戴進(jìn)前，倪慶仁，張韻潔，任婧婧，李光，張曉波，宋艷萍西安市中心醫(yī)院西安市血液病研究所，陜西 西安 710003

白血病是人類造血干細(xì)胞發(fā)生惡性增殖的疾病，臨床上主要表現(xiàn)為髓細(xì)胞白血病、混合細(xì)胞白血病、淋巴細(xì)胞白血病等[1-2]。根據(jù)疾病發(fā)生緩急可分為以早幼粒細(xì)胞為主的急性白血病和以成熟細(xì)胞為主的慢性白血病，而急性髓系白血病是臨床上較為常見、死亡風(fēng)險(xiǎn)較高的一種血液系統(tǒng)惡性腫瘤[3]，給患者身體健康造成嚴(yán)重危害。目前，急性白血病主要通過化療和造血干細(xì)胞移植的方法進(jìn)行治療，然而耐藥現(xiàn)象和移植后排斥反應(yīng)嚴(yán)重影響治療療效[4]。選擇性免疫治療和各種分子靶向治療的發(fā)展逐漸成為白血病治療研究的新方向。微小RNA(miRNA)是一種短鏈非編碼RNA，在白血病中作為抑癌因子或癌基因發(fā)揮作用[5]。miR-424屬于miR-16家族成員，是一種抑癌基因，在多種腫瘤細(xì)胞和組織中低表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和耐藥性有關(guān)，且在白血病患者治療反應(yīng)中起重要作用[6-7]。有研究表明miR-424可促進(jìn)單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系分化為成熟單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，調(diào)控白血病細(xì)胞生長，促進(jìn)細(xì)胞成熟，可以作為治療白血病的潛在分子靶點(diǎn)[8]。本研究通過探索miR-424對(duì)白血病HL-60細(xì)胞增殖、凋亡及阿霉素(doxorubicin，ADM)耐藥性的影響，并探討其可能的作用機(jī)制，旨在為臨床治療提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 試劑 正常人的外周血單核細(xì)胞PBMC(PCS-800-011)購自于美國ATCC細(xì)胞庫；人原髓細(xì)胞白血病細(xì)胞HL-60(貨號(hào)TCHu23)購自于中國科學(xué)院細(xì)胞庫。ADM(貨號(hào)T11090L)購自于美國TargetMol公司；qRT-PCR引物由上海吉瑪生物公司設(shè)計(jì)合成；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)K1622)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)試 劑盒(貨號(hào)11736059)購自于美國Thermo Fisher公司；Trizol(貨號(hào)T9424)購自于美國Sigma公司；熒光素酶活性檢測試劑盒(貨號(hào)E2920)購自于美國Promega公司；熒光素酶報(bào)告載體由上漢恒生物公司提供；LipofectamineTM2000試劑盒(貨號(hào)11668027)購自于美國Invitrogen公司；兔抗人單克隆絲裂原活化蛋白激酶激酶1(mitogen-activated protein kinase kinase 1，MEK1)抗體(貨號(hào)ab32091)、兔抗人多克隆Ki67抗體(貨號(hào)ab15580)、兔抗人多克隆Bcl-2抗體、兔抗人多克隆Bax抗體(貨號(hào)ab32503)、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(貨號(hào)：ab205718)均購自于英國Abcam公司。CCK8細(xì)胞增殖試劑盒(貨號(hào)C0037)、Annex V-FITC凋亡試劑盒(貨號(hào)C1062)、RIPA裂解液(貨號(hào)P0013)、BCA蛋白檢測試劑盒(貨號(hào)P0012)購自于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器 酶標(biāo)儀(型號(hào)SpectraMax iD3)購自于美國Molecular Devices公司；流式細(xì)胞儀(型號(hào)BD FACSCantoⅡ)購自于美國Becton-Dickinson公司，電泳儀(型號(hào)1658001)購自于美國Bio-Rad公司，CO2培養(yǎng)箱(型號(hào)CB53)購自于德國Binder公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(型號(hào)ABI 7500)購自于美國ABI公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 正常人的外周血單核細(xì)胞PBMC、白血病細(xì)胞HL-60分別以RPMI-1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清和1%青鏈霉素)置于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 d換液一次，0.25%的胰蛋白酶消化離心傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于以下實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 轉(zhuǎn)染及分組 收集1.3.1中細(xì)胞PBMC、HL-60以密度為4×105個(gè)/孔、每孔2 mL接種于6孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至70%時(shí)，按照LipofectamineTM2000試劑盒說明書，將miR-424 NC、miR-424 mimic分別轉(zhuǎn)染至HL-60細(xì)胞中，每組8個(gè)復(fù)孔，將細(xì)胞HL-30分為NC組、miR-424 mimic組，分別以僅添加新鮮培養(yǎng)液的HL-60細(xì)胞和PBMC細(xì)胞作為空白對(duì)照組和正常對(duì)照組。

