陳玲瓏， 武垣伶 ， 張 賽 ， 黃丹娜， 王萬鐵△

（1溫州市人民醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)科，浙江溫州325000；2溫州醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)與病理生理學(xué)系，浙江溫州325035；3山西白求恩醫(yī)院檢驗科，山西太原030000）

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種以肺氣流慢性阻塞為特征、會干擾正常呼吸且不能完全逆轉(zhuǎn)的疾?。?］，進一步發(fā)展可能導(dǎo)致慢性肺心病的發(fā)生。肺動脈高壓（pulmonary hypertension，PH）是肺心病的特征性改變，直接影響肺心病的預(yù)后，其病理特征是阻塞性血管重構(gòu)，部分原因是過度的肺動脈平滑肌細胞（pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs）增殖［2］。

三七總皂苷（Panax notoginsengsaponins，PNS）為三七根莖的主要活性成分，主要含有人參皂苷Rg1、人參皂苷 Rb1 及三七皂苷 R1［3］。PNS 具有抑制血管平滑肌細胞增殖和遷移［4］，減少血小板聚集［5］和抗動脈粥樣硬化的作用［6］。但PNS 干預(yù)低氧高二氧化碳性肺動脈高壓（hypoxic hypercapnia-induced pulmonary hypertension，HHPH）的具體作用機制尤其在涉及到自噬相關(guān)通路方面并不是十分明了。因此，本研究以基于磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB/AKT）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號通路的細胞自噬為切入點，探討PNS在低氧高二氧化碳（hypoxia and hypercapnia，HH）環(huán)境下對大鼠PASMCs 自噬和增殖的調(diào)控作用。

材料和方法

1 細胞和主要試劑及儀器

大鼠PASMCs 購于北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司。PNS 購于成都德思特生物技術(shù)有限公司；LY294002及兔抗大鼠AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、LC3B、P62 和增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）抗體購于MCE；HRP 標記的山羊抗兔IgG 購于Biosharp；高糖DMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清購于Gibco；CCK-8 試劑盒購于Dojindo。酶標儀（Bio-Rad）；電泳儀（北京六一儀器廠）；熒光顯微鏡（Nikon）；蛋白電泳/轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad）；透射電鏡（HITACHI）；化學(xué)發(fā)光成像儀（上海勤翔科學(xué)儀器）。

2 實驗方法

2.1 細胞模型的制備及分組 取符合條件的細胞，隨機分為5組，饑餓處理 24 h。（1）對照（control，CON）組：置于常氧（21% O2，5% CO2，37 ℃）箱內(nèi)用DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h；（2）HH 組：置于造模箱（5%O2，6%CO2，37 ℃）內(nèi)用DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h；（3）HH+PNS 組：在 DMEM 高糖培養(yǎng)基中加入200 mg/L PNS 并置于造模箱內(nèi)培養(yǎng)24 h；（4）PI3K 抑制劑 LY294002 組（HH+LY 組）：在DMEM 高糖培養(yǎng)基中加入20 μmol/L LY294002 并置于造模箱內(nèi)培養(yǎng)24 h；（5）HH+PNS+LY 組：在DMEM 高糖培養(yǎng)基中加入 20 μmol/L LY294002 和 200 mg/L PNS 并置于造模箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。

2.2 CCK-8 法檢測細胞活力 按每孔1×104個細胞數(shù)鋪96 孔板（每組3 或4 個復(fù)孔）于37 ℃培養(yǎng)24 h。造模結(jié)束后，棄去培養(yǎng)基混合液，PBS 洗滌，每孔加入 110 μL 混合液（100 μL 純培養(yǎng)基+10 μL CCK-8 溶液），不要有氣泡。放入37 ℃常氧培養(yǎng)箱。孵育適當時間（50 min左右），用酶標儀測定450 nm處A值。

2.3 RT-qPCR 檢 測 AKT、mTOR、LC3 和 p62 的mRNA 表達 分組處理完畢的細胞去除培養(yǎng)液洗滌后，每孔加960 μL Trizol，用細胞刮刀刮下細胞，加入192 μL 氯仿混勻靜置，吸取上層水相（約400 μL）加等體積異丙醇使RNA 沉于管底，棄上清加960 μL 75%乙醇使沉淀懸浮，再次離心收集RNA。測完RNA 濃度后，按說明書進行第1 鏈cDNA 合成和gDNA 去除及RT-qPCR 體系與條件的操作。引物序列設(shè)計與合成見表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.The sequences of the primers for RT-qPCR

