吳英詳 黃成能 龔江美 黃建英 潘騰飛x

摘 ?要：為研究‘迷你紅柚果實發(fā)育過程中的類胡蘿卜素組分與含量變化，本研究采用正乙烷-無水乙醇-丙酮（2∶1∶1）萃取法對‘迷你紅柚果實中的類胡蘿卜素進行快速提取，利用高效液相色譜（HPLC）測定了果實海綿層、囊衣和汁胞及其不同發(fā)育時期的類胡蘿卜素組分和含量。結果表明，流動相為乙腈-甲醇-四氫呋喃（90∶5∶5），流速0.3?mL/min，進樣量10 μL，柱溫40?℃，樣品室溫度20?℃，檢測波長450 nm，3種類胡蘿卜素8 min內即可較好地分離;‘迷你紅柚成熟果實中含有3種類胡蘿卜素，含量從高到低依次是番茄紅素、β-胡蘿卜素和玉米黃素;類胡蘿卜素主要積累在汁胞中，番茄紅素是紅色的汁胞、囊衣和海綿層中最重要的色素;隨著果實的發(fā)育成熟，類胡蘿卜素的含量逐漸升高，番茄紅素和β-胡蘿卜素在汁胞和囊衣中隨著果實的發(fā)育而累積，玉米黃素只在成熟階段的果實中檢測到，且含量顯著低于番茄紅素和β-胡蘿卜素。研究結果為‘迷你紅柚果實品質評價和開發(fā)利用提供科學依據。

關鍵詞：柚;番茄紅素;β-胡蘿卜素;玉米黃素

Abstract： To determine the components and contents of carotenoid in ‘Minihongyou [Citrus maxima （Burm.） Merr.]， a putative new pomelo mutant， the solvent extraction method was used to quickly extract the carotenoids from the fruits， the components and contents of the carotenoids in albedo， segment wall and juice sacs during the developmental stages weredetermined by UPLC technology. The results showed that the optimum extractant was N-ethane， anhydrous ethanol andacetone with a proportion 2∶1∶1. The mobile phase of UPLC was acetonitrile-methanol-tetrahydrofuran （90∶5∶5）， flow rate was 0.3 mL/min， injection volume was 10 μL， column temperature was 40?℃， sample temperature was 20?℃.Carotenoids could be separated exactly at 450 nm for 8 min. As determined by UPLC， three major types of carotenoids were contained in mature fruits， the content of which were lycopene， β-carotene， and zeaxanthin in order from high to low. Carotenoids were mainly accumulated in juice sacs， and lycopene was the most important pigment in juice sacs， segment wall and albedo. Accompanied by fruit development， the content of carotenoids gradually increased. Lycopene and β-carotene accumulated in the juice sacs and segment with the fruit development. Zeaxanthin was only detected in mature fruits， and the content was significantly lower than lycopene and β-carotene.

Keywords： pomelo; lycopene; β-carotene; zeaxanthin

色澤是果實感官品質的重要指標，對果實及其后續(xù)生產加工具有重要的影響，色素的積累是果實色澤形成的基礎，色素的種類、含量決定了果實的色質和呈色深度[1]。類胡蘿卜素在園藝產品中分布廣泛，吸光能力強，在400～500?nm內具強吸收，能呈現(xiàn)出紅色、橙色以及黃色[2]。類胡蘿卜素由于具有多個共軛雙鍵，具有抗氧化、預防慢性疾病、抗癌和增強抵抗力等功效，對人體具有一定的保健功能。

類胡蘿卜素具有親脂性，不同結構的類胡蘿卜素所用的提取溶劑差異較大[3]，傳統(tǒng)的提取方法常用組合溶劑提高提取效率[4]。目前，酶輔助提取[5]、微波輔助提取[6]、超聲波輔助提取[7]和超臨界流體萃取[8]等提取技術也被廣泛應用。類胡蘿卜素的檢測方法主要有高效液相色譜法（high performance liquid chromatography， HPLC）[9]、超高效液相色譜法（ultra performance liquid chromatography， UPLC）[10]和液相色譜-串聯(lián)質譜法（liquid chromatograph-mass spectrometer /mass spectrometer，LC-MS /MS）[11]，其中，UPLC是最常用的方法，具有價廉、易操作和穩(wěn)定性好等優(yōu)點，是分析果實類胡蘿卜素的有效工具。

