紀(jì)麗軒 高玉平

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心（上海 200092）

通常認(rèn)為卵母細(xì)胞在成熟分裂促進(jìn)因子(maturation-promoting factor,MPF)和細(xì)胞生長抑制因子(cysostatic factor,CSF)的作用下，發(fā)育并停滯于第二次減數(shù)分裂中期，在精子或某些理化因素的刺激下卵母細(xì)胞才能恢復(fù)并完成減數(shù)分裂，這一過程稱為卵母細(xì)胞激活（oocyte activation,OA）[1]。1990年，Swann等人通過將精子內(nèi)提取物注射入卵母細(xì)胞內(nèi)，并觀察到受精成功的信號——鈣離子振蕩，首次提出關(guān)于“精子因子”的證據(jù)[2]。精源性卵母細(xì)胞激活因子（sperm-borne oocyte activation factor,SOAF）被認(rèn)為是精卵質(zhì)膜融合后，由精子向卵母細(xì)胞質(zhì)內(nèi)釋放的一種或多種可溶性蛋白，可以啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，通過誘導(dǎo)鈣離子振蕩以達(dá)到激活卵母細(xì)胞的目的。目前廣泛接受并唯一已明確的關(guān)鍵SOAF是磷脂酶C-zeta(phospholipase C zeta,PLCζ)[4]，已有多項研究證實，精子內(nèi)PLCζ蛋白的缺乏、位置異常、活性及表達(dá)異常、相關(guān)基因突變與ICSI失敗及男性不育相關(guān)[4]。但其后續(xù)激活鈣離子振蕩和卵母細(xì)胞激活的機制仍未完全闡明；同時，在部分文獻(xiàn)中提出其他可能作為SOAF的候選蛋白，但目前仍存在爭議。本文旨在對SOAF的可能候選蛋白及其相關(guān)作用機制進(jìn)行總結(jié)。

一、卵母細(xì)胞激活與鈣離子振蕩

自20世紀(jì)70年代以來，鈣離子波首先在爪蟾的卵母細(xì)胞中被報道[1]，隨后通過鈣離子敏感的熒光染色技術(shù)已經(jīng)在包括豬，小鼠，牛等哺乳動物和人類的卵母細(xì)胞中分別探測到鈣離子振蕩。然而，鈣離子振蕩模式是具有物種特異性的，不同物種的卵母細(xì)胞內(nèi)鈣離子振蕩波在振幅、持續(xù)時間以及頻率上都存在差異[6-7]。目前在哺乳動物的受精過程中，卵母細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的提高稱為鈣離子誘導(dǎo)鈣釋放過程（Ca+2-induced Ca+2 release，CICR process），目前主要依賴2種鈣離子通道：三磷酸肌醇受體(inosital triphosphate receptors,IP3Rs)和Ryanodine受 體(Ryanodine receptors,RyRs)[1]。IP3Rs和RyRs都是鈣離子依賴的雙向調(diào)節(jié)通道，當(dāng)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度升高，受體失活，鈣離子被驅(qū)動回內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum,ER）內(nèi)儲存，當(dāng)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度回復(fù)到基礎(chǔ)狀態(tài)，則受體又被激活，重新開始驅(qū)動鈣離子從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中釋放。通過鈣離子通道的雙向調(diào)節(jié)，卵母細(xì)胞內(nèi)才會維持長期持續(xù)的，呈周期性循環(huán)往復(fù)的鈣離子振蕩波[6]。雖然目前該機制仍未完全明晰，但由精子穿透進(jìn)入卵母細(xì)胞后會觸發(fā)CICR過程已被廣泛接受。而當(dāng)一個鈣離子瞬變結(jié)束，鈣離子回收進(jìn)入儲存鈣離子的ER則包括一系列分子，包括基質(zhì)相互作用分子1/2(Stromal-interaction molecules，STIM1/2)，Orai 1/2/3以及肌漿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca-ATP酶(Sarcoplasmic Reticulum Calcium ATPase,SERCA)，都在鈣離子穩(wěn)態(tài)中扮演重要角色。鈣離子穩(wěn)態(tài)可允許游離鈣離子重新被儲存到ER內(nèi)，維持卵母細(xì)胞激活中鈣離子振蕩的循環(huán)往復(fù)[21]。鈣離子波的振幅和頻率則攜帶著一些可被探測到的信息，被細(xì)胞內(nèi)的鈣離子感應(yīng)器所編碼，并轉(zhuǎn)換為細(xì)胞應(yīng)答[1]。