1.3.3 qRT-PCR檢測白血病HL-60細(xì)胞中miR-424、MEK1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平 轉(zhuǎn)染48 h后，收集1.3.2中PBMC及各組HL-60細(xì)胞，用Trizol法提取總RNA，根據(jù)引物合成軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物(序列如表1所示)，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)RNA合成cDNA，按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒說明書配20μL反應(yīng)體系并進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性15 min，95℃變性10 s、56℃退火20 s、72℃延伸50 s，40個(gè)循環(huán)，以U6、GAPDH為對(duì)照，采用2-△△Ct法分析miR-424和MEK1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.4 CCK8檢測白血病HL-60細(xì)胞增殖 收集1.3.2中各組HL-60細(xì)胞，并以密度2×104/孔每孔200μL，鋪于96孔板，分別在轉(zhuǎn)染24 h、48 h、72 h后加入CCK8試劑，按照CCK8試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測450 nm波長下各孔細(xì)胞吸光度值(OD)值，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析各組細(xì)胞的增殖情況。細(xì)胞相對(duì)增殖率=(轉(zhuǎn)染組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。

1.3.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測白血病HL-60細(xì)胞凋亡 收集1.3.2中各組HL-60細(xì)胞，按照Annex V-FITC凋亡試劑盒方法在流式細(xì)胞儀上檢測每組細(xì)胞的凋亡率。

1.3.6 CCK8檢測HL-60細(xì)胞對(duì)ADM的敏感性 收集1.3.2中各組細(xì)胞，每組分別加入含終濃度為0、0.08μmol/L、0.16μmol/L、0.64μmol/L ADM的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后按照CCK8試劑盒說明書檢測各組細(xì)胞各孔細(xì)胞OD值，計(jì)算分析各組半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.3.7 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測白血病HL-60細(xì)胞與MEK1的靶向關(guān)系 分別構(gòu)建含有野生型MEK1的野生型和突變型3'-UTR序列的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒(MEK1-Wt和MEK1-Mut)。收集白血病HL-60細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105/孔，接種于24孔板中，miR-424 mimic或NC分別與MEK1-Wt質(zhì)粒和MEK1-Mut質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染至白血病HL-60細(xì)胞，每組8個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。按照熒光素酶活性檢測試劑盒操作說明對(duì)熒光素酶活性測定。

1.3.8 Western blot檢測白血病HL-60細(xì)胞中MEK1、Ki67、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá) 收集1.3.2中各組HL-60細(xì)胞，PBS清洗，加入含PMSF的RIPA裂解液在冰水浴中處理，提取蛋白，BCA法測定各組蛋白的濃度，按照4∶1在蛋白中加5×的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，沸水浴加熱3～5 min，放于-20℃保存。按照SDS-PAGE凝膠配方表制備10%分離膠和5%濃縮膠，以每泳道30μg蛋白上樣，蛋白凝膠電泳，根據(jù)蛋白Marker切膠，轉(zhuǎn)膜，對(duì)抗體MEK1、Ki67、Bcl-2、Bax均按照1∶500的比例稀釋后4℃孵育過夜，放搖床1.5 h，TBST清洗，加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育并放搖床2 h，TBST清洗后，參考ECL發(fā)光液說明書對(duì)條帶孵育、曝光、顯影。Image J軟件對(duì)條帶灰度值進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS23.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x-±s)表示，多組計(jì)量數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞中miR-424、MEK1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較 與正常對(duì)照組相比，空白對(duì)照組、NC組HL-60細(xì)胞中miR-424相對(duì)表達(dá)水平顯著降低，MEK1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與空白對(duì)照組、NC組相比，miR-424 mimic組HL-60細(xì)胞中miR-424相對(duì)表達(dá)水平顯著升高，MEK1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。

