侯 磊,安改麗,孫晶瑩,馮陽蒙,霍雪萍,趙永麗

(1陜西省人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科,西安 710068;2陜西省人民醫(yī)院中心實驗室;3陜西省康復(fù)醫(yī)院手術(shù)室;*通訊作者,E-mail:wrhouyijia2008@163.com)

肺癌死亡率在惡性腫瘤中位居第一,其中非小細(xì)胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)占所有肺癌類型85%。吉非替尼(gefitinib,易瑞沙)、厄洛替尼片或阿法替尼等為代表的上皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epithelial growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKI)在具有EGFR突變的NSCLC中展現(xiàn)出了較高療效,因此,這些EGFR-TKI成為存在EGFR突變晚期NSCLC患者一線用藥選擇。然而,這些患者通常在服藥10個月左右都會產(chǎn)生耐藥,因此,克服或推遲耐藥能夠明顯促進(jìn)該類患者預(yù)后。

目前普遍認(rèn)為,耐藥由多種因素導(dǎo)致,包括T790M繼發(fā)突變、轉(zhuǎn)化成小細(xì)胞肺癌、癌細(xì)胞干性獲得、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelia-mesenchymal transition,EMT)等[1]。其中EMT在許多生理或病理過程中都會發(fā)生,主要表現(xiàn)為上皮細(xì)胞獲得間質(zhì)細(xì)胞特性,上皮特性蛋白E-cadherin表達(dá)下降,間質(zhì)特性蛋白N-cadherin表達(dá)上升。EMT發(fā)生與多種腫瘤藥物耐藥相關(guān),因此,是克服耐藥一個關(guān)鍵靶點[2,3]。

表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate,EGCG)是茶酚主要成分,占總量50%-75%,具有抗炎癥、預(yù)防腫瘤、預(yù)防心腦血管疾病等多種生物活性[4-6]。此外,EGCG也被發(fā)現(xiàn)具有抑制EMT發(fā)生的作用,因此,EGCG是否具有逆轉(zhuǎn)或推遲EGFR-TKI耐藥作用需要被進(jìn)一步研究。本研究檢測了EGCG與吉非替尼作用于吉非替尼耐藥細(xì)胞株后,細(xì)胞周期、凋亡及凋亡相關(guān)蛋白以及EMT相關(guān)蛋白表達(dá)變化情況,旨在探討EGCG能否逆轉(zhuǎn)吉非替尼在EGFR突變陽性非小細(xì)胞肺癌中的耐藥,及EMT是否發(fā)生了改變。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及主要試劑

人肺腺癌細(xì)胞株P(guān)C9購自中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心。吉非替尼購于英國AstraZeneca公司。甲基偶氮唑鹽(MTT)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)購買于美國Sigma公司。PRMI1640培養(yǎng)液、小牛血清購于美國HyClone公司。兔抗人Caspase-3、Bcl-2、E-cadherin、N-cadherin抗體購于武漢三鷹公司。Annexin Ⅴ/PI雙染凋亡試劑盒購買于上海七海復(fù)泰生物科技有限公司。SDS-PAGE膠制備試劑盒與RNA酶(RNase)購于陜西先鋒生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與吉非替尼耐藥株構(gòu)建

PC9細(xì)胞采用RPMI1640培養(yǎng)液(10%小牛血清+雙抗)在5% CO2、飽和濕度、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每2-3 d傳代1次。使用半數(shù)致死劑量濃度吉非替尼持續(xù)培養(yǎng)PC9細(xì)胞至不再出現(xiàn)明顯死亡,逐漸增加吉非替尼濃度至1 μmol/L(吉非替尼有效血藥濃度為1 μmol/L),通過有限稀釋法單細(xì)胞種植于96孔板,繼續(xù)使用1 μmol/L吉非替尼培養(yǎng),將生長狀態(tài)良好的1孔細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng),挑選生長良好的細(xì)胞轉(zhuǎn)至24孔板繼續(xù)生長,將其命名為PC9耐藥組,為實驗所需耐藥株(吉非替尼溶解于DMSO中)。