柚[Citrus maxima （Burm.） Merr.]含有豐富的類胡蘿卜素。研究發(fā)現(xiàn)，成熟時期的紅色蜜柚果實中含有豐富的類胡蘿卜素，紅肉的‘琯溪蜜柚突變體以番茄紅素為主要呈色色素，‘三元紅心柚的海綿層和果肉的紅色也是因積累番茄紅素而著色[12]，‘紅綿蜜柚和‘三紅蜜柚的外果皮、海綿層、囊衣等組織因含有番茄紅素與β-胡蘿卜素而顯紅色，且不同類型的蜜柚類胡蘿卜素的含量存在明顯差異[13]。類胡蘿卜素在果實發(fā)育過程中的積累呈現(xiàn)動態(tài)變化，種類和含量差異很大[14-15]。對‘紅肉蜜柚等紅肉品種的蜜柚果實不同發(fā)育時期類胡蘿卜素的積累過程研究發(fā)現(xiàn)，外果皮類胡蘿卜素的積累機制與海綿層、囊衣和汁胞不同[13]，類胡蘿卜素合成途徑基因的表達量在各組織中存在差異[16]，但柚果實中類胡蘿卜素的積累機制還有待進一步研究。

‘迷你紅柚是一個疑似從‘琯溪蜜柚芽變產生的新種質[17]，其果形較小，具有海綿層薄、無籽、不粒化等優(yōu)點，與‘琯溪蜜柚相比，其果肉呈紅色，外果皮和海綿層呈淡紅色，但其主要色素組分尚不明確。為確定‘迷你紅柚果實所含類胡蘿卜素主要組分和含量及其在不同組織和不同發(fā)育時期的積累規(guī)律，本研究采用UPLC技術檢測了‘迷你紅柚汁胞、囊衣、海綿層類胡蘿卜素的成分與含量，探究其顯色規(guī)律和累積變化，為‘迷你紅柚的果實品質評價和開發(fā)利用提供科學依據。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?材料與試劑 ?‘迷你紅柚果實采自福建省平和縣，從花后150?d開始取樣，此后每隔30?d取樣1次，直至果實完全成熟，共取樣5次。每次取樣選擇大小、成熟度相近的果實，3個果實為1個重復，每組樣品3個重復。采收后立即取出海綿、囊衣、汁胞，用錫箔紙包裝后，液氮速凍，置于–80?℃冰箱中保存。

番茄紅素標準品、β-胡蘿卜素標準品、玉米黃素標準品以及丁羥甲苯（BHT），美國Sigma公司;四氫呋喃（色譜純），購自上海Macklin公司;甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純），購自德國Merck公司;石油醚、丙酮、正乙烷、甲醇、無水乙醇、二氯甲烷等均為分析純，購自上海滬式實驗室器材股份有限公司;超純水為自制。

1.1.2 ?儀器與設備 ?主要儀器設備包括ACQUITY UPLC?（美國 WATERS 公司）超高效液相色譜儀，配有自動進樣器、四元溶劑管理器、C18色譜柱（ACQUITY-X Bridge BEH，2.1?mm× 100?mm，1.7 ?m），ACQ-TUV紫外檢測器（ACQUITY UPLC H-Class系統(tǒng)）、和WATERS? EMPOVER 3分析軟件;Allegra 64R高速冷凍離心機（美國Backman公司）;旋轉蒸發(fā)儀（日本Eyela公司）等。

1.2 ?方法

1.2.1 ?類胡蘿卜素的提取 ?參照龔江美[18]的方法提取類胡蘿卜素。將樣品在液氮下迅速研磨成粉末，轉移入50 mL離心管中，加入10 mL預冷提取劑;恒溫水浴鍋40?℃下振蕩浸提30 min;4?℃下12000 r/min離心15 min;取上清液于50 mL離心管;重復3次，合并上層有機相，得到樣液。將樣液轉移至分液漏斗中，用雙蒸水洗滌3～4次至中性、潔凈無渣，加入少量無水硫酸鈉脫水;轉移至蒸餾燒瓶，在旋轉蒸發(fā)儀中200 MPa、35?℃條件下蒸干;加入2 mL二氯甲烷充分溶解，轉移至2 mL離心管中，低溫避光保存。所有樣品進樣前經0.22 μm微孔濾膜過濾。