表2 各組細(xì)胞中miR-424、MEK1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平(±s，n=8)

表2 各組細(xì)胞中miR-424、MEK1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平(±s，n=8)

注：與正常對(duì)照組比，a P＜0.05；與空白對(duì)照組比，b P＜0.05；與NC組相比，c P＜0.05。

組別正常對(duì)照組空白對(duì)照組NC組miR-424 mimic組F值P值miR-424/U6 1.01±0.15 0.46±0.13a 0.45±0.14a 1.09±0.16bc 45.046＜0.05 MEK1/GAPDH 1.03±0.23 1.72±0.32a 1.70±0.28a 1.25±0.25bc 12.579＜0.05

2.2 過表達(dá)miR-424對(duì)白血病HL-60細(xì)胞增殖能力影響 與空白對(duì)照組、NC組相比，同一時(shí)間miR-424 mimic組白血病HL-60細(xì)胞相對(duì)增殖率顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表3。

表3 miR-424過表達(dá)對(duì)白血病HL-60細(xì)胞相對(duì)增殖率的影響(±s，n=8)

表3 miR-424過表達(dá)對(duì)白血病HL-60細(xì)胞相對(duì)增殖率的影響(±s，n=8)

注：與空白對(duì)照組比較，a P＜0.05；與NC組相比較，b P＜0.05。

組別空白對(duì)照組NC組miR-424 mimic組F值P值24 h 99.98±13.31 98.32±12.85 55.18±12.01ab 31.825＜0.05 72 h 101.64±14.86 99.78±13.05 50.24±12.03ab 38.068＜0.05 48 h 100.12±13.01 98.99±12.78 52.19±11.01ab 39.566＜0.05相對(duì)增殖率(%)

2.3 過表達(dá)miR-424對(duì)白血病HL-60細(xì)胞凋亡能力影響 與空白對(duì)照組、NC組相比，轉(zhuǎn)染48 h后miR-424 mimic組白血病HL-60細(xì)胞凋亡率顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表4。

表4 miR-424過表達(dá)對(duì)白血病HL-60細(xì)胞凋亡的影響(±s，n=8)

表4 miR-424過表達(dá)對(duì)白血病HL-60細(xì)胞凋亡的影響(±s，n=8)

注：與空白對(duì)照組比較，a P＜0.05；與NC組相比較，b P＜0.05。

組別空白對(duì)照組NC組miR-424 mimic組F值P值凋亡率(%)12.21±3.26 13.76±4.29 51.10±5.56ab 194.118＜0.05

2.4 過表達(dá)miR-424對(duì)白血病HL-60對(duì)ADM的敏感性 用藥48 h后，在相同藥物濃度下，與空白對(duì)照組組、NC組相比，miR-424 mimic組HL-60細(xì)胞IC50值顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表5。

2.5 miR-424對(duì)白血病HL-60細(xì)胞中MEK1、Ki67、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組、NC組相比，miR-424 mimic組HL-60細(xì)胞MEK1、Ki67、Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)水平均顯著降低，Bax蛋白相對(duì)表達(dá)水平均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖1、表6。

表5 miR-424過表達(dá)對(duì)白血病HL-60細(xì)胞對(duì)ADM敏感性比較(±s，n=8)

表5 miR-424過表達(dá)對(duì)白血病HL-60細(xì)胞對(duì)ADM敏感性比較(±s，n=8)

