王金龍，程平言*，熊曉通，尹艷艷

（貴州茅臺酒廠（集團）習(xí)酒有限責(zé)任公司，貴州 遵義 564622）

氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，EC）是一種天然產(chǎn)生于發(fā)酵食品（面包、酸奶、醬油等）和飲料酒中的化合物[1-2]，可導(dǎo)致肺腫瘤、淋巴癌、肝癌、皮膚癌等疾病[3]，在2007年被世界衛(wèi)生組織國際癌癥調(diào)研機構(gòu)列為2A類致癌物[4]。食用發(fā)酵食品和飲用酒精飲料是目前人體攝取EC的兩種主要方式[5]，歐美發(fā)達國家為降低其食品安全風(fēng)險紛紛對各類市場上的酒精飲料制定了含量不得超過150 μg/L的標(biāo)準[6]。我國由于發(fā)酵食品種類眾多，檢測方法不統(tǒng)一等客觀原因?qū)е庐?dāng)下尚未制定出酒類飲用產(chǎn)品中氨基甲酸乙酯的強制性限量標(biāo)準[7-8]。但隨著國內(nèi)酒行業(yè)快速發(fā)展和消費者的安全健康意識日益提升，酒中氨基甲酸乙酯所引發(fā)的食品安全潛在危害越發(fā)受重視，其強制性限量標(biāo)準的制定勢在必行[9-10]，因此，研究其控制方法及制定限量標(biāo)準將成為白酒風(fēng)險體系研究工作的重點。

根據(jù)研究報道，白酒中的尿素、氨甲酰磷酸、瓜氨酸等前體物質(zhì)能夠與乙醇反應(yīng)生成氨基甲酸乙酯[11-12]，目前國內(nèi)外關(guān)于解決飲料酒中EC問題的研究主要是從減少其來源、工藝條件控制和后續(xù)儲存過程中去除等方面考慮，如構(gòu)建低產(chǎn)尿素酵母[13]、添加酸性脲酶[14]以及采用合成樹脂吸附[15]。但EC的形成途徑多種多樣，不同的存儲環(huán)境對濃香型基酒中氨基甲酸乙酯的含量也有重要影響[16-18]。隨著色譜與質(zhì)譜的聯(lián)用技術(shù)的逐漸成熟，在機理及減控方面的研究成為了重點[19-21]。

本研究選取濃香型酒庫的基酒作為研究對象，探究儲存條件對氨基甲酸乙酯含量的影響以及其形成機制的研究，以期對白酒中氨基甲酸乙酯的含量達到有效減控，促進我國白酒中氨基甲酸乙酯限量標(biāo)準的制定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氨基甲酸乙酯標(biāo)準品（99.50%）：ChemService公司；甲醇、甲酸（色譜純）：安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰荆粚嶒炈玫臐庀慊凭少F州茅臺酒廠（集團）習(xí)酒有限責(zé)任公司提供。所有實驗用水均為超純水（18.2 MΩ·cm-2）。

1.2 儀器與設(shè)備

UltiMate 3000 高效液相色譜儀：美國Dionex公司；配備HESI離子源的Q Exactive Focus高分辨質(zhì)譜儀：美國Thermo Fisher Scientific公司；BPG型精密鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；OEM型電子精密天平：奧豪斯國際貿(mào)易（上海）有限公司；QT-1旋渦混合器：上海琪特分析儀器有限公司；Aquaplore 3S型全智能超純水機：美國艾科浦國際有限公司；SB-25-12DT超聲波清洗機：寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

取樣：按釀造加入糧食的種類差異分為單糧濃香基酒和多糧濃香基酒，單糧濃香基酒取自于濃香酒庫3號房194#壇、219#壇、165#壇、105#壇；多糧濃香基酒取自于濃香酒庫7號房239#壇、197#壇、228#壇。具體分級是由公司專業(yè)嘗評人員認定入庫。

酒樣處理：準確吸取1 mL酒樣于1.5 mL離心管中，置于80 ℃烘箱中去除酒精，取出冷卻后加超純水定容至1 mL，置于旋渦混合器上混勻，用注射器吸取后注入通過0.22 μm水相微孔濾膜過濾到進樣瓶，上機檢測。

1.3.2 標(biāo)準溶液的配制

標(biāo)準儲備液：準確稱取一定量EC標(biāo)準品于100 mL容量瓶中，加水定容后配制成質(zhì)量濃度100 mg/L的標(biāo)準儲備液，并放置于4 ℃冰箱中儲存待用。

