃取效率高的優(yōu)勢[43]。

2020 年,MARTINA等[44]應用固相萃取對紅葡萄酒中的白藜蘆醇進行分析,采用聚偏二氟乙烯納米纖維對聚己內(nèi)酯進行修飾,合成一種新型nPVDF/μPCL(poly(vinylidene difluoride)nanofibers on polycaprolactone microfibrous scaffold)固定相。在具體實驗中,50.0 μL葡萄酒樣品經(jīng)0.22 μm聚四氟乙烯過濾器過濾后直接注入SPE系統(tǒng),分別應用C18和nPVDF/μPCL為固定相,以乙腈為流動相進行萃取。相比其他傳統(tǒng)材料,白藜蘆醇在nPVDF/μPCL上的保留率較高,且有較好的峰型。雖然nPVDF/μPCL提取效率與商用C18吸附劑相似,但樣品凈化潛力更好,相同的萃取效果所需要的洗脫液更少。

3 總結(jié)與展望

根據(jù)白酒中待測物的性質(zhì)與含量選擇適合的前處理方法可提高成分分析的效率及準確度?，F(xiàn)階段,雖然在白酒風味研究領(lǐng)域有眾多的前處理方法可供研究人員選擇,但是LLE、SPE、SPME等已經(jīng)成熟的前處理方法依然存在問題,其他如SBSE、SAFE、SDE等方法,由于存在價格昂貴、操作復雜、分析成分單一等缺點,以致短期內(nèi)難以取代常用的前處理方法。因此,在白酒風味分析領(lǐng)域,前處理方法仍有很大的發(fā)展空間。

白酒風味研究領(lǐng)域前處理方法的發(fā)展包括兩個發(fā)展方向。一方面,開發(fā)新的白酒風味分析前處理方法或?qū)⑵渌I(lǐng)域前處理方法引入到白酒風味分析領(lǐng)域中。白酒前處理方法從最早的直接進樣法過渡到液液萃取法到后來的固相萃取法、固相微萃取法、攪拌棒吸附萃取法等,前處理方法的發(fā)展使得白酒成分分析變得多樣化、全面化、精確化。未來改進并推廣在白酒風味分析領(lǐng)域應用相對較少的SAFE、超臨界二氧化碳萃取、分子蒸餾等方法或可成為發(fā)展方向之一,例如降低SAFE和超臨界萃取設(shè)備的生產(chǎn)成本和操作難度,或利用夾帶劑增加超臨界二氧化碳萃取法萃取風味物質(zhì)的種類。另一方面,在現(xiàn)有白酒風味分析的基礎(chǔ)上,利用現(xiàn)代技術(shù)對已經(jīng)成熟應用的前處理方法進行改進,在保留原有優(yōu)勢的基礎(chǔ)上,改善這些方法的不足。例如本文提到的磁性固相萃取、分子印跡固相萃取、磁性固相微萃取等方法,是將新技術(shù)應用于成熟的前處理方法中。相比原方法,改進后的方法具有萃取效率高,萃取難度低等優(yōu)點。改善白酒風味物質(zhì)前處理方法對白酒風味化學研究的完善有其必要性和重要意義。