劉 紅， 劉貴蓮， 袁 敏， 梅紹鋒*， 耿維軍， 朱九堡

（1.四川特驅(qū)農(nóng)牧科技集團(tuán)有限公司，四川成都610207；2.四川特驅(qū)投資集團(tuán)有限公司，四川成都610207；3.新津邦得科技有限公司，四川成都611435）

斑蝥黃（或稱斑蝥黃質(zhì)）是一種類胡蘿卜素，存在于某些蘑菇、甲殼類、魚(yú)類、藻類、蛋、血液和肝臟中，1984年FDA/WHO批準(zhǔn)斑蝥黃列入食品添加劑并制訂了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。斑蝥黃質(zhì)可作為食品添加劑用于飲料、調(diào)味醬和肉類加工品等，另外，還可作為飼料添加劑改善蛋黃的顏色，并且著色后色調(diào)不受pH影響，對(duì)日光亦相當(dāng)穩(wěn)定，不易褪色。但斑蝥黃自身穩(wěn)定性較差，對(duì)氧化劑、熱和濕都十分敏感，因此需貯存于充惰性氣體的遮光性容器內(nèi)。GB/T 18970-2003檢測(cè)方法中用無(wú)色的圓底燒瓶便于觀察溶液的蒸發(fā)情況，存在色素降解的風(fēng)險(xiǎn)；用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干5 mL樣品需要1～2 h，同時(shí)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀使用步驟繁鎖，操作難度大；將蒸干的樣品轉(zhuǎn)入容量也增加了檢測(cè)誤差。因此本實(shí)驗(yàn)旨在對(duì)GB/T 18970-2003檢測(cè)斑蝥黃方法進(jìn)行改進(jìn)，以提高檢測(cè)效率和準(zhǔn)確度。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑Secure225D-1CN分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）；TDZ4-WS臺(tái)式低速離心機(jī)，湖南湘儀；UV-2800A紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，尤尼柯（上海）；MTN-2800D-24氮吹儀（無(wú)水浴控溫），天津奧特賽恩斯；RE52CS-2旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋，北京中興偉業(yè)。無(wú)水乙醇、三氯甲烷、環(huán)己烷均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了4個(gè)單因子的改進(jìn)：（1）溶液未吹干對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響；（2）溶液剛吹干和容量瓶底白吹對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響；（3）超聲溶解時(shí)間對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響；（4）自溶時(shí)間對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。最后通過(guò)分析檢測(cè)結(jié)果，確認(rèn)方法改進(jìn)的關(guān)鍵因素。其他操作步驟按國(guó)標(biāo)改進(jìn)的測(cè)定方法進(jìn)行。

1.2.1 樣品的制備 取有代表性的樣品約500 g，混合均勻，四分法將試樣分裝到4個(gè)避光真空的密封袋中，防止樣品成分變質(zhì)。

1.2.2 樣品溶液的制備 稱取試樣0.10～0.11 g（即為10%天麗紅或10%斑蝥黃；2.5%的斑蝥黃應(yīng)稱取0.35～0.40 g），精確到0.0001 g，置于250 mL容量瓶中，加10 mL預(yù)熱至60℃的蒸餾水，并在60℃的水浴中保持5 min，冷卻后，加100 mL無(wú)水乙醇和100 mL三氯甲烷，用超聲波水浴處理5 min，用三氯甲烷定容。搖勻后，取出100 mL溶液置于兩只50 mL具塞離心管內(nèi)，4000 r/min離心5 min，移出離心上層清液待用。

1.2.3 國(guó)標(biāo)檢測(cè)步驟 移取離心管內(nèi)上層清液5.0 mL，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器的圓底燒瓶中，在45℃真空蒸發(fā)至干，殘?jiān)?.5 mL無(wú)水乙醇和0.5 mL三氯甲烷潤(rùn)濕后，加入環(huán)己烷，少量多次進(jìn)行溶解，并轉(zhuǎn)移到100 mL的容量瓶中，用環(huán)己烷定容。其檢測(cè)數(shù)據(jù)為X1。

分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)是468～472 nm的吸收最大值，使用1 cm的吸收池，以空白環(huán)已烷作為參比。此方法提取的主要成分是β，β-胡蘿卜-4，4-二酮，其在波長(zhǎng)470 nm處有最大吸收值，在900～1100 nm有一個(gè)試劑雜峰。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示，使用F檢測(cè)法比較兩個(gè)方法數(shù)據(jù)的精密度，用t檢測(cè)比較兩種方法的平均值之間是否存在顯著性差異，同時(shí)國(guó)標(biāo)GB/T 18970-2003重復(fù)性要求相對(duì)偏差應(yīng)在2%以內(nèi)。

