蔣勵，許耀，王世龍，湯超亮，陳文鈞

復旦大學附屬華山醫(yī)院骨科，上海 200040

骨折是骨科及手足外科等創(chuàng)傷修復科室常見疾病，多由于損傷部位多樣、成因復雜及累計人群廣泛等原因給患者和家庭帶來經濟負擔和身心障礙。盡管骨的愈合能力較強，但仍有10%的骨折愈合會受到神經營養(yǎng)和感染等因素引起的骨壞死、骨缺損、骨髓炎等并發(fā)癥的影響[1]。因而探索成骨調節(jié)機制及骨組織形成的生理過程可為臨床骨折的治療提供新的靶點及策略。

成骨分化涉及生長因子、信號通路及調控基因等多種因素，多種信號通路的共同影響可介導和調控骨髓間充質干細胞的分化[2]。隨著基因測序技術的研究開展，有研究發(fā)現長鏈非編碼RNA H19(long non coding RNA H19，LncRNA-H19)可參與成骨組織的細胞增殖、分化和調節(jié)活性的過程，亦有文獻提示萎縮性骨不連組織的miR-654-5p的表達與正常骨痂組織顯著上調，提示與成骨分化具有密切聯(lián)系[3-4]。本研究通過觀察LncRNA-H19靶向miR-654-5p對人骨髓間充質干細胞成骨分化的促進效應，以探討其在成骨分化中的分子生物學機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取20只SPF級5～6周齡近交系BALB/c小鼠，雌雄各半，體質量18～25 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可：SCXK(京)2016-0011。適應性喂養(yǎng)1周，光暗周期12 h，室溫20℃～24℃，濕度45%～50%，自由攝食及飲水。

1.2 實驗方法

1.2.1 骨髓間充質干細胞分離及培養(yǎng) (1)分離：小鼠頸椎脫臼處死，手術剪分離小鼠皮膚和肌肉，暴露脛骨和股骨并取下置于含磷酸鹽緩沖液(PBS)的培養(yǎng)皿中沖洗3次；另取培養(yǎng)皿加入青鏈霉素雙抗(1%)及FBS(10%)DMEM培養(yǎng)基，無菌剪剪斷小鼠脛骨和股骨暴露骨髓腔，1 mL無菌注射器吸取培養(yǎng)皿反復沖洗，直至流出液體為清亮、發(fā)白的骨顏色；移液器將含小鼠骨髓液的培養(yǎng)皿轉至15 mL離心管中，無菌網過濾后1 000 r/min進行5 min離心；棄去上清液后加入DMEM培養(yǎng)基，接種于培養(yǎng)瓶中于細胞培養(yǎng)箱(37℃、CO25%)培養(yǎng)，每隔2 d換培養(yǎng)基一次。(2)培養(yǎng)：顯微鏡觀察培養(yǎng)瓶中細胞，出現80%的融合時即可進行傳代操作；移液器取出原有培養(yǎng)液后加入1 mL含EDTA(0.02%)的胰蛋白酶(0.25%)至培養(yǎng)瓶中，蓋好瓶蓋后置于細胞培養(yǎng)箱(37℃、CO25%)消化2 min并觀察消化過程直至細胞脫離瓶底，移液器吹打液體變成單個細胞后進行1 000 r/min進行5 min離心并棄去上清液，細胞液移至新的培養(yǎng)瓶中進行1∶2比例傳代，再加入5 mL培養(yǎng)基后重新放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 分組 將骨髓間充質干細胞隨機分為陰性對照組、LncRNA-H19轉染組和LncRNA-H19抑制組，LncRNA-H19轉染組轉染LncRNA-H19慢病毒載體、LncRNA-H19沉默質粒。

1.2.3 MTT法檢測 取第3、5、7代對數生長期的mBMSCs細胞進行MTT試驗，胰蛋白酶消化后制成懸液，細胞計數后5×103/孔加入96孔板中，放回細胞培養(yǎng)箱；第2天每孔加入20μL MTT溶液，4 h的37℃孵育，吸除孔內上清液，加入100μL DMSO后10 min震蕩，酶標儀檢測490 nm波長的各孔吸光度值，分光光度計測量OD值。