第一個對由精子誘導(dǎo)人卵母細(xì)胞內(nèi)鈣離子振蕩的直接研究是在1990年的早期進(jìn)行的。Taylor CT等人[5]發(fā)現(xiàn)添加精子后的20-35分鐘后即會出現(xiàn)鈣離子振蕩，而在受精過程中，從精子中釋放的PLCζ1對于鈣離子振蕩的產(chǎn)生至關(guān)重要，首個鈣離子波的振幅最高，達(dá)2.25uM，隨后的鈣離子波振幅隨時間下降。在不同卵母細(xì)胞內(nèi)鈣離子的頻率是不同的，在去除透明帶的卵母細(xì)胞中，振蕩的間歇是10分鐘，而具有完整透明帶的卵母細(xì)胞間歇是35分鐘，持續(xù)時間約為4-5小時[1]。人工ICSI所誘導(dǎo)的鈣離子振蕩模式與內(nèi)源性鈣離子振蕩相近，但在首個鈣離子瞬變出現(xiàn)時間、鈣離子波頻率等參數(shù)有所不同。在體外人類卵母細(xì)胞激活相關(guān)報道中，第一個鈣離子瞬變出現(xiàn)在ICSI之后的30到90分鐘之間，隨后以平均每小時2.4個鈣離子瞬變的頻率持續(xù)4-5小時[8]。

二、精源性卵母細(xì)胞激活因子

SOAF的首要條件即需觸發(fā)卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)持續(xù)的鈣振蕩，這一機制主要通過調(diào)節(jié)磷酸肌醇信號通路提高細(xì)胞內(nèi)的三磷酸肌醇(1,4,5-trisphosphate，IP3）來實現(xiàn)。其次，SOAF的位置對于其功能來說也至關(guān)重要。精子頭部位于頂體膜下方的區(qū)域稱為核周鞘膜（perinuclear theca，PT），是一個菲薄的凝聚胞質(zhì)蛋白層，可分為結(jié)構(gòu)區(qū)和功能區(qū)。其中功能區(qū)又分為三個部分：頂體下區(qū)、赤道段和頂體后鞘核周囊(postacrosomal sheath-perinuclear Theca，PAS-PT)。SOAF就 容 納 于PAS-PT區(qū)域中，當(dāng)受精開始時，PAS-PT區(qū)域是第一個暴露于卵母細(xì)胞胞質(zhì)的區(qū)域[9]。Kimura Y實驗表明如果將精子細(xì)胞核周除PT外的所有精子質(zhì)膜結(jié)構(gòu)移除，精子則仍然可以保留激活卵母細(xì)胞的能力，進(jìn)一步證實了SOAF位于精子頭部的PT區(qū)[11]。第一個被認(rèn)為是候選的SOAF是振蕩素（oxcillin），但后續(xù)研究中向倉鼠卵母細(xì)胞內(nèi)注射重組振蕩素或其類似物人氨基葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)體均不能誘導(dǎo)激發(fā)鈣離子，故目前認(rèn)為該蛋白并不是一個SOAF[4]。近幾年廣泛的生化和臨床證據(jù)提示主要的SOAF有2個蛋白，即PLCζ和頂體后WW結(jié)構(gòu)域聯(lián)合蛋白(WW domain-binding protein,PAWP)。其他可作為SOAF的候選蛋白也在部分文獻(xiàn)中提出，但是否可明確為SOAF仍存在爭議。

