高麗， 楊磊， 李光鵬*

1.包頭師范學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭014030；2.內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，省部共建草原家畜生殖調(diào)控與繁育國家重點實驗室，呼和浩特010030

肌肉生長抑制素（myostatin，MSTN），轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor β，TGFβ）超家族成員，是骨骼肌生長與發(fā)育的負(fù)調(diào)節(jié)因子，在不同物種中具有極強(qiáng)的進(jìn)化保守性。MSTN基因突變通過促進(jìn)肌纖維數(shù)量和肌纖維尺寸的增加導(dǎo)致肌肉肥大。肌肉質(zhì)量是畜牧生產(chǎn)中重要的性狀，具有重要的經(jīng)濟(jì)價值，因此MSTN基因受到了廣泛關(guān)注。

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并通過基因編輯技術(shù)獲得了多種MSTN基因突變動物，包括牛[1-2]、綿羊[3]、狗[4]、豬[5]、山羊[6]和鳥類[7]等。在MSTN基因編輯動物中，僅對MSTN基因序列的小片段堿基進(jìn)行刪除，不會影響其基因的結(jié)構(gòu)完整性和動物基因組結(jié)構(gòu)，卻可以使肌肉出現(xiàn)明顯的過度生長現(xiàn)象。因而，關(guān)于MSTN基因突變導(dǎo)致肌肉過度發(fā)育的作用機(jī)理成為研究熱點。本文將從成肌細(xì)胞增殖、分化、蛋白質(zhì)合成分解代謝、組蛋白修飾以及巨噬細(xì)胞極化等5 個方面對MSTN突變促進(jìn)肌肉發(fā)育的機(jī)理進(jìn)行綜述，以期為農(nóng)業(yè)動物育種新材料生產(chǎn)及重大惡病質(zhì)的治療提供借鑒。

1 MSTN 基因突變通過調(diào)控細(xì)胞周期影響肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖分化

骨骼肌中存在未分化的肌源性前體細(xì)胞——肌衛(wèi)星細(xì)胞（muscle satellite cells，MSCs）[8]，骨骼肌的生長主要依賴于這一類細(xì)胞。在幼年生長時期，MSCs保持增殖狀態(tài)以增加生長的肌纖維中的細(xì)胞核，之后，隨著肌纖維直徑不斷增加，MSCs增殖速度逐漸減慢[9]。到成年時期，MSCs 保持靜止?fàn)顟B(tài)，直到肌肉損傷誘導(dǎo)其活化[10]。研究表明，敲除MSTN會促進(jìn)細(xì)胞增殖，而過表達(dá)MSTN會抑制細(xì)胞增殖和DNA 合成[9]。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，MSTN基因突變可通過調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程，影響MSCs的增殖與分化過程，從而實現(xiàn)對肌肉發(fā)育的調(diào)控。通過RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術(shù)抑制C2C12 細(xì)胞中MSTN基因的表達(dá)，細(xì)胞周期顯著加快，其中，G0/G1期細(xì)胞減少，而S期細(xì)胞增加[11]。在本團(tuán)隊的研究中得到了一致的結(jié)果，MSTN基因被敲除后，G1/S 期細(xì)胞比例減少，S 期和G2 期細(xì)胞增加，這一結(jié)果表明MSTN基因敲除可促進(jìn)DNA 的合成，激發(fā)細(xì)胞增殖[12]。經(jīng)過檢測細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)MSTN基因敲除可以下調(diào)抑制細(xì)胞周期的基因的表達(dá)，而上調(diào)細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）和周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent protein kinase，CDK）的表達(dá)[13]。進(jìn)一步研究其作用機(jī)理發(fā)現(xiàn)，MSTN基因上調(diào)通過增加其下游轉(zhuǎn)錄因子pSMAD3 與CDK 抑制因子p15、p16 和p27 的啟動子結(jié)合，來上調(diào)這些CDK 抑制因子的表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞周期進(jìn)程[14]。同時，MSTN基因會通過 PI3K/AKT/GSK-3β 途徑降解周期蛋白D1，從而使細(xì)胞周期停滯[15]。由此可見，MSTN可通過影響細(xì)胞周期來影響肌肉發(fā)育。