標(biāo)準系列溶液：準確量取1 mL標(biāo)準儲備液于100 mL容量瓶中，加水定容后配制成質(zhì)量濃度1 000 μg/L的標(biāo)準中間液，再逐級稀釋至10 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、250 μg/L、500 μg/L的標(biāo)準系列溶液，并放置于4 ℃冰箱中儲存待用。

1.3.3 實驗方法

（1）不同材質(zhì)儲存容器儲存的基酒EC的變化規(guī)律

選取濃香型基酒單糧甲級194#和多糧甲級239#作為實驗樣品，分別取500 mL灌裝于玻璃瓶、不銹鋼瓶和陶制瓷瓶中，置于空調(diào)20 ℃的儲物間的柜子（避光）存儲，每月定期測量，研究不同材質(zhì)儲存容器對基酒中EC含量的影響。

（2）光照對基酒EC的影響

選取濃香型基酒單糧甲級194#和多糧甲級239#作為實驗樣品，分別取500 mL灌裝于玻璃瓶，置于空調(diào)20 ℃的儲物間臺面（見光）和柜子（避光）分別存儲，每月定期測量，研究光照條件對基酒中EC含量的影響。

（3）溫度對基酒EC的影響

選取濃香型基酒單糧甲級194#和多糧甲級239#作為實驗樣品，分別取500 mL灌裝于陶瓷瓶（排除光照干擾）中，分別置于15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃和35 ℃的溫度梯度下，儲存一段時間后進行檢測，以探究溫度對基酒中EC含量的影響。

1.3.4 不同溫度下酒樣的差異比較

通過對存放4 ℃、20 ℃和60 ℃條件下的濃香型基酒單糧甲級194#和多糧甲級239#樣的全掃描，用儀器配帶的Compound Discover軟件對其進行統(tǒng)計分析及差異性比較，初步尋找形成EC的前體物質(zhì)以及演變機制。

1.3.5 基酒存儲的風(fēng)險評估

選取酒庫中的5個陶壇儲存的濃香基酒（多糧甲級197#、多糧乙級228#、單糧甲級219#、單糧乙級165#、單糧丙級105#）在平均室溫為22.6 ℃，平均濕度45%，避光儲存條件下，每月定期跟蹤EC含量，以期完成EC的風(fēng)險評估。

1.3.6 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測方法

（1）色譜條件

流動相：A相為0.1%（V/V）甲酸水溶液，B相為甲醇；色譜柱：Accucore aQ 液相色譜柱（150 mm×2.1 mm，2.6 μm）；柱溫：35 ℃；進樣盤溫度：4 ℃；進樣體積：10 μL；洗脫方式：梯度洗脫，具體程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure

（2）質(zhì)譜條件

離子源：可加熱大氣壓電噴霧電離源，正離子掃描模式；掃描類型：選擇離子監(jiān)測（selected ion monitoring，SIM）模式；掃描范圍：55～95 m/z；分辨率：70 000；自動增益控制目標(biāo)離子數(shù)：1×e6；最大注入時間：5 ms；鞘氣流速：30 arb；輔助氣流速：15 arb；噴霧電壓：2.3 kV；離子傳輸管溫度：350 ℃；S-lens RF level：80；輔助氣加熱溫度：200 ℃。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

使用Origin9.0軟件進行繪圖，使用儀器配帶的Compound Discover分析軟件進行酒樣的差異性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同材質(zhì)儲存容器對基酒EC的影響

以濃香型基酒作為實驗樣品，選用玻璃瓶、不銹鋼瓶和陶制瓷瓶作為儲存容器于20 ℃的條件下存儲，研究不同材質(zhì)儲存容器對基酒中EC含量的影響，結(jié)果如圖1。三種容器存儲的基酒中EC的含量均隨著儲存時間的增加而增加，且在90～120 d增加速度最快；不同的儲存容器，基酒中EC含量的增長速度也有所不同。其中，陶瓷瓶的增長速度較為緩慢，180 d時基酒194#的EC含量增加到74.59 μg/L，約為初始的2.4倍，低于不銹鋼瓶儲存的93.07 μg/L和玻璃瓶儲存的113.68 μg/L；基酒239#中EC含量的變化趨勢與基酒194#一致，表明不同材質(zhì)的儲存容器能夠影響基酒中EC含量的變化[4，22]，并且陶瓷瓶更適合儲存白酒，故建議白酒生產(chǎn)企業(yè)采用陶制容器儲酒。

