楊 丹,姜 鴻,趙 玥,辛旭陽(yáng),趙 巖

(1遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院制劑室,沈陽(yáng) 110034;2遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥學(xué)分析室;*通訊作者,E-mail:zzq2021@126.com)

參精止渴丸是由葛根、大黃、五味子、紅參、黃芪、黃精、茯苓、白術(shù)、黃連、甘草等10味藥材,經(jīng)粉碎、過(guò)篩、混合、制丸、干燥等工藝制備而成的中藥成方制劑,其具有益氣養(yǎng)陰、生津止渴等功效,常用于治療氣陰兩虧、內(nèi)熱津傷所致的消渴,病癥見(jiàn)少氣乏力、口干多飲、易饑、形體消瘦等,為II型糖尿病患者常用藥物[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì),2019年全世界約有4.63億糖尿病患者,預(yù)計(jì)到2045年患者將達(dá)到約7億人次,其中亞洲國(guó)家,尤其我國(guó)是糖尿病患者重災(zāi)區(qū),2019年度中國(guó)糖尿病患者約1.22億人次,居全球首位[2-4];隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)社會(huì)的發(fā)展,人們生活水平的日益提高,預(yù)計(jì)2028年我國(guó)糖尿病患者數(shù)量將超過(guò)1.49億人,參精止渴丸作為臨床治療Ⅱ型糖尿病的有效藥物,收載于《中國(guó)藥典》2015年版一部,僅通過(guò)檢測(cè)葛根素含量作為含量控制指標(biāo)[1],不能較好地指示該產(chǎn)品的質(zhì)量水平,針對(duì)該產(chǎn)品中主要起功能作用的藥材葛根、五味子和大黃,控制好這3種藥材有效成分的含量,可以更好地控制該產(chǎn)品的療效,本文研究開(kāi)發(fā)中藥制劑參精止渴丸中葛根素、五味子醇甲和大黃素成分同時(shí)檢測(cè)的HPLC方法。

1 材料與方法

1.1 材料

安捷倫1260 infinity型HPLC儀;幻芾聿Synergy型超純水儀;梅特勒AB204-S型電子天平;HB-8000型超聲波清洗器。

參精止渴丸(遼寧中醫(yī)學(xué)院藥業(yè)有限公司生產(chǎn),規(guī)格:每100丸7 g,批號(hào)分別為:191212,200113,200421);葛根素對(duì)照品(批號(hào):110752-201816,含量以95.4%計(jì)),五味子醇甲對(duì)照品(批號(hào):110857-201815,含量以99.7%計(jì)),大黃素對(duì)照品(批號(hào):110756-201913,含量以96.0%計(jì)),均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;甲醇、乙腈:HPLC級(jí)(美國(guó)MERCK公司),磷酸等其他試劑:優(yōu)級(jí)純(上?；瘜W(xué)試劑廠),水為純水儀制備水。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱:Waters X-bridge ODS C18型色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流速為1.0 ml/min,柱溫設(shè)定28 ℃,進(jìn)樣體積為10 μl,檢測(cè)波長(zhǎng)為252 nm,流動(dòng)相A為乙腈,流動(dòng)相B為0.1%磷酸水溶液,梯度洗脫(見(jiàn)表1)。

表1 色譜洗脫程序

1.2.2 混合對(duì)照品溶液的制備 取葛根素、五味子醇甲和大黃素對(duì)照品,分別精密稱定76.3,299.1,76.8 mg,分別置100 ml容量瓶中,加95%甲醇溶解并稀釋至刻度,再分別取上述儲(chǔ)備溶液各1.0 ml,置10 ml容量瓶中,加95%甲醇制成每1 ml溶液中分別含葛根素76.3 μg、五味子醇甲299.1 μg、大黃素76.8 μg的對(duì)照品混合儲(chǔ)備溶液;再分別精密量取上述對(duì)照品儲(chǔ)備溶液各1.0 ml,置10 ml容量瓶中,加95%甲醇定容至刻度,即得。

1.2.3 供試品溶液 取參精止渴丸樣品,將內(nèi)容物置研缽中研細(xì),取約1.0 g,精密稱定,置50 ml容量瓶中,加95%甲醇35 ml,超聲提取25 min(超聲頻率80 kHz,功率200 W),放冷,加95%甲醇定容至刻度,搖勻,0.45 μm濾膜濾過(guò),取續(xù)濾液,作為供試品溶液。

1.2.4 陰性供試品溶液 按參精止渴丸加工方法和藥材配比分別制備缺葛根、五味子和大黃素的陰性供試品,陰性供試品按2.3供試品溶液制備方法處理,分別制備陰性供試品溶液。

2 結(jié)果

2.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

取1.2.2混合對(duì)照品溶液和1.2.3供試品溶液,按1.2.1色譜條件分別進(jìn)樣10 μl,采集色譜圖。葛根素、五味子醇甲和大黃素均能達(dá)到基線分離,且各色譜峰之間分離度均大于1.5,以葛根素色譜峰計(jì)算理論塔板數(shù)大于5 000。結(jié)果表明色譜系統(tǒng)適應(yīng)性良好。

2.2 專屬性試驗(yàn)

分別取1.2.2混合對(duì)照品溶液、1.2.3供試品溶液和1.2.4陰性供試品溶液,按1.2.1色譜條件分別進(jìn)樣10 μl,采集色譜圖。對(duì)照品溶液與供試品溶液中3種成分色譜峰保留時(shí)間一致,陰性供試品溶液無(wú)干擾(見(jiàn)圖1)。結(jié)果表明方法專屬性良好。

