常德輝 周 昕,2 孔飛燕,2 丁豪帥,2，王 玲

1.中國人民解放軍聯勤保障部隊第九四〇醫(yī)院泌尿外科（甘肅蘭州 730050）；2.甘肅中醫(yī)藥大學臨床醫(yī)學院（甘肅蘭州 730000）；3.中國人民解放軍聯勤保障部隊第九四〇醫(yī)院生殖醫(yī)學中心（甘肅蘭州 730050）

高原地區(qū)惡劣的氣候環(huán)境會對機體的多個系統造成影響，甚至出現病理損傷，其中低氧是造成機體損傷的主要因素。研究表明高原低氧環(huán)境可造成雄性精子質量的降低和性激素的紊亂，從而影響雄性的生育能力[1]。造成上述損傷的基礎是低氧導致機體處于氧化應激狀態(tài)并引起生殖細胞的凋亡[2]。為了減輕高原環(huán)境對生殖系統造成的損傷，機體會發(fā)生一系列的應答反應。既往的研究多集中在高原環(huán)境對雄性生殖系統造成的損傷，而對于機體的保護應答機制研究較少。

磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B,Akt）在男性生殖發(fā)育和維持睪丸內穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用，激活該通路可促進生殖細胞的增殖[3]。本研究通過建立高原雄性大鼠氧化應激損傷模型，研究PI3K/AKT信號通路在高原環(huán)境下對雄性大鼠生殖系統氧化應激損傷發(fā)揮的作用，為今后高原環(huán)境下雄性生殖系統的防護研究奠定基礎。

材料與方法

一、實驗動物與分組

8周齡SPF級Wistar雄性大鼠30只，許可證號：SCXK（京）2019-0010，購自北京斯貝福生物技術有限公司，體重180~200g。將大鼠隨機分為平原組和高原組，每組15只。平原組飼養(yǎng)于我院動物中心，環(huán)境溫度25℃左右，12h晝夜交替。高原組飼養(yǎng)于我院低壓低氧動物實驗艙內，設置模擬海拔高度為6000m,艙內溫度控制在25℃左右，12h明暗環(huán)境交替，共飼養(yǎng)14d。

二、實驗藥物和試劑

左卡尼汀注射液（東北制藥有限公司）；精子形態(tài)、精子活體染色液（上海索萊寶公司）；血清睪酮T、促卵泡刺激素FSH、促黃體生成素LH試劑盒（上海豐翔生物有限公司）；丙二醛（MDA）試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）檢測試劑盒（南京建成科技有限公司）；PI3K、AKT抗體（北京博奧森生物，批號：bs-0128R、bs-6951R）；RIPA裂解液（北京索萊寶公司，批號：R0010）；BCA蛋白定量試劑盒（北京索萊寶公司，批號：PC0020）；HifairⅡ1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR HifairTM qPCR和Hieff qPCR SYBR Green Master Mix（上海翊生生物，批號：H3001010和H8001160）。

三、實驗主要儀器

模擬高原環(huán)境動物實驗艙（中航工業(yè)貴州風雷航空機械有限責任公司）；光學顯微鏡（日本Olympus公司）；臺式離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；實時定量PCR儀（美國Thermo，型號：StepOne Plus）；酶標儀（美國Bio Rad，型號：iMark）；化學發(fā)光成像儀（北京賽智科技有限公司，型號：MiniChemi610）；37℃恒溫箱（上海一恒科技有限公司）。

四、精子參數

分離大鼠雙側附睪尾，清洗干凈后放置預熱的PBS溶液中剪碎混合20min，過濾后在37℃恒溫箱中靜置3min取上清。參照《WHO人類精液檢查與實驗室處理手冊》在顯微鏡下觀察精子活動率、精子畸形率、精子計數。

五、性激素水平測定

通過腹主動脈采集血液，將血液收集到促凝管中，室溫條件下靜置，待血清凝固后離心取上清，按照試劑盒說明測定大鼠血清睪酮（T）、黃體生成素（LH）、促卵泡生成激素（FSH）水平。

六、HE染色觀察大鼠睪丸形態(tài)

摘除大鼠右側睪丸組織后清洗干凈放置在4%多聚甲醛中固定48h，取出睪丸組織行石蠟包埋，切片，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，分化，氨水反藍后伊紅染色，脫蠟脫水，最后中性樹膠封片觀察。