2 MSTN 基因通過調(diào)節(jié)肌肉發(fā)育關(guān)鍵基因調(diào)控肌肉發(fā)育進(jìn)程

在許多物種中，MSTN突變導(dǎo)致的肌肉異常發(fā)達(dá)現(xiàn)象是因MSTN突變而產(chǎn)生的肌纖維數(shù)量增多和體積增加共同作用的結(jié)果[3-4]。肌肉質(zhì)量是動物生產(chǎn)中的重要指標(biāo)，因此，為了制備肌肉發(fā)達(dá)的改良畜牧物種，研究人員在開發(fā)有效策略以阻斷MSTN的表達(dá)方面做了諸多努力與探索[6,16-17]。MSTN基因被激活后，會與其受體ActⅡB結(jié)合，使下游轉(zhuǎn)錄因子SMAD2/3 磷酸化，磷酸化的SMAD2/3 與 SMAD4 形成復(fù)合物[18]，隨后進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)控成肌發(fā)育關(guān)鍵基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制肌肉發(fā)育過程[19]。研究表明，MSTN過表達(dá)會通過下調(diào)肌肉發(fā)育關(guān)鍵基因MyoD和MyoG的mRNA 水平來抑制肌生成過程，從而阻斷成肌分化[20]。相反地，干擾內(nèi)源性MSTN表達(dá)或MSTN突變會促進(jìn)成肌分化過程[21-22]。MSTN基因突變的牛MSCs 成肌分化能力顯著增強(qiáng)，成肌關(guān)鍵因子MyoD、MyoG以及MYF5基因的表達(dá)顯著上調(diào)[21]；在豬中，通過CRISPR/Cas9技術(shù)制備的MSTN基因突變豬，其背最長肌中成肌分化關(guān)鍵基因MyoD、MyoG以及MYF5基因的表達(dá)顯著上調(diào)[22]。這些研究表明，MSTN基因突變改變了成肌關(guān)鍵因子的表達(dá)，從而影響成肌細(xì)胞分化及肌肉發(fā)育進(jìn)程。

3 MSTN 基因通過調(diào)控蛋白質(zhì)合成與降解調(diào)節(jié)肌肉發(fā)育

MSTN缺失導(dǎo)致的肌肉發(fā)達(dá)同樣被認(rèn)為與蛋白質(zhì)合成增加有關(guān)[23]。研究認(rèn)為，MSTN敲除可能會促進(jìn)胰島素樣生長因子1（insulin like growth factor 1，IGF1）與其配體結(jié)合，從而激活PI3K/Akt信號通路，使 Akt 磷酸化；mTOR 是 Akt 下游的一個激酶，會使翻譯因子4E 結(jié)合蛋白1（4E binding protein 1，4E-BP1）和p70 核糖體蛋白S6 激酶（p70 ribosomal protein S6 kinase，p70s6k）磷酸化，從而誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成[24]。在體外培養(yǎng)的肌管中過表達(dá)MSTN基因會降低Akt 磷酸化程度，而抑制MSTN的表達(dá)則會促進(jìn)Akt 磷酸化[25-26]。在小鼠中，MSTN的過表達(dá)同樣會降低Akt 以及其他Akt/mTOR 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)成分（包括TSC2、核糖體蛋白S6和4E-BP1）的磷酸化[27]；而敲除MSTN，則會增加Akt 的磷酸化，促使 S6 和 S6 激酶 S6K 的表達(dá)[25,28]。此外，MSTN基因突變還可通過調(diào)控SMAD的磷酸化，激活A(yù)kt/mTOR 途徑[29]。在培養(yǎng)的日本比目魚肌肉細(xì)胞中，過表達(dá)MSTN基因同樣會導(dǎo)致Akt磷酸化程度降低，并顯著抑制mTOR和Akt/FoxO1信號通路，激活的Akt 誘導(dǎo)激活mTOR 信號通路，導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成增加[30]。同樣地，在本團(tuán)隊前期的研究中，對MSTN基因突變牛骨骼肌進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因顯著富集到了蛋白質(zhì)及其磷酸化信號通路，且同樣富集到了PI3K-Akt 信號通路，表明MSTN敲除通過該信號通路影響蛋白質(zhì)合成及其磷酸化，從而導(dǎo)致肌肉發(fā)達(dá)[12]。