1.2.4 ALP活性測定 取第3～5代對數生長期的mBMSCs細胞進行ALP活性測定，1 000 r/min進行5 min離心后取0.5 mL上清液使用全自動生化分析儀測定ALP活性。

1.2.5 熒光素報告基因實驗[5]取第3～5代對數生長期的mBMSCs細胞接種于24孔板中，每孔6×104個細胞，置于細胞培養(yǎng)箱(37℃、CO2、5%)過夜培養(yǎng)；配置miRNA轉染的混合液后每孔加入500μL的無雙抗血清的Opti-MEM減血清培養(yǎng)基，均勻加入Mimics轉染混合液，置于24孔板中細胞培養(yǎng)箱(37℃、CO2、5%)過夜培養(yǎng)；每孔轉入載體質粒200 ng后室溫孵育20 min，每孔加入500μL的無雙抗血清的Opti-MEM減血清培養(yǎng)基后均勻加入熒光素酶載體混合液；24孔板培養(yǎng)液棄除后加入α-MEM培養(yǎng)基進行24 h培養(yǎng)；24孔板培養(yǎng)液棄除后每孔加入裂解液將細胞裂解；每孔混合液轉移至1.5 mL棕色瓶中，轉移至96孔板中，每組設3個復孔，酶標儀檢測吸光度。

1.2.6 Western blot檢測 提取細胞總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，取20μg蛋白經SDS×緩沖液上樣混合變性后進行SDS-PAGE膠電泳并切膠、轉膜；TBST溶液室溫2 h封閉，封閉液棄去，加入大鼠抗人磷酸化BMP-2、OCN蛋白多克隆抗體作為一抗4℃孵育過夜；洗膜后；辣根過氧化物酶標記羊抗大鼠IgG二抗孵育后洗膜進行顯色反應，曝光后顯影；β-actin為內對照。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS22.0統(tǒng)計軟件分析數據，計量資料符合正態(tài)分布，以均數±標準差(±s)表示，多組間比較采用F檢驗，兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞增殖情況 陰性對照組、LncRNA-H19轉染組和LncRNA-H19抑制組細胞培養(yǎng)0 h、24 h、48 h及72 h時OD值比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表1。

2.2 各組ALP活性測定比較 LncRNA-H19轉染組ALP活性值明顯高于陰性對照組和LncRNA-H19抑制組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；LncRNA-H19抑制組ALP活性值明顯低于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表2。

表1 各組細胞不同培養(yǎng)時間OD值比較(±s)

表1 各組細胞不同培養(yǎng)時間OD值比較(±s)

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注：與陰性對照組比較，a P＜0.05；與LncRNA-H19轉染組比較，b P＜0.05。

2.3 LncRNA-H19對miR-654-5p-3'UTR序列的靶向作用 LncRNA-H19轉染組miR-654-5p-3'UTR調節(jié)的熒光素酶活性明顯低于陰性對照組和LncRNA-H19抑制組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；LncRNA-H19抑制組miR-654-5p-3'UTR調節(jié)的熒光素酶活性明顯高于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；各組miR-654-5p-突變型3'UTR調節(jié)的熒光素酶活性比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表3。

2.4 各組蛋白相對表達量比較 LncRNA-H19轉染組BMP-2、OCN蛋白相對量明顯高于陰性對照組和LncRNA-H19抑制組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；LncRNA-H19抑制組BMP-2、OCN蛋白相對量明顯低于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表4和圖1。

表3 LncRNA-H19對miR-654-5p-3’UTR序列的靶向作用(±s)

表3 LncRNA-H19對miR-654-5p-3’UTR序列的靶向作用(±s)

注：與陰性對照組比較，a P＜0.05；與LncRNA-H19轉染組比較，b P＜0.05。

組別陰性對照組LncRNA-H19轉染組LncRNA-H19抑制組F值P值miR-654-5p-3'UTR熒光素酶活性1.010±0.100 0.612±0.099a 1.453±0.102ab 15.583 0.001 miR-654-5p-突變型3'UTR熒光素酶活性1.004±0.091 1.010±0.082 1.005±0.090 0.544 0.801

3 討論

干細胞再生醫(yī)學及骨組織工程領域內骨髓間充質干細胞具備良好的增殖能力和多潛能分化能力，在組織損傷修復領域具有很大的潛力，可在一定條件下誘導成骨分化，從而促進形成新生骨組織，近年來已逐漸被應用于重建組織或器官的功能或促進組織器官的再生及加快創(chuàng)傷的愈合，但相關機制尚未完全明晰[6-9]。

作為最早被鑒定的lncRNA分子，H19參與哺乳動物各組織細胞周期、生長、分化的調控，對許多靶基因也發(fā)揮著重要的調節(jié)作用，相關文獻提示Lnc RNA H19可促進小鼠骨髓間充質干細胞向成骨方向分化，并抑制成脂過程，但介導的相關通路和相關機制尚不明確[10-12]。本研究通過各代細胞進行MMT法檢測細胞增殖能力發(fā)現陰性對照組、LncRNA-H19轉染組和LncRNA-H19抑制組細胞培養(yǎng)0 h、24 h、48 h及72 h時OD值比較差異無統(tǒng)計學意義，因此為確保實驗效率和增殖活力，本研究取第3～5代培養(yǎng)對數生長期的mBMSCs細胞進行了下一步研究。