三、PLCζ

PLC蛋白家族在卵母細(xì)胞激活級聯(lián)反應(yīng)中發(fā)揮重要功能，故目前對于PLC蛋白家族的研究是目前關(guān)于卵母細(xì)胞激活的熱點方向[4]。PLC蛋白可以催化磷脂酰肌醇4,5-二磷酸酯(phosphatidylinositol 4,5-biphosphate,PIP2)的水解，生成IP3和二酰甘油(diacylglycerol,DAG），并介導(dǎo)IP3與其受體結(jié)合，釋放ER內(nèi)儲存的鈣離子。細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平的上升激活蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）通路，這一信號可被進(jìn)一步誘導(dǎo)一系列細(xì)胞反應(yīng)[1，4]。目前發(fā)現(xiàn)PLC蛋白家族有13個同工酶[12]。雖然該家族的多種亞型只在睪丸和精子中表達(dá)，但目前僅有證據(jù)表明PLCζ是一種SOAF。發(fā)現(xiàn)于2002年的PLCζ是PLC家族中最小的精子特異性PLC蛋白[4]，由于其分子結(jié)構(gòu)特異性的缺少SH結(jié)構(gòu)域和PH結(jié)構(gòu)域，故只包含608個氨基酸，分子量僅為70kDa[13]。不像其他PLC蛋白，PLCζ對環(huán)境鈣離子濃度十分敏感[4]，這與其結(jié)構(gòu)和功能區(qū)域密切相關(guān)。PLCζ的結(jié)構(gòu)由四個不同可調(diào)控的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成：氮基端有4個串聯(lián)的EF手型結(jié)構(gòu)域（該區(qū)域內(nèi)的EF3區(qū)對高濃度鈣離子敏感，使得PLCζ與其他PLC亞型相區(qū)別）、蛋白中段有一個具有催化功能的核心X、Y結(jié)構(gòu)域（可與PIP2結(jié)合，對于PIP2水解至關(guān)重要）和碳基端的一個C2結(jié)構(gòu)域（可與磷脂膜上的PIP3結(jié)合）[14]。

四、PLCζ誘發(fā)卵母細(xì)胞激活的機制

PLCζ可催化細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的PIP2水解為肌醇1，4，5-三磷酸(IP3)和二酰甘油(DAG)，由此誘發(fā)鈣離子振蕩，啟動卵母細(xì)胞的激活。IP3隨后可與其卵母細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的IP3R受體結(jié)合，釋放內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)儲存的鈣離子。鈣離子振蕩激活卵母細(xì)胞內(nèi)多種蛋白激酶，以一定的時間順序激活受精所必須的下游事件。首先，DAG和被釋放的鈣離子將促進(jìn)PKC的激活，PKC將磷酸化富含丙氨酸的豆蔻?；鞍准っ窩的作用底物蛋白(myristoylated alanine-rich C kinase substrate MARCKS)，這些蛋白負(fù)責(zé)誘導(dǎo)皮質(zhì)顆粒（cortical granule,CG）的胞吐，同時阻斷多精子的進(jìn)入。其次，細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平的增加將激活鈣離子/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶II(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II，CaMKII)，CaMKII將早期有絲分裂抑制劑2(early mitotic inhibitor 2，Emi2)磷酸化。接下來，Emi2將被泛素-配體復(fù)合物降解，不再能抑制細(xì)胞分裂后期促進(jìn)因子/環(huán)小體(anaphase-promoting complex/cyclosome,APC/C)的活性?；罨腁PC/C通過使保全素（securin）和細(xì)胞周期蛋白B1變性，導(dǎo)致卵母細(xì)胞內(nèi)姐妹染色單體分離并解壓縮，以促進(jìn)第二極體排出，并通過將促成熟因子(maturation-promoting factor，MPF)降解使卵母細(xì)胞從第二減數(shù)分裂中釋放出來。MPF由細(xì)胞周期蛋白B(cyclin B，CNB1)和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1(cyclin-dependent kinase 1，CDK1)形成。APC/C可以特異性的靶向介導(dǎo)CNB1的退化。然而，最近有報道提示，為了降低MPF的水平并恢復(fù)細(xì)胞周期的進(jìn)行，APC/C對CNB1的變性和另一個卵母細(xì)胞激酶Wee1樣蛋白激酶2(Wee1-like protein kinase 2，WEE2)對CDK1的抑制都是必要的。最后，鈣離子振蕩可以使Mos/Mitogen激活的蛋白激酶(Mos/mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路失活，導(dǎo)致原核的形成[1,4,13,15]。