七、MDA、SOD、GSH-Px的測定

按試劑盒說明書檢測睪丸組織中MDA、SOD、GSH-Px含量。

八、Western blot檢測大鼠睪丸組織中PI3K、AKT蛋白的表達

摘除大鼠左側睪丸組織在液氮中保存，取200mg左右的冷凍標本加入裂解液冰上研磨，研磨充分后離心取上清。蛋白定量試劑盒進行定量。98℃煮沸冰浴使蛋白變性，配制10%分離膠，上樣，電泳和轉膜。5%脫脂奶粉封閉1.5h，孵育一抗4℃過夜，洗膜后加入二抗，再次清洗后曝光顯影。采用Image J對條帶量化分析。

九、熒光定量PCR檢測大鼠睪丸組織中PI3K、AKTmRNA表達水平

從液氮罐中取出冷凍睪丸組織，提取組織中RNA，配 制RNA去DNA反 應 體 系，42℃孵 育2min，4℃放置。在RNase-Free microtube管中配制cDNA合成反應體系在PCR擴增儀上進行反應，PI3K、AKT、GAPDH引物序列見表1，配制PCR反應體系。隨后預變性、變性、退火和延伸。反應結束計算相對表達量2-ΔΔct。

表1 PCR引物序列

十、統計學分析

采用SPSS21.0軟件進行數據分析，對符合正態(tài)分布的定量資料采用兩獨立樣本t檢驗的方法。P＜0.05表示有統計學差異。

結 果

一、高原對雄性大鼠模型精子質量的影響

與平原組相比，高原組大鼠精子計數、活動率均顯著降低（P＜0.01）；畸形率顯著升高（P＜0.01）。

圖1 高原對雄性大鼠模型精子質量的影響

二、高原對雄性大鼠模型血清性激素水平的影響

與平原組相比，高原組大鼠血清促卵泡刺激素FSH、睪酮T顯著降低（P＜0.01），黃體生成素LH無差異（P＞0.05）。

圖2 高原對雄性大鼠模型血清性激素水平的影響

三、HE染色睪丸形態(tài)學的變化

平原組大鼠睪丸組織形態(tài)未見明顯異常。高原組大鼠的睪丸組織形態(tài)可見明顯異常，生精小管基膜受損萎縮變薄并可見明顯空泡，精子數量減少明顯，細胞極性消失，層數減少且排列紊亂。

圖3 HE染色睪丸形態(tài)學的變化

四、大鼠睪丸組織中氧化應激相關指標表達水平

與平原組相比，高原組大鼠睪丸組織中丙二醛（MDA）水平顯著升高（P＜0.05），超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶GSH-Px顯著降低（P＜0.05）。

圖4 大鼠睪丸組織中氧化應激相關指標表達水平

五、Western blot檢測大鼠睪丸組織中PI3K、AKT蛋白的表達

與平原組相比，高原組大鼠睪丸組織中PI3K、AKT表達水平顯著升高（P＜0.01或P＜0.05）。

圖5 Western blot檢測大鼠睪丸組織中PI3K、AKT蛋白的表達

六、熒光定量PCR檢測大鼠睪丸組織中PI3K、AKTmRNA表達水平

與平原組相比，高原組大鼠睪丸組織中PI3K、AKTmRNA水平顯著升高（P＜0.01）

圖6 熒光定量PCR檢測大鼠睪丸組織中PI3K、AKTmRNA表達水平

討 論

高原地區(qū)特殊的自然環(huán)境包括低氧低壓、空氣干燥、晝夜溫差大、日照時間長及紫外線強，國內外多項研究證實這些因素會對雄性生育能力造成不利影響。評價雄性生育能力的兩個重要指標是精子質量和性激素。在本研究中，模擬海拔高度6000m，暴露時間為14d，觀察到同平原組比較，高原組雄性大鼠的精子計數和活動率顯著降低，畸形率明顯升高。