骨源性堿性磷酸酶已被證實是反映骨代謝情況的最重要指標之一，其由成骨細胞合成，人體血鈣下降及甲狀旁腺功能上升后可使成骨細胞向活性狀態(tài)轉變，進而促進骨源性堿性磷酸酶釋放入血[13-14]。本研究結果顯示LncRNA-H19轉染組ALP活性值明顯高于陰性對照組和LncRNA-H19抑制組；LncRNA-H19抑制組ALP活性值明顯低于陰性對照組。上述結果提示LncRNA-H19具有促進成骨細胞活化的作用，進而促進ALP的分泌和活性的提高。

已有文獻提示lncRNAs通過與miRNAs相互結合來阻斷miRNA對靶基因的調控，從而影響下游靶基因的表達[15]。動物實驗研究發(fā)現miR-654-5p的高表達可增加骨質疏松癥的患病風險，同時發(fā)現miR-654-5p在成骨或成脂分化的表達有明顯差異[16]。上述研究均提示miR-654-5p具有成為調節(jié)人骨髓間充質干細胞成骨分化的作用。本研究結果顯示LncRNA-H19轉染組miR-654-5p-3'UTR調節(jié)的熒光素酶活性明顯低于陰性對照組和LncRNA-H19抑制組；LncRNA-H19抑制組miR-654-5p-3'UTR調節(jié)的熒光素酶活性明顯高于陰性對照組。熒光素酶報告檢測系統(tǒng)經常用于RNA結合靶點的驗證，通過本研究發(fā)現LncRNA-H19被沉默而表達下調后引起了miR-654-5p表達上調，反過來主動過表達miR-654-5p則不引起LncRNA-H19變化；而miR-654-5p的過表達或抑制使對應的LCoR水平發(fā)生相反變化，反之LCoR并不存在調控miR-654-5p的功能。大量文獻也提示LncRNA、mi RNA能夠單向或互相調節(jié)影響靶基因表達水平而改變細胞分化命運，因此mi RNA可能通過指導靶RNA切割及翻譯抑制等作用參與Lnc RNA的負調控過程[17-19]。

?組別陰性對照組LncRNA-H19轉染組LncRNA-H19抑制組F值P值BMP-2蛋白相對表達量0.493±0.100 1.102±0.102a 0.202±0.082ab 23.392 0.001 OCN蛋白相對表達量0.372±0.094 1.242±0.088a 0.182±0.092ab 0.892 0.554?

圖1 Western blot檢測圖注：A，LncRNA-H19抑制組；B，LncRNA-H19轉染組；C，陰性對照組。

BMP-2能刺激DNA的合成和細胞的復制，從而促進間充質細胞定向分化為成骨細胞；OCN由分化成熟的成骨細胞合成和分泌，可以反映骨組織中骨鈣蛋白的合成狀況，被認為是成骨細胞向礦化發(fā)生期分化標記之一。本研究結果顯示LncRNA-H19轉染組BMP-2、OCN蛋白相對量明顯高于陰性對照組和LncRNA-H19抑制組；LncRNA-H19抑制組BMP-2、OCN蛋白相對量明顯低于陰性對照組。上述結果提示LncRNA-H19促進人骨髓間充質干細胞向成骨分化，可能與調控MMP-2、OCN蛋白表達有關。研究證實BMP主要通過依賴Smad途徑和p38-MAPK途徑兩條信號通路發(fā)揮作用，且信號轉導過程受細胞外拮抗劑、膜受體、細胞質微環(huán)境和轉錄水平等多個層次的調節(jié)控制，因此LncRNA-H19促進人骨髓間充質干細胞向成骨分化可能與通過介導Smad途徑和p38-MAPK信號通路有關[20]，但相關機制還有待進一步證實。

本研究的創(chuàng)新點在于針對LncRNA-H19通過靶向作用的機制和相關通路進行了較深入的分析，為臨床相關機制的確認提供了數據參考，但LncRNA-H19是否還存在其他機制尚未完全明確，還有待進一步研究探討。綜上所述，LncRNA-H19通過靶向miR-654-5p促進人骨髓間充質干細胞向成骨分化，可能與調控BMP-2、OCN蛋白表達有關。