注：與空白對(duì)照組比較，a P＜0.05；與NC組相比較，b P＜0.05。

組別空白對(duì)照組NC組miR-424 mimic組F值P值IC50(μmol/L)0.46±0.05 0.44±0.06 0.20±0.05ab 58.419＜0.05

圖1 各組HL-60細(xì)胞中MEK1、Ki67、Bcl-2、Bax蛋白免疫印跡圖

表6 各組HL-60細(xì)胞中MEK1、Ki67、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)比較(±s，n=8)

表6 各組HL-60細(xì)胞中MEK1、Ki67、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)比較(±s，n=8)

注：與空白對(duì)照組比較，a P＜0.05；與NC組比較，b P＜0.05。

組別空白對(duì)照組NC組miR-424 mimic組F值P值MEK1 0.88±0.11 0.89±0.13 0.30±0.10ab 70.215＜0.05 Ki67 0.77±0.08 0.80±0.09 0.29±0.07ab 101.320＜0.05 Bcl-2 0.73±0.06 0.76±0.07 0.35±0.06ab 103.603＜0.05 Bax 0.21±0.06 0.19±0.05 0.72±0.08ab 173.248＜0.05

2.6 miR-424與MEK1的靶標(biāo)關(guān)系 如圖2所示，microrna.org數(shù)據(jù)庫預(yù)測MEK13'-UTR與miR-424存在結(jié)合位點(diǎn)。與miR-424 NC+WT-MEK1 3'-UTR組比較，miR-424 mimic+WT-MEK1 3'-UTR組熒光素酶相對(duì)活性顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；miR-424 NC+MUT-MEK13'-UTR組、miR-424 mimic+MUT-MEK1 3'-UTR組熒光素酶相對(duì)活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表7。

圖2 microrna.org數(shù)據(jù)庫預(yù)測MEK1基因靶向圖

表7 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-424與MEK1靶向關(guān)系(±s，n=8)

表7 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-424與MEK1靶向關(guān)系(±s，n=8)

注：與miR-424 NC+WT-MEK1 3'-UTR組比較，a P＜0.05。

組別miR-424 NC+WT-MEK1 3'-UTR組miR-424 mimic+WT-MEK1 3'-UTR組miR-424 NC+MUT-MEK1 3'-UTR組miR-424 mimic+MUT-MEK1 3'-UTR組F值P值熒光素酶的相對(duì)活性2.47±0.22 1.69±0.13a 2.44±0.33 2.40±0.29 15.792＜0.05

3 討論

白血病是由造血干細(xì)胞惡性克隆而引發(fā)的一種疾病，具有無限增殖、凋亡受阻、分化障礙等特點(diǎn)，造血干細(xì)胞在骨髓或其他造血組織中大量堆積，可以抑制造血功能，急性髓系白血病是臨床多發(fā)性白血病，約占成人白血病的70%[9]，目前，通過手術(shù)和傳統(tǒng)的化療藥(如ADM)在白血病中的治療已難以達(dá)到預(yù)期的效果，隨著生物分子學(xué)的發(fā)展，miRNA在白血病中的作用已成為近年來研究熱點(diǎn)。

miR-424是一種抑癌基因，對(duì)細(xì)胞周期和凋亡具有調(diào)控作用，與血液惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)。如KHARE等[10]研究發(fā)現(xiàn)彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤患者血漿中miR-424的表達(dá)顯著低于健康對(duì)照組。HERSHKOVITZ-ROKAH等[11]研究發(fā)現(xiàn)miR-424在慢性髓系白血病患者細(xì)胞系和血液中的表達(dá)均顯著低于正常人，且miR-424過表達(dá)能夠抑制人類髓系白血病細(xì)胞K562的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡和對(duì)藥物敏感。本研究發(fā)現(xiàn)，白血病細(xì)胞HL-60中miR-424表達(dá)顯著低于PBMC細(xì)胞，提示miR-424可能與白血病發(fā)生有關(guān)。因此本研究通過體外培養(yǎng)白血病HL-60細(xì)胞系，探討過表達(dá)miR-424對(duì)HL-60增殖、凋亡及耐藥性的影響。

