季佳華，張 瑛，王繼芬，張文芳，李佳瑞

(1.中國人民公安大學偵查學院，北京 100038； 2.北京市公安司法鑒定中心，法庭毒物分析公安部重點實驗室，北京 100192)

芬太尼是1960年由比利時的Paul Janssen合成的一種阿片類鎮(zhèn)痛藥，主要用于臨床麻醉，其麻醉效果是嗎啡的80倍[1]，且不良反應比嗎啡少，是醫(yī)學領域的一項重大突破。之后，以芬太尼為先導化合物衍生出更多芬太尼類化合物，相比于芬太尼，其衍生物的藥效更強[2]。然而，芬太尼及其衍生物具有的致幻、興奮作用被不法分子利用，將其摻入海洛因或其他毒品中出售牟利，危害巨大。2019年5月1日我國開始對芬太尼類新精神活性物質整類列管。因此，對芬太尼類新精神活性物質的快速篩查和檢測是毒品檢驗鑒定工作的重要任務。

目前，關于芬太尼類新精神活性物質的檢測主要采用氣相色譜-質譜法、液相色譜-質譜法、光譜分析法等[3-11]。Jung等[12]采用液相色譜-串聯(lián)質譜法篩查生物檢材中14種芬太尼類似物，在人全血和尿液中的檢出限分別為0.01～0.1 μg/L、0.02～0.05 μg/L，尿液中日內、日間精密度均小于10%，血液中日內、日間精密度均小于15%。Gilbert等[13]采用氣相色譜-質譜法對18種芬太尼衍生物進行定性、定量分析，檢出限為0.007～0.822 mg/L，定量限為0.023～2.742 mg/L。Larabi等[14]采集了一名“丁酰芬太尼”吸食者的2份頭發(fā)(離吸食間隔1個月和1年)，采用液相色譜-串聯(lián)質譜法對頭發(fā)中的芬太尼類似物進行檢測，月檢材中檢出3-氟芬太尼、呋喃芬太尼和芬太尼，年檢材中檢出甲氧基乙酰芬太尼、卡芬太尼和乙酰芬太尼。Kang等[15]基于微型質譜儀建立了一種現(xiàn)場快速檢測芬太尼化合物的方法，飲料中芬太尼化合物檢出限低至10 μg/L，塑料袋表面的芬太尼化合物檢出限低至1 ng/m2。2020年5月29日我國司法部發(fā)布并實施了《生物檢材中芬太尼等31種芬太尼類新精神活性物質及其代謝物的液相色譜-串聯(lián)質譜檢驗方法》[16]，對常見的芬太尼類新精神活性物質的篩查工作形成了行業(yè)標準，但液相色譜-串聯(lián)質譜法前處理繁瑣，存在檢測時間長、有機溶劑污染等問題。

實時直接分析技術與質譜聯(lián)用[17-19]可以在幾秒內將多種形態(tài)樣品離子化供質譜分析[20]。相比于傳統(tǒng)的氣相色譜-串聯(lián)質譜和液相色譜-串聯(lián)質譜法，實時直接分析質譜具有無需前處理或者只需要簡單前處理過程、分析速度快、溶劑損耗低等特點?；诖?，本研究擬采用實時直接分析質譜技術對人全血和尿液中8種常見芬太尼進行篩查，旨在為司法鑒定領域芬太尼類新精神活性物質的快速檢測提供數(shù)據(jù)支撐。

1 實驗部分

1.1 儀器與裝置

實時直接分析離子源：美國Ion Sense公司產品；API4000QTrap 三重四極桿系統(tǒng)：美國Applied Biosystems 公司產品；SIGMA3-30K型高速冷凍離心機：德國Sigma公司產品；MS2旋轉振蕩器：德國IKA公司產品。

1.2 樣品與試劑

甲醇、乙腈：均為HPLC純，中國DiKMA公司產品；芬太尼、奧芬太尼、戊酰芬太尼、乙酰芬太尼、異丁酰芬太尼、丙烯酰芬太尼、呋喃芬太尼、4-氟丁酰芬太尼標準品：均為1 g/L，來自公安部禁毒局國家毒品實驗室；SKF-525內標(1 g/L)：中國計量科學研究院產品。8種芬太尼和內標的基本信息示于圖1。

圖1 8種芬太尼和內標的基本信息Fig.1 Basic information about 8 kinds of fentanyl and internal standard

1.3 樣品預處理

取0.2 mL人空白全血或空白尿液，加入0.1 mL不同濃度的標準溶液，再加入0.01 mL 10 mg/L內標溶液，渦旋30 s混勻，加入0.69 mL甲醇-乙腈溶液(1∶4，V/V)沉淀蛋白，超聲5 min，在4 ℃下以10 000 r/min離心10 min，取上層清液，供儀器分析。