肌肉質(zhì)量是由蛋白質(zhì)合成和蛋白質(zhì)降解共同控制的。肌肉萎縮是蛋白質(zhì)降解增加和蛋白質(zhì)合成減少所致[31]。在蛋白質(zhì)降解過程中，泛素蛋白酶體系統(tǒng)發(fā)揮重要作用[32]。MSTN基因被發(fā)現(xiàn)不僅僅影響蛋白質(zhì)合成，同時對蛋白質(zhì)降解具有重要的調(diào)控作用。研究表明，在日本比目魚肌肉細(xì)胞中過表達(dá)MSTN基因，會顯著上調(diào)泛素蛋白酶水解途徑的基因表達(dá)[30]，表明MSTN基因過表達(dá)會促進(jìn)泛素蛋白水解酶體系對蛋白質(zhì)的降解，從而抑制肌肉發(fā)育。在癌癥引起的惡病質(zhì)肌細(xì)胞中，MSTN基因也被發(fā)現(xiàn)可以通過抑制蛋白質(zhì)合成并激活泛素蛋白酶水解途徑和自噬-溶酶體途徑降解蛋白質(zhì)，對肌肉萎縮起到雙重作用[32-33]。

4 MSTN 基因通過表觀修飾調(diào)控影響肌肉發(fā)育

4.1 表觀修飾與肌肉發(fā)育的關(guān)系

研究表明，表觀修飾（如DNA 甲基化、miRNA、LncRNA以及組蛋白的甲基化和乙?；龋┒紝∪獍l(fā)育起著重要的調(diào)控作用。研究表明，在鴨胚的發(fā)育過程中，溫度會調(diào)控肌肉發(fā)育基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控肌肉發(fā)育過程，而這一作用發(fā)生的機(jī)制就是通過影響肌肉發(fā)育基因的啟動子區(qū)甲基化實現(xiàn)的[34]。面肩肱型肌營養(yǎng)不良癥（facioscapulohumeral muscular dystrophy，F(xiàn)HSD）的發(fā)生是一些重復(fù)的衛(wèi)星序列缺失致使肌肉發(fā)育的關(guān)鍵基因甲基化程度降低，從而導(dǎo)致基因表達(dá)失調(diào)，影響了肌肉發(fā)育過程[35-37]。這些研究均顯示，在肌肉發(fā)育過程中，涉及到一系列肌肉發(fā)育相關(guān)基因的甲基化與去甲基化導(dǎo)致的基因表達(dá)激活和抑制，表明DNA甲基化在肌肉發(fā)育過程中具有重要作用。

在組蛋白甲基化調(diào)控肌肉分化期間，活躍轉(zhuǎn)錄的基因被組蛋白H3 第4 位賴氨酸的三甲基化（histone H3 lysine 4 trimethylation，H3K4me3）標(biāo)記，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)錄的基因被H3K4me2標(biāo)記。組蛋白去乙?；福℉istone deacetylase，HDAC）和SIRT 蛋白失活后，可以激活肌肉分化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，從而啟動肌肉分化程序[38]。研究人員對豬骨骼MSCs 和分化的肌管進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組和染色質(zhì)免疫共沉淀測序（chromatin immunoprecipitation sequencing，ChIP-seq）技術(shù)分析，結(jié)果表明在分化的肌管中肌源性基因表達(dá)顯著上調(diào)，其組蛋白H3K27me3修飾顯著下降，且該修飾同時調(diào)控細(xì)胞增殖基因的表達(dá)[39]。