盡管有研究表明，在兩種不同的PLCζ相關(guān)基因敲除的小鼠模型中，其精子可產(chǎn)生的子代數(shù)目減少，但這些PLCζ缺乏的精子仍然可以使卵母細(xì)胞受精，誘發(fā)相對減少、但足以激活卵母細(xì)胞的鈣離子振蕩。而因為原核形成延遲和多精受精提高[16-17]，在激活的卵母細(xì)胞中鈣離子振蕩的數(shù)量上升了70%。這些結(jié)果表明，在小鼠體內(nèi)可能有另一個未知的SOAF，可以在缺乏PLCζ的條件下激活卵母細(xì)胞。這種未知的SOAF可以在IVF的過程中成功激活卵母細(xì)胞，但無法在ICSI過程中完成相同事件。未知的SOAF可以彌補PLCζ缺陷患者的一些病理過程，并可能成為藥物制劑的新靶點，需要進(jìn)一步研究。然而，人類精子中這種未知的SOAF尚未得到證實[18-19]。

五、PAWP

頂體后WW結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白(PAWP)，是一種堿性蛋白，具有WW結(jié)合區(qū)域的YGXPPX重復(fù)生物序列和一個N末端GRAM結(jié)構(gòu)域，位于精子頭部的核周基質(zhì)中。2007年，Wu等報道了PAWP在牛、豬、猴和非洲爪蟾蜍卵母細(xì)胞,受精過程中可促進(jìn)減數(shù)分裂恢復(fù)和啟動原核發(fā)育。這一發(fā)現(xiàn)在幾年后得到證實，當(dāng)重組PAWP注入MII期卵母細(xì)胞可觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平增加，而當(dāng)向細(xì)胞內(nèi)注射這種蛋白質(zhì)的競爭性抑制劑，則可阻斷細(xì)胞內(nèi)鈣離子釋放和鈣離子振蕩[20-21]。同樣的實驗也在與人類和公牛的精子中得到驗證[21-22]。此外，PAWP基因敲除小鼠的精子在IVF和ICSI處理后可以誘導(dǎo)卵母細(xì)胞內(nèi)正常的鈣離子振蕩。盡管數(shù)據(jù)顯示PAWP滿足了所有成為SOAF的要求，然而，關(guān)于PAWP表達(dá)與鈣離子振蕩之間的關(guān)系目前仍未得到解釋。一些研究者提出，PAWP的作用是通過其他蛋白質(zhì)介導(dǎo)的，如YES相關(guān)蛋白，它可以激活PLCγ，隨后激活下游的IP3信號通路[21]。Mehlmann等人利用外源生長因子表達(dá)刺激PLCγ途徑，在小鼠卵母細(xì)胞中引發(fā)鈣離子振蕩[23]。然而，PAWP表達(dá)、PLCγ活性與鈣離子振蕩之間的關(guān)系無法證明。此外，由PAWP僅僅能誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高，但細(xì)胞內(nèi)的鈣離子并不能呈現(xiàn)哺乳動物受精后特征性的鈣離子振蕩波。同時，考慮到PLCγ對鈣離子也并不像PLCζ那樣敏感，目前沒有確鑿的證據(jù)表明這種PLC同工酶PLCγ在卵母細(xì)胞活化中起著重要作用[4,24-25]。