2.4 Western blot 檢 測 PASMCs 中 AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、LC3B、P62 和 PCNA 的蛋白水平分組處理完畢的細胞用PBS清洗后加入1 mL細胞裂解混合液（PMSF∶RIPA=1∶100），離心后收集上清于新的1.5 mL EP 管。用BCA 濃度測定試劑盒檢測所收集的上清液蛋白總濃度。將測好濃度的蛋白樣品與相應(yīng)體積的loading buffer 混合后，于100 ℃煮沸5 min 備用。每孔20 μg 的蛋白上樣量進行電泳，并轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜后將其置于5%脫脂牛奶中室溫搖晃封閉2 h。加Ⅰ抗（抗AKT、mTOR、p-mTOR、LC3B、PCNA 和 GAPDH 抗體稀釋比例均為 1∶1 000，抗 p-AKT 抗體稀釋比例為1∶2 000）于4 ℃冰箱中孵育過夜。次日取出PVDF 膜用TBST 快速漂洗后，加Ⅱ抗（用TBST 稀釋辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔Ⅱ抗，比例為1∶10 000）于室溫緩慢孵育1 h。配制化學(xué)發(fā)光液，將漂洗后的PVDF 膜置于曝光儀中，滴加發(fā)光液，曝光并保存結(jié)果。

2.5 透射電鏡觀察PASMCs 中自噬小體 取長勢良好的對數(shù)期的血管平滑肌細胞制成細胞懸液并離心，加入預(yù)冷的2.5%戊二醛固定液于4 ℃固定，經(jīng)0.1 mol/L PBS 漂洗后每管加入1 滴1%鋨酸固定液后放入37 ℃烘箱1 h 進行后固定。再次漂洗后每管加入1 滴1%醋酸鈾染色液放置1 h 進行塊染。將標本分別浸入70%、80%和90%丙酮脫水各10 min，后浸入純丙酮2次，共20 min（通風(fēng)柜中進行）。浸透時分3 步：丙酮∶包埋液=1∶1，37 ℃烘箱1 h；丙酮∶包埋液=1∶4，37 ℃烘箱過夜；純包埋液45 ℃烘箱1 h。包埋聚合后，依次進行半薄切片，超薄切片，最后用透射電鏡觀察及拍片。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 21 軟件對各組實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。所有實驗數(shù)據(jù)均進行正態(tài)性檢驗，計量資料以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。多組樣本的均數(shù)比較采取單因素方差分析（one-way ANOVA）。若方差齊，則采用SNK-q檢驗進行兩兩組間比較；若方差不齊，則采用 Dunnett's T3 檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 PNS濃度的確定

CCK-8 結(jié)果顯示 ，與 0 mg/L組相比 ，3.125、6.25、12.5、25、50 和 100 mg/L 組細胞存活率的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性（P＞0.05），200 mg/L 組的細胞存活率明顯降低（P＜0.05），400、800 和1 600 mg/L 組的細胞存活率過分降低。因此，選擇200 mg/L 作為此研究中PNS的濃度，見圖1。

Figure 1.Effects of different concentrations of PNS on the survival rate of PASMCs.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs 0 mg/L group.圖1 不同濃度三七總皂苷對大鼠PASMCs存活率的影響

2 各組細胞活力

結(jié)果顯示，與CON 組相比，HH 組細胞活力減弱（P＜0.05）；與HH 組相比，HH+PNS組及HH+LY 組細胞活力均減弱（P＜0.05）；與HH+PNS 組相比，HH+PNS+LY組細胞活力無顯著改變（P＞0.05），見圖2。

Figure 2.The viability of PASMCs in each group.Mean±SD.n=4.*P＜0.05 vs CON group；#P＜0.05 vs HH group.圖2 各組大鼠PASMCs活力的變化

3 各組細胞AKT、mTOR、LC3和P62的mRNA表達

與 CON 組 相 比 ，HH 組 AKT、mTOR 及 P62 的mRNA 表達水平降低（P＜0.05）；與HH 組相比，HH+PNS 組 AKT、mTOR 及 P62 的 mRNA 表達水平升高，HH+LY 組 AKT、mTOR 及 P62 的 mRNA 表達水平降低（P＜0.05）；與 HH+PNS 組相比，HH+PNS+LY 組AKT、mTOR 及 P62 的 mRNA 表 達水 平降 低（P＜0.05）。與 CON 組相比，HH 組 LC3 的 mRNA 表達水平升高（P＜0.05）；與HH 組相比，HH+PNS 組LC3 的mRNA 表達水平降低，HH+LY 組 LC3 的 mRNA 表達水平升高（P＜0.05）；與 HH+PNS 組相比，HH+PNS+LY 組 LC3 的 mRNA 表 達 水 平 升 高（P＜0.05）。見圖3。

Figure 3.The mRNA levels of AKT，mTOR，LC3 and P62 in each group.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs CON group；#P＜0.05 vs HH group；△P＜0.05 vs HH+PNS group.圖3 各組細胞AKT、mTOR、LC3及P62的mRNA表達情況