圖1 儲存材質(zhì)對基酒中氨基甲酸乙酯含量的影響Fig.1 Effect of storage materials on ethyl carbamate contents in base liquor

2.2 光照對基酒EC的影響

選取濃香型基酒作為實驗樣品于玻璃瓶中分別置于避光和見光條件下儲存。儲存溫度為20 ℃的條件下，研究光照對基酒中EC含量的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 光照對基酒中氨基甲酸乙酯含量的影響Fig.2 Effect of light on ethyl carbamate contents in base liquor

結(jié)果表明，在兩種環(huán)境下，前30天基酒中EC含量增長速度較緩慢，30 d后基酒中EC含量急劇增加，120 d后出現(xiàn)平緩趨勢。但在見光條件下EC含量增加速度遠大于避光條件下，與文獻報道一致[23]。因此，建議白酒生產(chǎn)企業(yè)存酒環(huán)境盡量避光。

2.3 溫度對基酒EC的影響

以濃香型單糧甲級194#和多糧甲級239#兩種基酒作為實驗樣品，分別設(shè)置5個溫度梯度（15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃），儲存一個月后進行檢測，以探究溫度對基酒中EC含量的影響，結(jié)果見圖3。無論是單糧基酒還是多糧基酒，在溫度低于20 ℃時，酒中的EC含量增加較為緩慢；超過25 ℃后，兩種基酒的EC含量急劇增加，并且在30 ℃時超過了150 μg/L的食品安全風(fēng)險限，而且隨著溫度越高，EC生成量越多，這與研究報道的當(dāng)儲存溫度超過24 ℃時酒中EC的含量將迅速增加的論述基本吻合[4，24]。此外，通過比較兩個酒樣在15 ℃和35 ℃時的EC含量，可以發(fā)現(xiàn)存在有約7～9倍的差距，表明不同原料釀制的基酒在高溫條件下儲酒都存在EC含量增加的食品安全風(fēng)險。因此，企業(yè)應(yīng)選擇在15～20 ℃范圍內(nèi)存儲，有條件的酒廠可以考慮洞藏或者進行窖藏。

圖3 溫度對基酒中氨基甲酸乙酯含量的影響Fig.3 Effect of temperature on ethyl carbamate contents in base liquor

2.4 不同溫度下酒樣的差異比較

由2.3所知，在一定溫度范圍內(nèi)，基酒中EC的形成與其成正相關(guān)關(guān)系，為進一步證實溫度是導(dǎo)致EC大量形成的重要因素，并初步篩選EC在酒中的前體物質(zhì)，設(shè)置4 ℃、20 ℃和60 ℃三個溫度條件儲存，定期檢測分析EC含量變化情況，結(jié)果見圖4。

如圖4所示，在4 ℃儲存條件下基酒中的EC含量無明顯變化；20 ℃儲存條件下基酒中EC含量增加速度較緩慢，存放到180 d時EC的含量為原來的2～2.5倍；值得注意的是，在60 ℃儲存條件下，基酒中EC的含量在前30天就能增加到較高數(shù)值，后期溫度也是一直在升高。這反映了一定溫度條件下短期內(nèi)能夠使EC前體物質(zhì)完成轉(zhuǎn)化。

圖4 不同時間及溫度對基酒中氨基甲酸乙酯含量的影響Fig.4 Effect of different time and temperature on ethyl carbamate contents in base liquor

此外，對所設(shè)溫度條件下儲存的基酒進行檢測分析，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Compound Discover軟件，進行差異性分析。如圖5所示，每個小方格代表一種物質(zhì)，每一列表示每個樣品所有物質(zhì)的表達量情況，顏色深淺表示物質(zhì)表達量的大小，綠色表示含量低，紅色表示含量高，顏色越深表示含量越低或者越高；上方樹形圖表示不同實驗分組的聚類分析結(jié)果，左側(cè)樹狀圖表示不同物質(zhì)聚類分析結(jié)果。從圖中聚類分組來看，兩個酒樣的上方樹形圖基本一樣，說明實驗分組一致。左側(cè)物質(zhì)聚類分組差異較大，在顏色上也有所區(qū)別，說明不僅三個溫度下物質(zhì)表達存在差異，而且兩個酒樣之間的對比也存在一定差異。