六、其他可能的SOAF

目前除PLCζ，PAWP外，還有2個可能的SOAF因子，即非洲爪蟾蜍檸檬酸合酶同源物和被刪除頂端的c-kit酪氨酸蛋白激酶受體(Truncated form of the c-kit tyro-sine kinase receptor,Tr-Kit)，但 目 前 這2種SOAF候選尚在動物模型實驗階段，人類精子相關(guān)實驗仍需進(jìn)一步探究。非洲爪蟾蜍檸檬酸合成酶同源物是一個45kDa的蛋白，作為SOAF它是有爭議的，Harada等人發(fā)現(xiàn)其可以觸發(fā)未受精的蠑螈卵母細(xì)胞內(nèi)的鈣離子振蕩，同時如使用抗檸檬酸合酶抗體處理精子提取物后，其卵母細(xì)胞激活能力下降。目前尚無其在哺乳動物卵母細(xì)胞活化或受精過程中發(fā)揮功能的科學(xué)報道[25]。另一個SOAF候選物質(zhì)為被刪除頂端的c-kit酪氨酸激酶受體（Tr-kit）。雖然這種受體在哺乳動物受精中的作用尚不清楚，但它在精子頭部的赤道區(qū)域表達(dá)，并在高質(zhì)量精子中的頂體反應(yīng)后持續(xù)存在[26-27]。

七、SOAF與卵母細(xì)胞激活失敗

精子與卵母細(xì)胞融合后原核形成，在ICSI中，原核形成失敗被視為受精失敗的標(biāo)志。目前ICSI可達(dá)到的受精率約為70~85%，臨床工作中仍有1~5%會出現(xiàn)完全受精失敗(totally fertilization failure,TFF)或受精率極低的情況發(fā)生[28]。TFF是指一次刺激周期中獲取到的卵母細(xì)胞在ICSI后均無法形成原核，而卵母細(xì)胞激活失敗(oocyte activation deficiency,OAD)是其最主要的原因[1]。精子因素，卵母細(xì)胞因素及人工因素均可引起OAD，而精子相關(guān)OAD則主要與SOAF的異常相關(guān)[13]。精子內(nèi)PLCζ蛋白的缺乏，位置異常，活性、表達(dá)異?；蚧蛲蛔兌寂cICSI失敗或男性不育相關(guān)[4]，負(fù)責(zé)編碼PLCζ的對應(yīng)基因是位于第12號染色體上的PLCZ1基因（ENSG00000139151）,通過對臨床中發(fā)生受精率低下或TFF的男性患者進(jìn)行全外顯子測序(whole exome sequencing,WES)的方式，截止目前為止，已有21個不同的突變基因被報道與受精率低下或TFF相關(guān)，包括EF-X連接區(qū)的1個錯義突變（p.I120M），X催化結(jié)構(gòu)域(p.V189C fs*12；p.C196*；R197H；p.L224P；p.H233L；p.L246F；p.L277P)和Y催化結(jié)構(gòu)域(p.S350P；p.N377del；p.A384V；p.H398P；p.R412fs；p.P420L；p.K448N)共14個 突 變，X-Y連接區(qū)的2個移碼突變(p.T324fs和p.V326K fs*25)和C2結(jié)構(gòu)域的3個無義突變(p.I489F，p.S500L，p.R553P)和位于C端蛋白結(jié)構(gòu)域外的一個無義突變（p.M578T）。所有突變都通過silico分析進(jìn)行評估，大多數(shù)突變也進(jìn)行了功能分析[38-48]，見表1。