2 結(jié)果

2.1 修改方法中幾個(gè)關(guān)鍵因素的實(shí)驗(yàn)比對(duì)

2.1.1 上清液氮吹未吹干對(duì)樣品檢測(cè)含量的影響移取樣品溶液制備中離心上層清液5.0 mL，置于100 mL棕色容量瓶中，用氮吹儀（不需水浴控溫）吹至容量瓶中液體0.5 mL左右，然后向容量瓶中加入0.5 mL無(wú)水乙醇和0.5 mL三氯甲烷潤(rùn)濕后，超聲波中超聲10 min，用環(huán)己烷定容。因?yàn)槎ㄈ莺笕芤壕鶞啙?，因此放?0 min變澄清后再進(jìn)行比色。其檢測(cè)數(shù)據(jù)為X2。

從表1可以看出，上清液未吹干，定容放置半小時(shí)后，溶液變澄清后檢測(cè)吸光值，上清液使溶液的透光率降低，吸光值增大，使檢測(cè)數(shù)據(jù)偏高，兩個(gè)樣品的相對(duì)偏差分別是4.58%、3.95%，均大于重復(fù)性要求的相對(duì)偏差2%，因此差異顯著。

表1 上清液氮吹未吹干對(duì)樣品檢測(cè)含量的影響

2.1.2 上清液氮吹干燥程度對(duì)樣品檢測(cè)含量的影響 移取樣品溶液制備中離心上層清液5.0 mL，置于100 mL棕色容量瓶中，用氮吹儀（不需水浴控溫）吹干或容量瓶底部吹白，殘?jiān)?.5 mL無(wú)水乙醇和0.5 mL三氯甲烷潤(rùn)濕后，超聲波中超聲10 min，用環(huán)己烷定容。剛吹干的檢測(cè)數(shù)據(jù)為X2，容量瓶底部吹白的檢測(cè)數(shù)據(jù)為X3。

從表2可以看出，樣品剛吹干或容量瓶底部變白，加0.5 mL無(wú)水乙醇和0.5 mL三氯甲烷潤(rùn)濕后，超聲10 min定容比色，其相對(duì)偏差＜2%；F檢測(cè)值為1.30，查表F表為3.79，F(xiàn)小于F表，X2與X3的精密度無(wú)顯著性差異；10%天麗紅和10%斑蝥黃的t檢測(cè)值分別為0.13和0.09，查表（95%）得：t表=2.45，t小于t表，X2與X3的準(zhǔn)確度無(wú)顯著性差異。

2.1.3 上清液氮吹干變白后超聲溶解時(shí)間對(duì)樣品檢測(cè)含量的影響 移取樣品溶液制備中離心上層清液5.0 mL，置于100 mL棕色容量瓶中，用氮吹儀（不需水浴控溫）吹至容量瓶底部變白，殘?jiān)?.5 mL無(wú)水乙醇和0.5 mL三氯甲烷潤(rùn)濕后，超聲波中超聲10 min或20 min，用環(huán)己烷定容。超聲10 min的檢測(cè)數(shù)據(jù)為X2，超聲20 min的檢測(cè)數(shù)據(jù)為X3。

從表3可以看出，樣品氮吹干后變白，加0.5 mL無(wú)水乙醇和0.5 mL三氯甲烷潤(rùn)濕后，水浴超聲10 min定容比色或水浴超聲20 min定容比色，其相對(duì)偏差＜2%；F檢測(cè)值為2.73，查表F表為3.79，F(xiàn)小于F表，X2與X3的 精密度無(wú)顯 著性差異；10%天麗紅和10%斑蝥黃的t檢測(cè)值分別為0.31和0.57，查表（95%）得：t表=2.45，t小于t表，X2與X3的準(zhǔn)確度無(wú)顯著性差異。

表3 上清液氮吹干變白后超聲溶解時(shí)間對(duì)樣品檢測(cè)含量的影響

2.1.4 上清液氮吹干變白后靜止溶解時(shí)間對(duì)樣品檢測(cè)含量的影響 移取樣品溶液制備中離心上層清液5.0 mL，置于100 mL棕色容量瓶中，用氮吹儀（不需水浴控溫）吹至容量瓶底部變白，殘?jiān)?.5 mL無(wú)水乙醇和0.5 mL三氯甲烷潤(rùn)濕后，靜止溶解20 min或45 min，用環(huán)己烷定容。靜止溶解20 min的檢測(cè)數(shù)據(jù)為X2，靜止溶解45 min的檢測(cè)數(shù)據(jù)為X3。