1.4 離子源儀器參數(shù)及DART溫度優(yōu)化

參數(shù)設置：采用DART 12Dip-it自動進樣裝置，離子源出口與質譜的距離為1.6 cm，進樣速度0.6 mm/s，以氦氣作為離子化試劑，柵極電壓250 V，正離子模式檢測，其他離子源儀器參數(shù)默認。

DART溫度優(yōu)化：將8種芬太尼標準溶液稀釋至100 μg/L，分別在100、150、200、250、300、350、400、450、500 ℃溫度下檢測，每種標準品在同一溫度下連續(xù)測定6次，根據(jù)不同溫度下每種芬太尼的響應強度(峰面積)確定最優(yōu)溫度。

1.5 質譜條件優(yōu)化

配制100 μg/L的8種芬太尼標準品，通過正離子全掃描模式采集8種芬太尼的母離子信號，根據(jù)[M+H]+質荷比結合全掃描模式下的峰形確定母離子，通過二級質譜掃描確定子離子，選擇3組響應較高的子離子對，在多反應監(jiān)測(MRM)模式下對各子離子對的去簇電壓和碰撞能量進行優(yōu)化，其MS/MS參數(shù)列于表1。

表1 8種芬太尼的MS/MS參數(shù)Table 1 MS/MS parameters of 8 fentanyls

2 結果與討論

2.1 離子源溫度優(yōu)化

按照1.3節(jié)方法，在不同離子源溫度下檢測100 μg/L芬太尼標準溶液，其峰面積隨離子源溫度的變化趨勢示于圖2。

圖2 不同溫度下8種芬太尼的峰面積Fig.2 Peak areas of 8 kinds of fentanyl at different temperatures

由圖可見，隨著離子源溫度升高，8種芬太尼的峰面積呈上升趨勢，且在450 ℃和500 ℃響應較好，鑒于溫度過高會使化合物分解或者減少儀器使用壽命，因此將離子源的溫度設置為450 ℃。

2.2 工作曲線與檢出限

取0.2 mL人空白全血和空白尿液，分別加入0.1 mL不同濃度的8種芬太尼標準品，按照1.2節(jié)方法處理，使上清液中標準品的濃度分別為50、100、200、500、800 μg/L。根據(jù)8種芬太尼峰面積與內標峰面積的比值對濃度作圖，得到線性關系。按照上述方法配制低濃度溶液，考察8種芬太尼的檢出限，其結果列于表2。

表2 8種芬太尼的線性回歸方程、相關系數(shù)和檢出限Table 2 Linear regression equations, correlation coefficients and limits of detection of 8 kinds of fentanyl

可見，在50～800 μg/L濃度范圍內，8種芬太尼的相關系數(shù)(R2)在0.992 1～0.999 6之間，線性關系良好；檢出限在0.004～0.03 μg/L之間。

2.3 回收率、重復性與精密度

取0.2 mL人空白全血和空白尿液，分別加入0.1 mL不同濃度的8種芬太尼標準品，按照1.2節(jié)方法處理，使上清液中標準品的濃度分別為100、500、1 000 μg/L，同時配制100、500和1 000 μg/L添加內標的標準品溶液。定義A為提取前添加標準品的峰面積/內標的峰面積，B為標準品的峰面積/內標的峰面積，提取回收率=A/B×100%；按照一組6次平行進樣，根據(jù)提取后芬太尼的峰面積與內標峰面積的比值計算相對標準偏差(RSD)，考察重復性；精密度按照早、中、晚一日3次的日內精密度和連續(xù)5天的日間精密度進行考察。8種芬太尼的回收率、重復性與精密度考察結果列于表3。

表3 8種芬太尼的回收率、重復性與精密度Table 3 Recovery, repeatability and precision of 8 kinds of fentanyl

可以看出，3種濃度標準品在2種基質中的回收率在85.08%～108.17%之間，重復性RSD在0.17%～8.41%之間，日內、日間精密度RSD均小于14.8%。表明這8種芬太尼的檢測受人全血和尿液基質的影響較小，日內和日間的檢測結果相對穩(wěn)定，能夠滿足分析血液和尿液生物檢材中芬太尼類物質的需求。

3 結論

本研究建立了實時直接分析串聯(lián)質譜法快速篩查8種芬太尼，并在人全血和尿液中進行方法學驗證。結果表明，該方法線性關系良好，回收率和檢出限均符合實際檢測的基本要求，且前處理簡單、快速高效，可以為司法鑒定領域芬太尼類物質的快速篩查提供有效的方法參考。

續(xù)表3