提取劑采用以下5種：石油醚-丙酮（1∶1）、石油醚-丙酮（2∶1）、正乙烷-丙酮（2∶1）、正乙烷-甲醇-丙酮（2∶1∶1）、正乙烷-無水乙醇-丙酮（2∶1∶1）。

1.2.2 ?色譜條件 ?流速0.3 mL/min;進樣量10?μL;柱溫40?℃;樣品溫度20?℃;檢測波長450 nm;流動相為乙腈-甲醇-四氫呋喃（90∶5∶5），等度洗脫。

1.2.3 ?標準曲線的制作 ?精密稱取番茄紅素、β-胡蘿卜素、玉米黃素標準品各1.0 mg，溶于二氯甲烷中，定容為100 μg/mL的標準母液。 逐級稀釋，制成0.77、1.53、3.06、6.12、12.5、25、50、100 μg/mL標準溶液進樣經UPLC測定。以峰面積為縱坐標（y），濃度為橫坐標（x），制作標準曲線。

1.2.4 ?精密度、重復性和回收率試驗 ?取番茄紅素、β-胡蘿卜素、玉米黃素標準品母液，重復進樣10次，分別記錄保留時間和峰面積，計算出平均值、標準差和變異系數(shù)，評價儀器的精密度和方法的重復性。

取‘迷你紅柚樣液3份，測定其色素含量;參考陳銀花等[19]的方法，分別加入70 μg番茄紅素標準品、70 μg β-胡蘿卜素標準品、80 μg玉米黃素標準品進行測定，計算回收率，平行測定3次。

1.2.5 ?樣品類胡蘿卜素的測定 ?利用ACQUITY UPLC?超高效液相色譜儀，按上述篩選后的方法進行上樣測定，記錄色譜圖峰面積，代入標準曲線，計算出類胡蘿卜素含量。計算公式如下：

類胡蘿卜素物質含量（mg/g）=（C×V）/M

其中，C為標準曲線算得的樣品濃度（mg/mL）;V為樣品定容體積（mL）;M為樣品稱樣量（g）。

1.3 ?數(shù)據處理

利用SPSS 19.0軟件對數(shù)據進行處理，采用S-N-K法進行差異顯著性分析。

2 ?結果與分析

2.1 ?不同提取劑對‘迷你紅柚果實類胡蘿卜素的提取差異

比較5種提取劑對‘迷你紅柚果實（花后180?d）中類胡蘿卜素的提取效果，結果如圖1、圖2所示。正乙烷-無水乙醇-丙酮（2∶1∶1）的提取效果最佳，在相同的色譜條件下，各相鄰色譜峰分離較好，所提取得到的類胡蘿卜素（420??g/g）顯著高于其他提取劑，其次為正乙烷-甲醇-丙酮（2∶1∶1）（350 ?g/g），石油醚-丙酮（1∶1，2∶1）和正乙烷-丙酮（2∶1）的提取效果較差，本研究選擇正乙烷-無水乙醇-丙酮（2∶1∶1）作為柚果實類胡蘿卜素的提取劑。

2.2 ?標準曲線、重復性、精密度和回收率分析

番茄紅素、β-胡蘿卜素與玉米黃素的線性相關系數(shù)依次為0.9985、0.9990、0.9987，線性回歸方程分別為：y=22693x–27915，y=24512x–29459，y=29837x–34619。由表1可知，番茄紅素、β-胡蘿卜素、玉米黃素標準品保留時間的變異系數(shù)分別為0.25%、0.30%、0.21%，重復性良好。峰面積的變異系數(shù)分別為0.69%、1.00%、0.41%，儀器精密度良好。本研究建立的UPLC測定方法較為準確，可用于檢測果實類胡蘿卜素含量。

將檢測總量減去樣液原測出量，再除以加標量，得到回收率，結果如表1所示，3種類胡蘿卜素的平均回收率分別為98.6%、102.3%、99.1%，說明該本測定方法準確度較高。