圖5 基酒的熱圖分析Fig.5 Heatmap analysis of base liquor

為了解全掃描物質(zhì)變化差異，選取基酒在高溫（60 ℃）和低溫（4 ℃）兩種條件下檢測數(shù)據(jù)繪制火山圖（圖6），比較它們之間的差異分布情況。每個點代表一個檢測到的差異物質(zhì)，灰色表示該物質(zhì)在4 ℃和60 ℃下無差異，綠色表示物質(zhì)含量發(fā)生了下調(diào)，紅色表示物質(zhì)含量上調(diào)，圓點偏離中心越遠表示差異倍數(shù)越大，越靠近頂部的點表示兩個樣本的物質(zhì)含量變化差異越顯著。通過統(tǒng)計分析，全掃描后的多糧基酒239#的物質(zhì)種類為5 273種，多于單糧的194#的3 342種，這可能是造成單糧酒口感單薄寡淡而多糧酒醇厚豐滿的原因。此外，在P≤0.05，差異倍數(shù)為2時，60 ℃與4 ℃相比，單糧甲級194#基酒有854種物質(zhì)展現(xiàn)出無差異，338種物質(zhì)下調(diào)，2 150種物質(zhì)上調(diào)；多糧甲級239#基酒中有754種物質(zhì)無差異，763種物質(zhì)下調(diào)，3 756種物質(zhì)上調(diào)。此外，P值保持不變，調(diào)整差異倍數(shù)為5時，194#基酒種有98種物質(zhì)下調(diào)，239#基酒中有113種物質(zhì)下調(diào)，通過逐一篩查，兩種酒樣中共同有三種與氨基甲酸乙酯結(jié)果相似的物質(zhì)存在極大的下調(diào)顯著性差異，分別是糠醛、尿素和二環(huán)氧基乙酯。因此，可推測在上調(diào)的物質(zhì)中有一種是氨基甲酸乙酯在發(fā)生顯著變化，而且在下調(diào)的物質(zhì)中存在一種或者多種氨基甲酸乙酯的前體物質(zhì)，這思路對氨基甲酸乙酯的前體物質(zhì)篩查及形成機制的演化提供了參考。

圖6 基酒火山分析圖Fig.6 Volcano plots analysis results of base liquor

2.5 基酒存儲風(fēng)險評估

酒庫被視為白酒企業(yè)的“液體銀行”，是基酒老熟的存儲基地，其環(huán)境條件直接影響酒質(zhì)好壞及酒體特征的變化[25]。經(jīng)研究，儲存容器、光照條件和溫度是影響儲存過程中EC含量的重要因素，陶制容器儲酒于低溫避光條件下儲存有利于EC含量的減控。由于儲酒庫房環(huán)境（陶壇儲酒、避光和室溫）基本與實驗優(yōu)化條件有相似之處，所以選擇了酒庫的5個濃香基酒（多糧2個級別，單糧3個級別）進行EC含量跟蹤，探究其儲存變化規(guī)律，以期完成EC的風(fēng)險評估。濃香型酒庫為陶壇作為儲存容器，平均室溫為22.6 ℃，平均濕度45%，避光儲存。其跟蹤酒中EC含量隨儲存時間的變化情況如圖7所示。

圖7 基酒中氨基甲酸乙酯含量隨儲存時間的變化情況Fig.7 Change of ethyl carbamate contents in base liquor with storage time

結(jié)果表明，5個酒樣在前90 d內(nèi)EC含量變化緩慢，在90～150 d內(nèi)酒樣EC含量迅速增長，隨后出現(xiàn)平緩趨勢。盡管各基酒中EC隨儲存時間的增加，但均未超過加拿大、美國等國家認定的限量標(biāo)準（150 μg/L），因此，酒庫儲酒EC的風(fēng)險較低。

3 結(jié)論

文章探討了儲酒容器、光照和溫度對不同原料制備的濃香型基酒中EC含量的影響并且簡單分析了低含量EC基酒和高含量EC基酒差異性情況。在研究中發(fā)現(xiàn)使用陶瓷瓶的使用、避光和低溫都有利于酒中EC含量的減控；對比三種影響因素，溫度是短期內(nèi)影響酒中EC含量變化最大的主要原因，同時高溫下儲酒具有較高的食品安全風(fēng)險；不同溫度下對基酒初步對比分析為準確篩選EC前體物質(zhì)提供研究思路；在平均室溫為20 ℃左右，平均濕度45%左右，用酒庫用陶壇儲酒能夠?qū)崿F(xiàn)低成本的儲酒要求且儲存風(fēng)險較低。本研究對白酒中EC在不同條件下含量的變化情況的探究，為EC的生成機理及找出前體物質(zhì)提供了參考依據(jù)，為白酒中EC的控制和消除提供了研究方向。