細(xì)胞增殖是細(xì)胞生命活動(dòng)的基礎(chǔ)，而腫瘤細(xì)胞是一種細(xì)胞周期失控、可無限增殖的細(xì)胞[12]。已有研究表明，Ki67在細(xì)胞間期和有絲分裂期都有重要作用，在無限增殖的細(xì)胞中高度表達(dá)，Ki67作為細(xì)胞的增殖標(biāo)志物已經(jīng)被廣泛應(yīng)用[13]。細(xì)胞凋亡和增殖處于動(dòng)態(tài)平衡，抗凋亡基因Bcl-2過表達(dá)可使細(xì)胞凋亡過程受阻，而促凋亡基因Bax則可拮抗Bcl-2的生物學(xué)過程從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-424 mimic組HL-60細(xì)胞增殖率、Ki67蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著低于空白對(duì)照組，提示miR-424過表達(dá)可抑制HL-60細(xì)胞增殖。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-424 mimic組HL-60細(xì)胞增殖率、蛋白KI67、Bcl-2表達(dá)顯著低于空白對(duì)照組，細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著高于空白對(duì)照組，提示miR-424過表達(dá)可抑制細(xì)胞HL-60的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。機(jī)體的耐藥性與細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性有關(guān)，阿霉素是臨床治療白血病的一線藥物，而白血病細(xì)胞對(duì)該藥物產(chǎn)生耐藥性成為影響白血病化療失敗的重要因素[15]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA不僅參與癌癥細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生理過程，而且miRNA失調(diào)還影響癌細(xì)胞的耐藥性[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-424 mimic組白血病HL-60細(xì)胞IC50值顯著低于空白對(duì)照組，提示miR-424過表達(dá)促使HL-60細(xì)胞對(duì)ADM的敏感性增加，耐藥性降低。

MEK1是絲裂原活化蛋白激酶家族重要成員，又稱MAP2K1，在細(xì)胞增殖和凋亡中發(fā)揮作用[17]。有研究發(fā)現(xiàn)miR-16通過靶向抑制MEK1激酶1(MEK1)調(diào)節(jié)ERK/MEK1信號(hào)途徑抑制肺癌細(xì)胞的增殖和侵襲[18]。此外，WANG等[19]研究發(fā)現(xiàn)miR-181a可靶向MAP2K1調(diào)節(jié)ERK/MAPK信號(hào)途徑抑制白血病細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，降低白血病細(xì)胞對(duì)ADM的耐藥性。本研究發(fā)現(xiàn)，與PBMC細(xì)胞相比，白血病HL-60細(xì)胞中MEK1的相對(duì)表達(dá)水平顯著升高，提示MEK1可能與白血病的發(fā)生有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-424能夠抑制HL-60細(xì)胞中MEK1的表達(dá)。miRNA通過與其下游靶基因3'-UTR區(qū)結(jié)合調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。進(jìn)一步采用TargetScan、microRNA.org、miRGene數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-424靶基因，發(fā)現(xiàn)miR-424與MEK1存在結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)一步采用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，WT-miR-424 mimic+MEK1 3'-UTR組的熒光素酶相對(duì)活性低于WT-miR-424 NC+MEK1 3'-UTR組，提示miR-424能夠靶向MEK1，調(diào)控其表達(dá)，兩者可能共同影響HL-60的發(fā)生及耐藥性，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，上調(diào)miR-424可能通過靶向抑制MEK1表達(dá)，抑制白血病細(xì)胞HL-60的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，逆轉(zhuǎn)細(xì)胞對(duì)阿霉素的耐藥性，為白血病的靶向治療提供新思路。本研究的不足之處在于沒有用敲除或低表達(dá)miR-424的方法以驗(yàn)證沉默miR-424對(duì)HL-60細(xì)胞生物學(xué)活性及耐藥性的調(diào)節(jié)是否能發(fā)生逆轉(zhuǎn)，從而進(jìn)一步確認(rèn)miR-424調(diào)節(jié)白血病發(fā)生發(fā)展的作用。