H3K27me3 可通過其與MyoG基因啟動子的結(jié)合抑制MyoG基因的表達(dá)，從而維持骨骼肌細(xì)胞的增殖。分化前C2C12 細(xì)胞基因組中總體H3K27me3 修飾水平顯著高于分化后細(xì)胞[40]。在小鼠早期胚胎的肌節(jié)中，通過高表達(dá)甲基化酶EZH2 和 H3K27me3 修飾來抑制MyoG基因的表達(dá)，從而抑制成肌細(xì)胞分化而促進(jìn)其增殖[41]；綿羊成肌細(xì)胞中MSTN基因敲除后，甲基化酶EZH2的表達(dá)被上調(diào)，H3K27me3 修飾增強(qiáng)，從而抑制分化，促進(jìn)肌細(xì)胞增殖[42]；在出生前后的綿羊骨骼肌基因組啟動子中，存在大量H3K27me3 修飾抑制基因的轉(zhuǎn)錄[43]。這些結(jié)果表明，H3K27me3修飾參與MSCs 的分化與增殖過程，從而調(diào)控肌肉發(fā)育過程。

4.2 MSTN 基因通過調(diào)控表觀修飾調(diào)節(jié)肌肉發(fā)育進(jìn)程

研究表明，MSTN基因突變對DNA 甲基化修飾具有重要作用[21]。本團(tuán)隊對MSTN突變和野生型牛肌肉組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析，研究發(fā)現(xiàn)富集到的GO 條目主要包括肌肉發(fā)育、成骨分化、細(xì)胞增殖分化與凋亡、蛋白質(zhì)磷酸化以及基因表達(dá)的調(diào)控等[12]。更為重要的是，結(jié)果表明MSTN基因突變會影響DNA 甲基化相關(guān)酶類的表達(dá)。這些結(jié)果提示MSTN基因突變可能通過影響DNA甲基化修飾調(diào)控肌肉發(fā)育過程[12]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，MSTN基因突變后成肌因子發(fā)生了顯著的去甲基化；MSTN基因突變后DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA-methyltransferase，DNMT）表達(dá)下降，去甲基化酶——甲基胞嘧啶雙加氧酶（tet methylcytosine dioxygenase，TET）家族中TET1的表達(dá)顯著上調(diào)，且其上調(diào)程度大于DNMT 的下調(diào)程度[21]。這些結(jié)果表明MSTN基因突變可能通過上調(diào)去甲基化酶TET1的表達(dá)促使成肌因子發(fā)生去甲基化，從而上調(diào)成肌因子的表達(dá)水平。進(jìn)一步通過ChIP 及雙熒光素酶報告試驗證明，MSTN基因下游的轉(zhuǎn)錄因子SMAD2/SMAD3 通過與去甲基化酶TET1 的啟動子結(jié)合而抑制其表達(dá)，從而調(diào)控TET1介導(dǎo)的去甲基化過程；當(dāng)MSTN基因突變后，轉(zhuǎn)錄因子SMAD2/SMAD3對TET1的抑制作用減弱，TET1基因表達(dá)上調(diào)，使成肌因子發(fā)生去甲基化，從而促進(jìn)成肌分化過程（圖1）[12]。

圖1 MSTN基因突變調(diào)控TET1介導(dǎo)的去甲基化作用機(jī)制[12]Fig.1 The possible mechanism of MSTN mutant regulated the TET1 mediated demethylation[12]