1.3 MTT法檢測細(xì)胞毒性

細(xì)胞以2×104/ml濃度接種于96孔板培養(yǎng)24 h,PC9細(xì)胞分別使用0.01,0.02,0.04,0.08,0.16 μmol/L吉非替尼處理,計算IC50。PC9耐藥細(xì)胞分別使用0.8,1,2,4,8,16 μmol/L吉非替尼處理,計算耐藥組IC50。為篩選對PC9耐藥細(xì)胞生長無明顯影響的EGCG劑量,PC9耐藥細(xì)胞分別使用5,10,20,40,100,200 μmol/L的EGCG處理。各組培養(yǎng)44 h,毎孔中加入MTT 20μl(5 mg/ml)繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄掉培養(yǎng)液后加入200 μl DMSO,酶標(biāo)儀讀取490 nm吸光值,計算細(xì)胞增殖率,計算半數(shù)抑制率(IC50,GraphpadPrism 5.0)。

1.4 細(xì)胞分組及處理

PC9耐藥組細(xì)胞分別用吉非替尼(1 μmol/L)、EGGC(5 μmol/L)、1 μmol/L吉非替尼+5 μmol/LEGGC孵育48 h后,分別命名為吉非替尼組、EGCG組和吉非替尼+EGCG組。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期

細(xì)胞使用胰酶制成懸液，使用70%的冰乙醇4 ℃固定24 h，細(xì)胞離心棄除乙醇，加入RnaseA，37 ℃水浴30 min，加入PI 50 μl，4 ℃避光30 min，選擇488 nm波長檢測DNA含量，使用細(xì)胞周期擬合軟件分析各周期細(xì)胞百分比。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

使用胰酶消化制成細(xì)胞懸液,PBS重新懸浮離心細(xì)胞2次,加入500 μl 1×Binding Buffer、5 μl Annexin Ⅴ-FITC、10 μl PI,混勻室溫下避光15 min,上機檢測,以不加Annexin Ⅴ-FITC及PI細(xì)胞懸液作為陰性對照。

1.7 Western blot檢測Caspase-3、Bcl-2、E-cadherin和N-cadherin表達(dá)

細(xì)胞使用蛋白裂解液提取細(xì)胞蛋白，BCA法測定濃度。同劑量蛋白上樣后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離，PVDF膜轉(zhuǎn)膜，TBST(5%脫脂奶粉)封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3(1 ∶1 000)和Bcl-2(1 ∶1 000)與EMT相關(guān)蛋白E-cadherin(1 ∶800)和N-cadherin(1 ∶800)，二抗室溫孵育1 h，加入ECL顯色底物，使用Image-ProPlus軟件分析灰度值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞毒性檢測與耐藥株構(gòu)建

MTT法檢測結(jié)果提示吉非替尼針對PC9細(xì)胞生長抑制為劑量依賴性(見圖1),IC50為0.031 μmol/L。吉非替尼對PC9耐藥細(xì)胞生長抑制也呈劑量依賴性(見圖1),IC50為5.93 μmol/L,表明PC9耐藥細(xì)胞較PC9細(xì)胞針對吉非替尼具有明顯抵抗性。EGCG在濃度大于20 μmol/L時,對PC9耐藥細(xì)胞生長開始出現(xiàn)抑制現(xiàn)象(見圖1),而后續(xù)實驗需要一個對細(xì)胞生長無明顯影響的條件,因此選擇了5 μmol/L作為后續(xù)研究EGCG濃度。隨后在該條件基礎(chǔ)上再次對PC9耐藥組細(xì)胞進(jìn)行吉非替尼細(xì)胞毒性實驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)吉非替尼針對PC9耐藥細(xì)胞生長抑制能力明顯增強,IC50降至3.86 μmol/L(見圖1)。

與吉非替尼組比較,*P<0.05圖1 MTT檢測吉非替尼和EGCG作用48 h對細(xì)胞生長的影響Figure 1 Effect of gefitinib and EGCG on cell growth at 48 h by MTT

2.2 EGCG增加了吉非替尼對耐藥細(xì)胞周期阻滯

流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期,結(jié)果顯示:PC9耐藥組、吉非替尼組、EGCG組及吉非替尼+EGCG組G2/M期細(xì)胞比例分別為(10.8±1.2)%,(9.5±2.0)%,(12.3±2.1)%和(38.0±3.0)%(見圖2)。PC9耐藥組、吉非替尼組和EGCG組間G2/M期細(xì)胞比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),吉非替尼+EGCG組相比于其他三組,G2/M期細(xì)胞比例增多,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明,EGCG聯(lián)合吉非替尼能夠?qū)⒛退幖?xì)胞周期阻滯于G2/M期。