表1 PLCZ1突變

文獻(xiàn) cDNA改變 外顯子位點 蛋白質(zhì)改變 結(jié)構(gòu)域位置 突變類型 純合性PLCζ表達(dá)水平及位置Silico分析 功能性分析[31] c.736C>T 7 p.L246F X 無義突變 純合 表達(dá)降低位置改變 損傷 /[29] c.830T>C 7 p.L277P X 無義突變 雙重雜合 表達(dá)降低 損傷 hPLCZ1cRNA注射入人IVM卵母細(xì)胞后OA減弱HEK293T細(xì)胞中表達(dá)截短型蛋白質(zhì)hPLCZ1cRNA注射入人IVM卵母細(xì)胞后OA減弱[28] c.[30] c.972_973delAG 9 p.T324 fs XY連接區(qū) 移碼突變 雙重雜合 / /972_973delAG 9 p.V326K fs*25 XY連接區(qū) 移碼突變 雜合 與對照組無區(qū)別損傷截短型蛋白hPLCZ1cRNA注射入人IVM卵母細(xì)胞后受精率降低減弱[31] c.1048T>C 10 p.S350P Y 無義突變 純合 表達(dá)降低位置改變 損傷 /[29] c.1129_1131deAAT 10 p.N377del Y 移碼突變 雙重雜合 表達(dá)降低 損傷 催化結(jié)構(gòu)域裂解hPLCZ1cRNA注射入人IVM卵母細(xì)胞后OA失敗[29] c.1151C>T 10 p.A384V Y 無義突變 純合 表達(dá)降低 損傷 hPLCZ1cRNA注射入人IVM卵母細(xì)胞后OA失敗[35] c.1193C>A 11 p.H398P Y 無義突變 雙重雜合 表達(dá)降低位置改變 損傷 hPLCZ1cRNA注射入小鼠卵母細(xì)胞后出現(xiàn)改變的鈣離子模式[30] c.1234delA 11 p.R412fs Y 移碼突變 雙重雜合 / /HEK293T細(xì)胞中表達(dá)截短型蛋白質(zhì)hPLCZ1cRNA注射入小鼠卵母細(xì)胞后OA減弱HEK293T細(xì)胞中表達(dá)降低hPLCZ1cRNA注射入小鼠卵母細(xì)胞后OA減弱[29] c.1344A>T 12 p.K448N Y 無義突變 雙重雜合 表達(dá)降低 損傷 hPLCZ1cRNA注射入人IVM卵母細(xì)胞后OA減弱[30] c.1259C>T 11 p.P420L Y 無義突變 雙重雜合 / 損傷mPLCz1和hPLCZ1cRNA注 射入小鼠卵母細(xì)胞后出現(xiàn)改變的鈣離子模式，OA減弱[28,33,37]c.1499C>T 13 p.S500L C2 無義突變 純合/雙重雜合[36] c.1465A>T 13 p.I489F C2 無義突變 純合 PLCζ不表達(dá) 損傷無區(qū)別 損傷 hPLCZ1cRNA注射入人IVM卵母細(xì)胞后受精率未受影響[38] c.1658 G>C 13 p.R553P C2 無義突變 純合 與對照組與對照組無區(qū)別 損傷 hPLCZ1cRNA注射入小鼠卵母細(xì)胞后OA減弱，但與對照組無顯著差別[29] c.1733T>C 14 p.M578T OD 無義突變 雙重雜合 表達(dá)降低 損傷 hPLCZ1cRNA注射入人IVM卵母細(xì)胞后OA失敗

八、展望

目前對于SOAF仍有很大領(lǐng)域有待研究。對于已明確為SOAF的PLCζ，是否有未知的SOAF可以彌補PLCζ的缺陷，而對其相應(yīng)的PLCZ1，基因篩選方式可以聚焦到PLCZ1序列上游的調(diào)控序列及內(nèi)含子區(qū)域或者直接進(jìn)行全基因組測序[13]。對于其他SOAF候選物質(zhì)，PAWP誘發(fā)的鈣離子振蕩以激活卵母細(xì)胞具體分子機制有待明確，非洲爪蟾蜍檸檬酸合酶同源物質(zhì)和Tr-Kit則需要進(jìn)一步在人類精子上進(jìn)行驗證。