關(guān)于MSTN基因與組蛋白修飾之間的關(guān)聯(lián)性也有一些研究，研究人員發(fā)現(xiàn)敲除原代分離的綿羊成肌細(xì)胞中的MSTN基因，會導(dǎo)致H3K27me3的甲基化酶EZH2 的表達(dá)上調(diào)，并促進(jìn)肌細(xì)胞的增殖過程[44]。在C2C12 成肌細(xì)胞向成脂細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過程中，當(dāng)MSTN基因的表達(dá)被敲減后，會通過調(diào)控組蛋白去甲基化酶JMJD3的表達(dá)來調(diào)控成脂基因的表達(dá)，從而調(diào)控成脂轉(zhuǎn)分化過程[45]。上述研究表明，MSTN基因突變可以通過影響表觀修飾調(diào)控肌肉發(fā)育過程。關(guān)于MSTN基因突變與miRNA、LncRNA、組蛋白乙酰化等修飾之間的相互作用尚未見報道，隨著進(jìn)一步的研究可能會發(fā)現(xiàn)更多MSTN基因突變調(diào)控表觀修飾的證據(jù)。

5 MSTN 基因通過影響巨噬細(xì)胞極化促進(jìn)損傷骨骼肌的修復(fù)再生

5.1 巨噬細(xì)胞極化在骨骼肌損傷修復(fù)中的作用

骨骼肌損傷是運(yùn)動醫(yī)學(xué)中最常見的一種損傷，對損傷修復(fù)機(jī)理的研究以及損傷修復(fù)手段的探索是該領(lǐng)域的研究熱點[46]。骨骼肌中存在一類靜止的衛(wèi)星細(xì)胞，當(dāng)骨骼肌受到急性損傷時，這類靜止的衛(wèi)星細(xì)胞便會被激活、增殖、分化，進(jìn)而融合形成肌管，完成損傷肌肉的修復(fù)[47]。近年來研究表明，在骨骼肌損傷修復(fù)過程中，除MSCs 外，巨噬細(xì)胞的極化，即巨噬細(xì)胞對不同表型的獲取[48]同樣發(fā)揮重要作用[49]。在肌纖維損傷和再生過程中，巨噬細(xì)胞存在2 種亞型——具有促炎屬性的M1 型和抗炎屬性的M2 型[50-51]。在骨骼肌損傷后，促炎因子和趨化因子釋放招募骨髓源性單核細(xì)胞進(jìn)入損傷區(qū)域，并成熟為巨噬細(xì)胞，之后，巨噬細(xì)胞極化為M1 型巨噬細(xì)胞，通過一氧化氮體系在肌肉損傷部位促使炎癥加重[52]，同時激活MSCs 使其大量增殖。隨后轉(zhuǎn)換為M2 型巨噬細(xì)胞，消除炎癥并介導(dǎo)組織再生和血管生成，促進(jìn)受損骨骼肌成肌細(xì)胞分化融合，完成損傷修復(fù)[53]。

5.2 MSTN 基因與巨噬細(xì)胞源性因子之間的相互作用

關(guān)于MSTN基因在骨骼肌損傷修復(fù)中與巨噬細(xì)胞之間的相互作用，尚未見報道。但有許多研究已經(jīng)表明，MSTN基因與巨噬細(xì)胞分泌的促進(jìn)肌肉損傷修復(fù)的細(xì)胞因子之間存在重要相互作用。IGF1 是由巨噬細(xì)胞分泌的，是肌肉生長的一個主要的正調(diào)控因子[54]，與MSTN基因之間存在相互作用，在肌肉損傷修復(fù)中發(fā)揮重要功能。在正常條件下，IGF1信號會阻斷MSTN的通路；IGF1與其受體結(jié)合激活PI3K/Akt 信號通路，使Akt 磷酸化，使下游FoxO基因停留在細(xì)胞質(zhì)中并抑制其表達(dá)。而MSTN基因可以通過抑制Akt 的磷酸化提高FoxO的活性，增強(qiáng)肌肉萎縮相關(guān)基因的表達(dá)。因此，IGF-1 與其受體結(jié)合后可以抑制FoxO的活性，抑制肌肉萎縮基因的表達(dá)[55]，從而促進(jìn)肌肉發(fā)育。