從表4可以看出，樣品氮吹干后變白，加0.5 mL無(wú)水乙醇和0.5 mL三氯甲烷潤(rùn)濕后，靜止溶解20 min定容比色或靜止溶解45 min定容比色，其相對(duì)偏差＜2%；F檢測(cè)值為1.34，查表F表為3.79，F(xiàn)小于F表，X2與X3的精密度無(wú)顯著性差異；10%天麗紅和10%斑蝥黃的t檢測(cè)值分別為0.19和0.51，查表（95%）得：t表=2.45，t小于t表，X2與X3的準(zhǔn)確度無(wú)顯著性差異。

表4 上清液氮吹干變白后靜止溶解時(shí)間對(duì)樣品檢測(cè)含量的影響

2.2 國(guó)標(biāo)GB/T18970-2003與改進(jìn)后測(cè)定數(shù)據(jù)的分析 移取樣品溶液制備中離心上層清液5.0 mL，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器的圓底燒瓶中，按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)：GB/T 18970-2003檢測(cè)，檢測(cè)數(shù)據(jù)為X1。

方法優(yōu)化1：移取樣品溶液制備中離心上層清液5.0 mL，置于100 mL棕色容量瓶中，用氮吹儀（不需水浴控溫）吹至無(wú)溶液，殘?jiān)?.5 mL無(wú)水乙醇和0.5 mL三氯甲烷潤(rùn)濕后，水浴超聲溶解10 min，用環(huán)己烷定容，檢測(cè)數(shù)據(jù)為X2。

方法優(yōu)化2：移取樣品溶液制備中離心上層清液5.0 mL，置于100 mL棕色容量瓶中，用氮吹儀（不需水浴控溫）吹至無(wú)溶液，殘?jiān)?.5 mL無(wú)水乙醇和0.5 mL三氯甲烷潤(rùn)濕后，靜止溶解20 min，用環(huán)己烷定容，檢測(cè)數(shù)據(jù)為X3。

從表5可以看出，優(yōu)化方法1和優(yōu)化方法2與國(guó)標(biāo)的比對(duì)，其F檢測(cè)值分別為1.80、1.12，查表F表為3.44，F(xiàn)均小于F表，兩種優(yōu)化方法與國(guó)標(biāo)的精密度無(wú)顯著性差異；2.5%斑蝥黃、10%天麗紅、10%斑蝥黃的優(yōu)化方法1和優(yōu)化方法2的t檢測(cè)值分別為1.31、0.79、0.25和2.43、0.62、0.58，查表（95%）得：t表=2.78，t小于t表，兩種優(yōu)化方法與國(guó)標(biāo)的準(zhǔn)確度無(wú)顯著性差異。

表5 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)數(shù)據(jù)與優(yōu)化方法的數(shù)據(jù)比對(duì)

3 討論

現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)：GB/T 18970-2003飼料添加劑10%β，β-胡蘿卜-4，4-二酮（10%斑蝥黃），使用的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，其真空度控制的難度較大，操作過(guò)程繁瑣；使用的蒸發(fā)瓶為無(wú)色，存在色素降解的風(fēng)險(xiǎn)，因?yàn)榘唑S對(duì)氧氣、光和熱都十分敏感；同時(shí)還多了蒸干后溶解轉(zhuǎn)移的步驟，增加了操作的難度。改進(jìn)后的方法，直接將5 mL的上清液移到100 mL的棕色容量瓶中（棕色容量瓶有避光的作用），通過(guò)氮吹的方式，只需1 h左右就可以吹干，且一次可進(jìn)行三個(gè)樣品氮吹，移取氮吹的上清液，吹干或吹干變白也不影響檢測(cè)結(jié)果。因?yàn)樵诘禃r(shí)，可能出現(xiàn)剛好吹干或吹白情況，因此將靜止溶解的時(shí)間定為20 min或超聲溶解的時(shí)間定為10 min。兩種優(yōu)化方法有助于提高檢測(cè)的精密度和準(zhǔn)確性，同時(shí)節(jié)約了檢測(cè)時(shí)間。