鄢雨朦，付保榮

(遼寧大學(xué) 環(huán)境學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110036)

1 引言

現(xiàn)在，生物修復(fù)技術(shù)已變成對(duì)生態(tài)環(huán)境進(jìn)行保護(hù)過(guò)程中的一類最有價(jià)值的修復(fù)手段[1]，石油污染土壤的生物修復(fù)不僅可以有效地降解石油，而且可以有效地降低修復(fù)石油污染土壤時(shí)帶來(lái)的生物入侵風(fēng)險(xiǎn)。利用微生物進(jìn)行石油污染土壤的修復(fù)擁有操作便捷、成本低、無(wú)二次污染、不損害土壤構(gòu)造等優(yōu)勢(shì)[2,3]。自然環(huán)境中很多微生物，能夠只把石油烴當(dāng)作碳源和能源，借助氧化、脫氫等可以發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)、外的通過(guò)酶促進(jìn)的反應(yīng)，從而將石油烴降解成水、二氧化碳和其他代謝產(chǎn)物[4,5]。這類微生物有種別多、遍布范圍廣、繁殖快、個(gè)體小、比表面積大和易變異的特征，這使其在修復(fù)被石油污染土壤的時(shí)候體現(xiàn)出效率高且多樣的性質(zhì)。微生物對(duì)石油烴污染物的降解取決于石油烴污染物的量、狀況、環(huán)境條件以及微生物群落構(gòu)成[6]。

本文研究了兩株石油降解菌進(jìn)行組合后降解石油的效果，將篩選出的兩株石油降解菌2#、3#進(jìn)行復(fù)配，構(gòu)建復(fù)合石油降解菌。將復(fù)合石油降解菌應(yīng)用在石油污染控制中，不僅能夠高效治理石油污染的環(huán)境，還為石油降解菌進(jìn)一步修復(fù)石油污染土壤提供了依據(jù)。

2 實(shí)驗(yàn)材料

2.1 培養(yǎng)基

(1)石油無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基：K2HPO46 g，KH2PO46 g，(NH4)2SO46 g，NaCl 5 g，石油1 g，pH值為7.0，蒸餾水1000 mL。固體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上加入瓊脂15～20 g即可。

(2)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，蒸餾水1000 mL，pH值為7. 0～7.2，121 ℃滅菌20 min。固體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上加入瓊脂15～20 g即可。

2.2 實(shí)驗(yàn)試劑

石油、石油醚。

2.3 實(shí)驗(yàn)所需菌株

前期實(shí)驗(yàn)富集分離純化得到的石油降解菌2#和3#。

2.4 主要儀器設(shè)備

探究過(guò)程主要使用的儀器設(shè)備見(jiàn)表1。

表1 主要實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備

3 復(fù)合石油降解菌的構(gòu)建及其對(duì)石油降解情況的探究

3.1 復(fù)合石油降解菌的構(gòu)建

首先，將在4 ℃冰箱中存留的菌種培養(yǎng)基在35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，在潔凈工作臺(tái)上先用酒精燈外焰對(duì)接種環(huán)滅菌，等其冷卻后挑取試管內(nèi)單一完整的菌落，分別轉(zhuǎn)接到平板固體培養(yǎng)基上，在35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。分別取一環(huán)活化的單菌株接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，置于條件設(shè)置為35 ℃、轉(zhuǎn)速150 r/min的恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)24 h，使菌株大量生長(zhǎng)。將通過(guò)上述過(guò)程得到的單菌株菌液分別以1∶1、1∶2、2∶1、2∶3、3∶2的比例混合制備得到混合菌株菌液，構(gòu)建降解石油的復(fù)合菌(圖1)。

3.2 復(fù)合石油降解菌對(duì)石油降解情況的探究

將2.5 mL(體積分?jǐn)?shù)為5%)混合菌株的菌液接入50 mL石油無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液，將不接菌液的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。其培養(yǎng)與條件設(shè)置為35 ℃、150 r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)6 d。每組樣品做3個(gè)平行樣。

在取出的培養(yǎng)液中加入石油醚進(jìn)行萃取，并將萃取液在5000 r/min的條件下進(jìn)行離心10 min，轉(zhuǎn)入分液漏斗，靜置分層，收集上清液。反復(fù)三次用石油醚洗滌，合并上層萃取液。加入2 g無(wú)水Na2SO4過(guò)濾，隨即裝入10 mL容量瓶中，用石油醚定容到刻度線。之后采用紫外分光光度法測(cè)定石油降解率[7]，利用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在254 nm波長(zhǎng)處依次對(duì)萃取液進(jìn)行吸光度值的測(cè)定，以石油醚為空白。經(jīng)由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算石油的剩余量，并借助下述公式計(jì)算得出菌株的石油降解率。

單菌株在菌群中所占比例及不同比例的單菌構(gòu)成的復(fù)合菌降解石油的效率如表2所示。

表2 復(fù)合菌的石油降解率

圖1 菌株投加比例對(duì)菌株降解率的影響

通過(guò)表2可以看出，五組復(fù)合石油降解菌培養(yǎng)6 d后的石油降解率分別為35.09%、40.08%、55.03%、62.66%、52.88%。實(shí)驗(yàn)得出菌株的最佳復(fù)配比為2∶3，此時(shí)復(fù)合石油降解菌的石油降解率可達(dá)到62.66%。前期實(shí)驗(yàn)得出2#菌株降解石油的效率為21.99%、3#菌株降解石油的效率為30.2%，相比于單菌株石油降解率，復(fù)合菌降解石油的效率分別提高了約40.67%、32.46%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明復(fù)配后的菌株對(duì)石油烴的降解效果均優(yōu)于單菌株，能夠較好的進(jìn)行石油的降解，為后續(xù)菌株降解石油的應(yīng)用提供指導(dǎo)。

4 結(jié)語(yǔ)

實(shí)驗(yàn)得出菌株的最佳復(fù)配比為2∶3，此時(shí)復(fù)合石油降解菌的石油降解率可達(dá)到62.66%，相比于單菌株石油降解率，復(fù)合菌降解石油的效率提高了約32.46%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明復(fù)配后的菌株對(duì)石油烴的降解效果均優(yōu)于單菌株，其不僅能夠用來(lái)治理石油污染的環(huán)境，還能夠?yàn)槭徒到饩M(jìn)一步運(yùn)用在修復(fù)石油污染土壤中提供依據(jù)。