在骨骼肌損傷修復(fù)中，炎性細(xì)胞因子發(fā)揮重要作用，且巨噬細(xì)胞是主要的炎性細(xì)胞。如白細(xì)胞介素IL-6 等因子會通過經(jīng)典的NF-κB 以及Notch 信號通路參與骨骼肌損傷修復(fù)。TGF-β 信號通路與Notch 信號通路之間也存在相互作用，激活Notch 信號通路會抑制TGF-β 信號，下調(diào)MSTN的轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致肌肉增加[56]。

除 IGF1 和 Notch 信號通路外，MSTN基因與巨噬細(xì)胞分泌的肝細(xì)胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）之間同樣具有相互調(diào)控作用。HGF 通過調(diào)控MSCs 的增殖、分化、遷移等功能參與骨骼肌再生[57]。HGF 對MSTN基因表達(dá)起負(fù)向調(diào)節(jié)作用，從而正向調(diào)控MSCs的激活[58]。這些研究表明，MSTN基因與巨噬細(xì)胞源性細(xì)胞因子之間具有重要的相互作用，而這些巨噬細(xì)胞源性因子都會通過影響巨噬細(xì)胞M1/M2 極化參與骨骼肌的修復(fù)損傷。上述結(jié)果提示，MSTN基因突變可能通過調(diào)控巨噬細(xì)胞M1/M2 極化來促進(jìn)骨骼肌的損傷修復(fù)。對MSTN基因突變牛肌肉組織的轉(zhuǎn)錄組測序分析發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)基因最顯著富集的GO 條目是“調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)過程”“免疫系統(tǒng)過程”，同時也富集到了“細(xì)胞因子產(chǎn)生的調(diào)節(jié)”“巨噬細(xì)胞激活”等條目；在差異表達(dá)基因中，顯著富集到了巨噬細(xì)胞M1和M2極化相關(guān)的基因[12]。由此可以推測，MSTN基因突變對于巨噬細(xì)胞M1/M2 極化具有重要作用，MSTN基因突變可能通過調(diào)控巨噬細(xì)胞的極化促進(jìn)肌肉發(fā)育，從而在骨骼肌損傷修復(fù)過程中發(fā)揮作用。

6 展望

自然界中存在許多MSTN自然突變導(dǎo)致肌肉肥大的動物[3-4]，MSTN基因在肌肉發(fā)育中起到的重要的調(diào)控作用，使其對于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)甚至疾病治療具有重要意義，基于此，研究人員通過基因編輯技術(shù)制備了許多人工編輯的MSTN動物突變[16-17]。隨著其作用機(jī)理研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)MSTN不僅調(diào)控肌肉發(fā)育，對于脂肪合成代謝[59]、糖代謝[11]以及骨骼發(fā)育[60]等生理過程都具有重要作用。對MSTN基因突變影響肌肉發(fā)育機(jī)理的深入揭示，對于農(nóng)業(yè)動物產(chǎn)肉性能提升及重大疾病治療具有重要的指導(dǎo)意義。通過基因編輯技術(shù)制備的MSTN突變個體，不僅可以用作培育優(yōu)良動物的育種材料，還可以將其作為肌肉萎縮及惡病質(zhì)等疾病的藥物篩選模型，對于治療相關(guān)疾病具有重要作用。未來對于MSTN基因的研究也應(yīng)著重探索MSTN控制肌肉發(fā)育與其他組織代謝通路之間的相互作用，以及MSTN基因引起的肌肉過度發(fā)育與組織微環(huán)境之間的關(guān)系，比如MSTN基因突變對巨噬細(xì)胞的影響等。只有把機(jī)體不同組織之間以及與組織微環(huán)境之間的相互關(guān)聯(lián)研究清楚后，才能夠更好的應(yīng)用于動物生產(chǎn)與臨床實踐中。