2.3 ?成熟果實中的類胡蘿卜素組分及含量分析

‘迷你紅柚的成熟果實如圖3所示，汁胞紅色，囊衣粉紅色，海綿層淡粉色。UPLC的測定結果表明，果實中含有番茄紅素、β-胡蘿卜素和與米黃素。在成熟果實不同組織中，類胡蘿卜素含量差異顯著（表2）。汁胞中的類胡蘿卜素含量最高，達461.10 μg/g，顯著高于囊衣中所含的122.81?μg/g，海綿層中所含的類胡蘿卜素最少，僅有51.49?μg/g。汁胞中番茄紅素含量為387.65?μg/g，占汁胞中所含類胡蘿卜素的84.07%，是主要的成色色素，β-胡蘿卜素含量為66.79 μg/g，占14.48%，玉米黃素含量6.66 μg/g;在囊衣中，含量最高的亦是番茄紅素，占囊衣中類胡蘿卜素含量的61.34%，β-胡蘿卜素占33.12%，玉米黃素占5.53%;海綿層中主要含有番茄紅素和β-胡蘿卜素。

2.4 ?果實發(fā)育過程中的胡蘿卜素組分與含量分析

在果實發(fā)育期間，不同類胡蘿卜素組分在果實不同組織中的積累和變化趨勢如圖4所示。結果表明，番茄紅素和β-胡蘿卜素在汁胞和囊衣中隨著果實的發(fā)育而累積，玉米黃素只在成熟階段的果實中檢測到，且含量顯著低于番茄紅素和β-胡蘿卜素。在果實發(fā)育早期，汁胞中就含有大量的番茄紅素，從花后180 d至果實成熟，番茄紅素的含量無顯著差異（P=0.67>0.05），說明汁胞中的番茄紅素主要是在果實發(fā)育的早期積累，這與觀察結果相一致，即在果實發(fā)育的早期汁胞即表現(xiàn)出紅色;而β-胡蘿卜素則隨著果實的發(fā)育而顯著增加，玉米黃素只在成熟果實中積累。囊衣中的番茄紅素含量呈先上升后下降的趨勢，β-胡蘿卜素含量在果實發(fā)育過程中呈現(xiàn)顯著上升的變化趨勢，與汁胞相同，只在成熟果實的囊衣中檢測到玉米黃素。海綿層中的番茄紅素、β-胡蘿卜素和玉米黃素的變化趨勢與囊衣的變化趨勢一致，但3種組分的含量在各個發(fā)育時期均低于囊衣和汁胞。

3 ?討論

由于類胡蘿卜素種類繁多，結構也不盡相同，且廣泛存在于各種果蔬中，目前并無一種溶劑或混合試劑可廣泛應用于各種材料、各種類胡蘿卜素的提取。極性大的含氧類胡蘿卜素主要使用丙酮等極性強的溶劑，極性小的主要使用石油醚等極性弱的溶劑[20]。孫丹等[21]在用HPLC-MS/MS法測定甜櫻桃花色苷與非花色苷酚時，用甲酸–甲醇提取花色苷，用乙酸乙酯提取非花色苷酚;趙文恩等[22]在測定蘋果果皮的類胡蘿卜素時以丙酮與石油醚為提取劑。柚果實中類胡蘿卜素的提取方法較多，針對不同類型的柚品種和組織有不同的提取試劑，邵金華等[23]用丙酮作為萃取劑提取柚皮中的類胡蘿卜素，陶俊等[24]用含有1% BHT的丙酮溶液提取柑橘果實的類胡蘿卜素，而乙醇-丙酮（1∶1）適于提取柑橘葉片中的類胡蘿卜素[25]，本試驗在前人研究的基礎上，通過比較確定了正乙烷-無水乙醇-丙酮（2∶1∶1）是提取‘迷你紅柚果實類胡蘿卜素的最適宜提取劑，這與陳細羽等[10]的研究結果一致，說明‘迷你紅柚果實中的類胡蘿卜素為極性較大的含氧類胡蘿卜素。