4 各組細胞p-AKT、p-mTOR、P62、LC3B和PCNA蛋白水平的比較

與 CON 組相比，HH 組 p-AKT、p-mTOR 和 P62 的蛋白水平降低（P＜0.05）；與HH 組相比，HH+PNS 組p-AKT、p-mTOR 和 P62 的蛋白水平升高，HH+LY 組p-AKT、p-mTOR 和 P62 的蛋白水平降低（P＜0.05）；與 HH+PNS 組相比，HH+PNS+LY 組 p-AKT、p-mTOR和P62 的蛋白水平降低（P＜0.05）。與CON 組相比，HH 組 LC3B 的蛋白水平升高（P＜0.05）；與 HH 組相比，HH+PNS 組 LC3B 的蛋白水平降低，HH+LY 組LC3B 的蛋白水平升高（P＜0.05）；與 HH+PNS 組相比 ，HH+PNS+LY 組 LC3B 的蛋 白水 平升 高（P＜0.05）。與 CON 組相比，HH 組 PCNA 的蛋白水平升高（P＜0.05）；與 HH 組相比，HH+PNS 組 PCNA 的蛋白水平降低，HH+LY 組PCNA 的蛋白水平升高（P＜0.05）；與 HH+PNS 組相比，HH+PNS+LY 組 PCNA 的蛋白水平升高（P＜0.05）。見圖4。

Figure 4.The protein levels of p-AKT，p-mTOR，LC3B，P62 and PCNA in each group.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs CON group；#P＜0.05 vs HH group；△P＜0.05 vs HH+PNS group.圖4 各組細胞p-AKT、p-mTOR、LC3B、P62及PCNA蛋白的表達情況

5 透射電鏡觀察大鼠PASMCs內(nèi)自噬小體形成情況

與CON 組相比，HH 組的自噬小體數(shù)量增多；與HH 組相比，HH+PNS 組的自噬小體數(shù)量明顯減少，HH+LY 組的自噬小體數(shù)量明顯增多；與HH+PNS 組相比，HH+PNS+LY組的自噬小體數(shù)量增多，見圖5。

Figure 5.The ultrastructural changes of the PASMCs in each group observed by electron microscopy（×25 000）.The scale bar=0.2 μm.圖5 各組細胞電鏡超微結(jié)構(gòu)

討 論

HHPH 是一個多因子參與的病理生理學(xué)過程，包括肺血管收縮（pulmonary vasoconstriction，PV）、肺血管重構(gòu)（pulmonary vascular structural remodeling，PVSR）及血栓形成等方面［7］，其中 PV 和 PVSR 是兩個主要的發(fā)病環(huán)節(jié)［8］。在PVSR 中，存在管壁平滑肌細胞、內(nèi)膜彈力纖維及膠原纖維增生。而PASMCs的增殖和遷移是重要的形成因素。簡言之，HH 引起PASMCs 增殖，導(dǎo)致PVSR，加重PH 的發(fā)展。對于肺部疾病和（或）低氧引起的PH 而言，其發(fā)生往往同時伴隨著肺泡和血液中二氧化碳分壓的升高［9］。因此，制備低氧伴高二氧化碳混合氣體細胞模型能更好地模擬患者的臨床發(fā)病情況。

自噬普遍存在于真核生物中，是一種細胞在壓力條件下的自我適應(yīng)性機制。這是一把“雙刃劍”：在生理條件下低水平自噬作為細胞自穩(wěn)的保護性機制存在；當受到損傷刺激時，自噬信號高表達參與疾病進程。有研究發(fā)現(xiàn)，自噬可以通過調(diào)節(jié)血管壁細胞的一系列變化從而影響肺血管的穩(wěn)態(tài)［10］，從自噬的角度研究PVSR可能會有所突破。

前期動物實驗結(jié)果顯示，PNS 可通過抑制PVSR而減輕 HHPH［11］，但它是否通過 PI3K/AKT/mTOR 信號通路介導(dǎo)的細胞自噬來緩解PH 尚未見詳細報道，需進一步研究。

本研究在使用PNS 后檢測了細胞自噬及增殖的相關(guān)指標。結(jié)果表明，PNS 可改變HH 環(huán)境下PASMCs 的自噬和增殖相關(guān)指標，即PNS 可引起HH環(huán)境下 PASMCs 中 AKT、mTOR 和 P62 的 mRNA 及 p-AKT、p-mTOR 和 P62 的蛋白水平上調(diào)，LC3 的 mRNA和蛋白水平下調(diào)，自噬小體數(shù)量減少，PCNA 的表達下調(diào)。這表明在HH 條件下，加入PNS 有助于降低PASMCs的自噬和增殖，有助于緩解PVSR，維持正常的肺血管形態(tài)。

本實驗將LY294002 與PNS 合用，結(jié)果表明，與HH+PNS 組相比，HH+PNS+LY 組自噬相關(guān)指標AKT、mTOR 和 P62 的 mRNA 及 p-AKT、p-mTOR 和P62 的蛋白水平下調(diào)，LC3 的mRNA 和蛋白水平上調(diào)，自噬小體數(shù)量增加，PCNA 的表達上調(diào)。這表明加入PI3K/AKT/mTOR 信號通路抑制劑LY294002后，PNS對PASMCs自噬的緩解程度有所減弱。

綜上所述，在HH 環(huán)境下，PNS 有助于降低大鼠PASMCs的自噬，減弱其增殖，機制可能與激活PI3K/AKT/mTOR信號通路有關(guān)。