與其他三組比較,*P<0.05圖2 流式細(xì)胞儀檢測吉非替尼與EGCG對PC9耐藥細(xì)胞周期影響 (n=3)Figure 2 Effect of gefitinib and EGCG on the cell cycle of gefitinib-resistant PC9 cells by flow cytometry (n=3)

2.3 EGCG促進(jìn)了吉非替尼對耐藥細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)

通過流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡變化,結(jié)果顯示:PC9耐藥組、吉非替尼組、EGCG組及吉非替尼+EGCG組細(xì)胞凋亡率分別為(8.2%±1.3)%,(10.0±1.3)%,(8.1±0.9)%,(21.6±2.7)%(見圖3)。相較于PC9耐藥組、吉非替尼組、EGCG組,吉非替尼+EGCG組細(xì)胞凋亡率明顯增多,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。PC9耐藥組、吉非替尼組和EGCG組之間細(xì)胞凋亡率并無明顯差異(P>0.05)。結(jié)果表明,EGCG的使用提高了吉非替尼對于耐藥細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的能力。

與其他三組比較,*P<0.05圖3 流式細(xì)胞儀檢測吉非替尼與EGCG對PC9耐藥細(xì)胞凋亡的影響 (n=3)Figure 3 Effect of gefitinib and EGCG on the apoptosis of gefitinib-resistant PC9 cells by flow cytometry (n=3)

2.4 EGCG提高了吉非替尼對耐藥細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響

使用Wester blot檢測凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3和Bcl-2表達(dá)變化,結(jié)果提示:相較于PC9耐藥組、吉非替尼組和EGCG組,吉非替尼+EGCG組細(xì)胞Caspase-3表達(dá)量明顯增多,Bcl-2表達(dá)明顯減少,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見圖4)。PC9耐藥組、吉非替尼組、EGCG組間Caspase-3和Bcl-2表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。表明EGCG使用能夠明顯促進(jìn)吉非替尼對耐藥細(xì)胞內(nèi)Caspase-3表達(dá)的誘導(dǎo)和Bcl-2表達(dá)的抑制。

與其他三組比較,*P<0.05圖4 Western blot檢測吉非替尼與EGCG對PC9耐藥細(xì)胞Caspase-3與Bcl-2表達(dá)的影響 (n=3)Figure 4 Effect of gefitinib and EGCG on expression of Caspase-3 and Bcl-2 in gefitinib-resistant PC9 cells by Western blot (n=3)

2.5 EGCG逆轉(zhuǎn)吉非替尼誘導(dǎo)的EMT相關(guān)蛋白改變

使用Western-blot檢測PC9組、PC9耐藥組、EGCG組細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白E-cadherin與N-cadherin表達(dá)變化,結(jié)果顯示,與PC9組比較,PC9耐藥組E-cadherin蛋白表達(dá)明顯減少,N-cadherin蛋白表達(dá)明顯增多,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與PC9耐藥組相比,EGCG組E-cadherin蛋白表達(dá)增多,N-cadherin蛋白表達(dá)減少,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見圖5)。結(jié)果表明,吉非替尼的耐藥與其上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān),而EGCG能夠抑制這種轉(zhuǎn)化。

與PC9組和EGCG組比較,*P<0.05圖5 Western blot檢測吉非替尼與EGCG對PC9細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白影響 (n=3)Figure 5 Effect of gefitinib and EGCG on expression of EMT-related proteins in PC9 cells by Western blot (n=3)

3 討論

EGFR常見突變的NSCLC對于EGFR-TKI具有較好反應(yīng),但隨時間延長,耐藥變?yōu)椴豢杀苊狻Ｒ虼?必須尋找一種方法來延緩或克服耐藥發(fā)生。一種思路是聯(lián)合一種藥物去克服或推遲耐藥。有研究使用NAC聯(lián)合吉非替尼,發(fā)現(xiàn)能夠有效克服耐藥[7]。還有使用Decitabine,一種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑,逆轉(zhuǎn)吉非替尼耐藥[8]。本研究挑選了EGCG,結(jié)果表明同樣具有克服吉非替尼耐藥作用。