柑橘類果實的呈色色素包括類胡蘿卜素和花青素[24]，柑橘果實中的類胡蘿卜素有115種[26]，果實中主要積累葉黃素，包括玉米黃素，β-隱黃質等[27-28]。在目前所發(fā)現(xiàn)的柚資源中，僅有紫皮柚的果皮含有花青苷，而其他資源都是積累類胡蘿卜素而呈色[29]，紅色汁胞主要是因為含有較高含量的番茄紅素、β-胡蘿卜素或β-隱黃質而呈色[14]，因此本研究只檢測‘迷你紅柚果實中的番茄紅素等類胡蘿卜素組分。不同類型的柑橘果實積累的類胡蘿卜素種類不同，比如宮內伊予柑果皮中以玉米黃素、β-隱黃質2種色素為主，β-胡蘿卜素含量不足類胡蘿卜素的 1%，α-胡蘿卜素極低[30-31]，在柚果實中，主要是由于β-胡蘿卜素、八氫番茄紅素和番茄紅素等類胡蘿卜素的積累而使果實呈現(xiàn)紅色[32]。在‘三紅蜜柚和‘紅肉蜜柚成熟果實中含有大量的番茄紅素[13]，本研究發(fā)現(xiàn)，‘迷你紅柚汁胞中含量最高的類胡蘿卜素為番茄紅素，這與柚果實紅色芽變品種的呈色色素一致，說明番茄紅素也是‘迷你紅柚的主要呈色色素。在葡萄柚果實中，主要的色素成分為β-胡蘿卜素[33]，而寬皮柑橘果實中的主要類胡蘿卜素是β-隱黃質，但是在‘迷你紅柚中，β-胡蘿卜素的含量低于番茄紅素，沒有檢測到β-隱黃質，表明‘迷你紅柚果實β-胡蘿卜素的代謝途徑與葡萄柚和寬皮柑橘有較大差異。在‘紅肉蜜柚汁胞中含有葉黃素[13]，果肉呈黃色的‘黃金蜜柚汁胞中含有β-隱黃質，但未檢測出玉米黃素[32]，葡萄柚果實中只含有約0.50 μg/g的玉米黃素[33]，本研究發(fā)現(xiàn)‘迷你紅柚中含有玉米黃素，但含量低于其他類型的類胡蘿卜素，這與前人的研究結果一致。

果實不同組織中積累的色素組分不同。果皮是類胡蘿卜素積累的主要部位，通常果皮比果肉類胡蘿卜素含量高 2.5～15倍[34]。在‘紅肉蜜柚果實中，汁胞和囊衣中的番茄紅素無顯著差異，但在‘三紅蜜柚中，囊衣中的番茄紅素含量是汁胞中的2倍左右[13]，在‘迷你紅柚中，番茄紅素只要集中在汁胞，這與形態(tài)學觀察結果一致，但番茄紅素在不同組織中如何形成和運輸還有待進一步研究。在柚果實發(fā)育過程中，類胡蘿卜素的含量隨著果實的發(fā)育逐漸增加[13]，在本研究中也發(fā)現(xiàn)，汁胞、囊衣中的類胡蘿卜素含量隨著果實的發(fā)育逐漸增加，但玉米黃素只在成熟果實中出現(xiàn)。在類胡蘿卜素的代謝途徑中，番茄紅素是第一個合成的有色類胡蘿卜素物質，番茄紅素在β-環(huán)化酶的催化下進一步生成β-胡蘿卜素，然后在羥化酶的作用下生成玉米黃素[35-36]，在‘迷你紅柚的成熟果實中，可能存在著類似的類胡蘿卜素合成途徑，導致有部分玉米黃素生成，且是在囊衣中首先出現(xiàn)，推測玉米黃素的合成首先在囊衣中進行，但累積的色素是在果實內部合成或是果實外部合成后轉運至果實中，還有待進一步研究。

綜上所述，‘迷你紅柚果實所含類胡蘿卜素類組分和積累規(guī)律與‘紅肉蜜柚等柚果實相似，類胡蘿卜素的合成和積累受特定的細胞器官、發(fā)育時期等因素共同調控。本研究明確了‘迷你紅柚果實的色素組分，對柚類果實的類胡蘿卜素代謝機制研究具有重要意義，也為其果實品質的評價提供了理論依據，有助于該品種的推廣應用。

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責任編輯：崔麗虹