2.3 線性關(guān)系考察

取1.2.2混合對(duì)照品溶液,分別精密量取0.1,0.5,1.0,2.0,5.0,10.0 ml,分別置10 ml量瓶中,加95%甲醇定容至刻度,搖勻,按1.2.1色譜條件分別進(jìn)樣10 μl,采集色譜圖。分別以葛根素、五味子醇甲和大黃素峰面積為縱坐標(biāo)(Y),對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算曲線方程和相關(guān)系數(shù)。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 線性范圍、回歸方程及相關(guān)系數(shù)

2.4 加樣回收試驗(yàn)

取已知含量的參精止渴丸樣品(批號(hào):191212),將內(nèi)容物置研缽中研細(xì),取約0.5 g,精密稱定,置50 ml容量瓶中,分別精密量取1.2.2項(xiàng)下葛根素、五味子醇甲和大黃素儲(chǔ)備溶液適量,加入到上述容量瓶中,后續(xù)按2.3供試品溶液方法處理,得樣品加標(biāo)溶液,同法平行制備6份。按1.2.1色譜條件分別進(jìn)樣10 μl,采集色譜圖。根據(jù)色譜圖中3種待測(cè)成分峰面積計(jì)算樣品中的加標(biāo)量,與實(shí)際加入量計(jì)算加標(biāo)回收率。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.5 儀器精密度試驗(yàn)

取1.2.2混合對(duì)照品溶液,按1.2.1色譜條件進(jìn)樣10 μl,連續(xù)進(jìn)樣6次,采集色譜圖。結(jié)果葛根素、五味子醇甲和大黃素精密度RSD分別為0.67%,1.01%和0.99%,結(jié)果表明儀器精密度良好。

1.葛根素;2.五味子醇甲;3.大黃素圖1 各溶液典型色譜圖Figure 1 Typical chromatogram of mixed reference solutions

2.6 方法重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批次參精止渴丸樣品(批號(hào):191212),按1.2.3供試品溶液方法處理,制備供試品溶液,同法平行制備6份供試品;再按1.2.1色譜條件分別進(jìn)樣10 μl,采集色譜圖。結(jié)果葛根素、五味子醇甲和大黃素重復(fù)性RSD分別為1.17%,1.82%和1.53%,結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

取參精止渴丸樣品(批號(hào):191212),按1.2.3供試品溶液方法處理,制備供試品溶液,分別于室溫下放置0,1,3,6,9,12,24 h,按1.2.1色譜條件每個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)分別進(jìn)樣10 μl,采集色譜圖。結(jié)果葛根素、五味子醇甲和大黃素峰面積RSD分別為1.37%,1.09%和0.79%,結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 市售樣品檢測(cè)

取參精止渴丸樣品(遼寧中醫(yī)學(xué)院藥業(yè)有限公司生產(chǎn),規(guī)格:每100丸7 g,批號(hào)分別為:191212,200113,200421),分別按1.2.3供試品溶液方法處理,制備供試品溶液,再按1.2.1色譜條件分別進(jìn)樣10 μl,采集色譜圖。根據(jù)色譜圖3種待測(cè)成分峰面積計(jì)算3份供試品中的含量。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 市售樣品含量測(cè)定結(jié)果 (mg/g)

3 討論

3.1 測(cè)定波長(zhǎng)的優(yōu)化

取葛根素對(duì)照品,精密稱取10 mg,加95%甲醇制備每1 ml溶液中含葛根素10 μg/ml的波長(zhǎng)檢查溶液,同法制備五味子醇甲和大黃素波長(zhǎng)檢查溶液。按1.2.1色譜條件,設(shè)定掃描波長(zhǎng)在200-400 nm,分別進(jìn)樣10 μl,采集色譜和光譜圖。結(jié)果,葛根素、五味子醇甲和大黃素分別在251,250,253 nm處有最大吸收,3種待測(cè)成分最大吸收波長(zhǎng)均在252 nm附近。故實(shí)驗(yàn)設(shè)定檢測(cè)波長(zhǎng)為252 nm。

3.2 流動(dòng)相的優(yōu)化

參考《中國(guó)藥典》2015年版中,葛根中葛根素的測(cè)定流動(dòng)相選擇甲醇 ∶水為25 ∶75,五味子中五味子醇甲的測(cè)定流動(dòng)相選擇甲醇 ∶水為65 ∶35,大黃中大黃素的測(cè)定流動(dòng)相選擇甲醇 ∶0.1%磷酸溶液為85 ∶15[5]。實(shí)驗(yàn)分別選擇上述3種流動(dòng)相體系,考察對(duì)葛根素、五味子醇甲和大黃素分離情況的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),選擇甲醇體系時(shí),分析時(shí)間長(zhǎng),尤其是極性最弱的大黃素,出峰時(shí)間久、檢測(cè)效率低。選擇乙腈體系時(shí),分析時(shí)間短,3種待測(cè)成分分離度較好,且效率更高。因此實(shí)驗(yàn)選擇乙腈 ∶0.1%磷酸溶液作為流動(dòng)相體系。

綜上所述,實(shí)驗(yàn)為完善參精止渴丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),提高該產(chǎn)品的質(zhì)量控制水平,建立了中藥制劑參精止渴丸中葛根素、五味子醇甲和大黃素成分同時(shí)檢測(cè)的HPLC方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與藥典標(biāo)準(zhǔn)方法比較,本研究建立的方法增加了質(zhì)量控制藥材品種,提高了產(chǎn)品的質(zhì)量控制水平,此方法科學(xué)、簡(jiǎn)單、檢測(cè)效率高,可以用于參精止渴丸產(chǎn)品的質(zhì)量控制。