EGCG是綠茶中多酚的主要成分,擁有抗氧化、抗炎癥、抗凋亡等特性,并對腫瘤病人相對安全[9,10]。本研究使用PC9細(xì)胞株,EGFR19外顯子缺失突變的肺腺癌細(xì)胞株。構(gòu)建了針對吉非替尼耐藥細(xì)胞株,通過MTT法分析吉非替尼IC50,結(jié)果表明PC9耐藥組的IC50較PC9組的IC50提高了100多倍,表明構(gòu)建耐藥細(xì)胞的確對吉非替尼產(chǎn)生了耐藥。為了研究EGCG是否能夠逆轉(zhuǎn)吉非替尼耐藥,挑選了一個針對PC9耐藥細(xì)胞生長無明顯影響的條件,在此基礎(chǔ)上,通過MTT實驗再次檢測吉非替尼對PC9耐藥細(xì)胞影響,結(jié)果表明IC50下降。同時,通過流式細(xì)胞儀檢測了EGCG的使用是否改變了吉非替尼對PC9耐藥細(xì)胞細(xì)胞周期和凋亡的影響,結(jié)果表明,EGCG的聯(lián)合能夠?qū)⒓?xì)胞周期阻滯于G2/M期,同時EGCG的聯(lián)合能夠明顯提高吉非替尼對凋亡的誘導(dǎo)。Western blot結(jié)果也表明,EGCG能夠提高吉非替尼誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)。這些研究進(jìn)一步表明EGCG能夠逆轉(zhuǎn)吉非替尼耐藥,使得吉非替尼耐藥細(xì)胞再次對吉非替尼發(fā)生反應(yīng)。這與Meng等[11]研究結(jié)果相似,但他們研究主要集中在ERK信號通路上。EGCG是一個泛靶點藥物,除了該條通路是否還存在其他機制來逆轉(zhuǎn)耐藥。

目前吉非替尼耐藥機制主要包括:1.經(jīng)典耐藥機制,EGFR基因二次突變和c-MET擴(kuò)增;2.代償信號通路的建立和調(diào)節(jié)因子基因表達(dá)的改變,如IL-6/JAK1/STAT3信號通路激活、IGF1R介導(dǎo)的信號通路激活、Kras基因突變等;3.EMT發(fā)生轉(zhuǎn)換[12,13]。研究表明,EGCG在腫瘤細(xì)胞和非腫瘤細(xì)胞都具有較強的EMT抑制作用。在甲狀腺癌細(xì)胞中,EGCG能夠通過抑制TGF-β1/Smad通路抑制EMT發(fā)生[14],在干細(xì)胞中,EGCG也能夠抑制EMT發(fā)生[15]。因此,考慮EGCG對于吉非替尼耐藥逆轉(zhuǎn),是否可能通過對EMT影響而實現(xiàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),PC9細(xì)胞和PC9耐藥細(xì)胞相比,E-cadherin蛋白表達(dá)下降,N-cadherin蛋白表達(dá)上升,表明吉非替尼耐藥的確與腫瘤細(xì)胞EMT發(fā)生相關(guān)。而EGCG下調(diào)PC9耐藥細(xì)胞N-cadherin蛋白表達(dá),上調(diào)E-cadherin蛋白表達(dá)。表明EGCG能夠逆轉(zhuǎn)耐藥PC9細(xì)胞EMT。因此,EGCG對EMT影響是其逆轉(zhuǎn)PC9對吉非替尼耐藥機制之一。雖然研究結(jié)果顯示,EGCG只是將吉非替尼IC50降到了3.86 μmol/L,并沒有降至1 μmol/L之下,但由于使用的EGCG只是一個最低劑量,且EGCG對PC9耐藥細(xì)胞也呈現(xiàn)一個劑量依賴性細(xì)胞毒性,因此,理論上能夠通過提高EGCG劑量來增加協(xié)同效果,這需進(jìn)一步研究。

綜上所述,EGCG能夠逆轉(zhuǎn)存在EGFR突變肺腺癌細(xì)胞對EGFR-TKI耐藥,抑制EMT發(fā)生是逆轉(zhuǎn)耐藥機制之一。吉非替尼耐藥機制較多,本實驗誘導(dǎo)的耐藥細(xì)胞除EMT機制外,是否還存在其他耐藥機制,且EGCG為多靶點藥物,是否還存在其他逆轉(zhuǎn)耐藥機制需要我們進(jìn)一步研究。