從基礎到臨床的多項研究都已證實高原環(huán)境會導致雄性精子質量下降和性激素紊亂。Gasco[4]等的基礎實驗證實，將大鼠暴露在4340m的高海拔地區(qū)，從第3d起可觀察到生精小管周期的改變，在第7d大鼠附睪中的精子質量顯著減少，第14d睪丸和附睪的重量會下降。由于本研究采用的模擬低壓、低氧艙，高原實地環(huán)境和模擬海拔高度存在一定差異，所以模擬的海拔高度較實地研究的海拔高度略高，而最終結果都顯示高原暴露會對雄性大鼠精液質量造成明顯損傷。He等[5]的臨床研究也證實了這一觀點。高原環(huán)境對精子質量的影響機制可能是以下幾部分原因[5,6,7]：（1）機體缺氧導致腎上腺皮質及睪丸間質細胞受損，睪酮分泌下降，間接影響雌二醇的含量，雌二醇水平下降會降低氣道的反應性從而加重缺氧；（2）缺氧可直接影響精子質量，使性激素結合球蛋白升高，間接降低游離的睪酮水平從而抑制男性的性腺功能；（3）缺氧狀態(tài)下機體的血液進行重新分配，優(yōu)先供給大腦和心臟等重要臟器，導致睪丸處于缺血狀態(tài)造成生精上皮細胞的受損。

黃體生成素（LH）、卵泡刺激素（FSH）和睪酮（T）都是影響男性生殖健康的主要激素，高原環(huán)境對性激素水平影響的研究結果仍存在爭議。本研究結果顯示在大鼠暴露在模擬高原環(huán)境下14d時，血清中FSH、T較平原組顯著降低，LH無顯著變化。高亮[8]等人研究了高原駐訓官兵在高原駐訓1個月后與駐訓前的性激素變化，結果與本研究結果一致。He[5]等人的研究顯示在高海拔暴露6個月時，LH、T水平顯著降低，FSH顯著升高，在暴露12個月時，FSH降低，LH、T升高。研究結果的差異可能是由于暴露的時間長短導致的。高原導致性激素的紊亂可能原因是機體內大部分T是由睪丸間質細胞分泌的，線粒體參與T的合成，急性和慢性低氧時線粒體類固醇脫氫酶活性降低所致[8]。但暴露的時間與血清性激素變化水平規(guī)律還需進一步研究。

通過對大鼠睪丸形態(tài)的直接觀察，結果顯示高原暴露可使大鼠的睪丸組織形態(tài)發(fā)生異常變化，生精小管基膜受損、萎縮、變薄，并可見明顯空泡，精子數量減少明顯，細胞極性消失，層數減少且排列紊亂。這與Gasco[4]等的研究一致。造成睪丸形態(tài)的改變及精液質量的下降的原因是在低氧狀態(tài)下睪丸處于氧化應激的狀態(tài)[2]。高原低氧環(huán)境下機體內活性氧（ROS）會產生增加，引起睪丸中的脂質過氧化，脂質過氧化會產生代謝產物丙二醛（MDA）。睪丸中也存在抗氧化物酶來抵御氧化損傷，其中最主要是過氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）[9]。本次研究發(fā)現，高原組較平原組的MDA水平明顯升高，SOD、GSH-Px水平明顯下降，說明高原低氧狀態(tài)下睪丸處于氧化應激損傷的狀態(tài)，這與Vats[10]等的研究結果相一致，睪丸處于氧化應激狀態(tài)會導致生殖細胞的凋亡增加。

PI3K/Akt信號通路可調節(jié)細胞的存活、增殖、血管生成、葡萄糖代謝等[11]。在睪丸組織中，PI3K/Akt信號通路可以調節(jié)睪丸支持細胞的增值、分化和精子的發(fā)生[12]。本研究結果顯示跟平原組相比，高原組大鼠睪丸組織中，PI3K、Akt蛋白表達水平及mRNA水平明顯升高，說明機體通過激活該通路來減輕高原低氧環(huán)境對睪丸造成的損傷。施源[13]等人研究發(fā)現血必凈可通過激活PI3K/Akt信號通路來減輕睪丸的缺血再灌注損傷。另外，有研究表明某些作用于PI3K/AKT信號通路的藥物可以通過抗凋亡和抗氧化損傷等途徑來減輕高原低氧對腦組織和心肌組織的損傷[14,15]。

綜上所述，高原低氧環(huán)境可對雄性大鼠生殖系統造成損傷，包括精子質量下降、血清性激素的紊亂及睪丸病理結構的改變，造成以上改變的原因主要是睪丸處于氧化應激的狀態(tài)。機體會反應性激活PI3K/Akt信號通路來減輕氧化應激狀態(tài)下睪丸的損傷。本研究結果提示某些作用于PI3K/Akt信號通路的一些抗氧化藥物可能會進一步減輕高原低氧環(huán)境下睪丸的損傷，該研究可為今后高原環(huán)境下男性生殖功能的防護工作提供理論依據。