秦青華， 邱春紅

（山東大學(xué)齊魯醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)系，山東濟(jì)南250012）

炎性腸病（Inflammatory bowel disease，IBD）的發(fā)病率在中國(guó)呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)，而且其難以治愈及反復(fù)發(fā)作的特點(diǎn)具有惡化為結(jié)直腸癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。目前，對(duì)于IBD 的主要藥物治療策略可分為兩類：（1）用抗炎類藥物進(jìn)行治療，例如5-氨基水楊酸［1］；（2）免疫抑制劑療法，例如腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）抑制劑［2］。這兩種治療方法雖然可以有效的抑制IBD，但仍然不能從本質(zhì)上起到治愈IBD 的作用。此外，長(zhǎng)期使用抗炎藥物易致使機(jī)體產(chǎn)生耐藥性，而免疫抑制劑可導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生免疫紊亂從而影響治療效果。因此，明確疾病的發(fā)病機(jī)制、探索更為有效的治療方式成為臨床和基礎(chǔ)研究急需解決的問題。

時(shí)鐘基因的節(jié)律性表達(dá)在正常生命活動(dòng)中普遍存在，并通過參與調(diào)控外周生物鐘與中央生物鐘正常運(yùn)轉(zhuǎn)實(shí)現(xiàn)各器官功能的調(diào)控［3］。已有相關(guān)研究表明時(shí)鐘基因可以參與免疫調(diào)控過程進(jìn)而干預(yù)炎癥疾病的發(fā)生發(fā)展［4］，從鐘基因的角度探究IBD 的發(fā)病機(jī)制并開發(fā)非藥物依賴性的物理治療手段干預(yù)腸道疾病具有重要的臨床意義。因此，本文綜述鐘基因與炎癥免疫的相關(guān)研究，為IBD 的臨床診治提供參考資料。

1 鐘基因基本調(diào)控機(jī)制

晝夜節(jié)律的紊亂與臨床多種疾病有關(guān)［5］。生物鐘作為機(jī)體產(chǎn)生節(jié)律行為的內(nèi)在因素主要由輸入通路、中央振蕩器和輸出通路3 個(gè)部分組成，通過分子水平反饋環(huán)路和信號(hào)級(jí)聯(lián)放大機(jī)制實(shí)現(xiàn)機(jī)體生理和行為活動(dòng)產(chǎn)生周期性變化，從而維持機(jī)體器官與內(nèi)外界環(huán)境變化相適應(yīng)并發(fā)揮正常生理功能［6］。

截止目前，已報(bào)道的哺乳動(dòng)物鐘基因主要包括以下幾種：Per1、Per2、Per3（period circadian genes）；Cry1、Cry2（cryptochromes）；Bmal1（brain and muscle ARNT-like 1）；Rev-erbα、Clock（circadian locomotor output cycles kaput）、Dbp（D-site binding protein）和Nfil3（nuclear factor，interleukin 3 regulated）。這些基因的轉(zhuǎn)錄翻譯活動(dòng)構(gòu)成哺乳動(dòng)物中的3條轉(zhuǎn)錄-翻譯反饋環(huán)路（圖 1）：（1）正調(diào)控蛋白 CLOCK 和BMAL1 通過bHLH-PAS 結(jié)構(gòu)異二聚化結(jié)合到負(fù)調(diào)控基因（Cry1、Cry2、Per1和Per2）的E-box 上，從而激活基因轉(zhuǎn)錄；其表達(dá)產(chǎn)物鐘蛋白CRY 和PER 達(dá)閾值后，二者相互作用（CRY-PER）從胞漿轉(zhuǎn)移至核內(nèi)，進(jìn)而抑制Clock和Bmal1的轉(zhuǎn)錄，阻斷BMAL1-CLOCK異二聚體的形成［7］。（2）BMAL1-CLOCK 異二聚體促進(jìn)Rorα/β/γ［8］和Rev-erbα/β［9］基因的表達(dá)；RORα/β/γ和 REV-ERBα/β 蛋白與Bmal1啟動(dòng)子的反應(yīng)元件RORE 結(jié)合而發(fā)揮促進(jìn)或阻遏Bmal1基因轉(zhuǎn)錄的作用［10］。（3）BMAL1-CLOCK 異二聚體啟動(dòng)Dbp基因的表達(dá)產(chǎn)生DBP 蛋白：一方面，DBP 可與帶有D 盒的基因（如Rorα/β/γ）結(jié)合并激活其轉(zhuǎn)錄；另一方面，NFIL3 蛋白也能夠競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合至D 盒而抑制相關(guān)基因表達(dá)。此外Nfil3基因本身也作為 RORα/β/γ 的靶基因而受到調(diào)控［11］。這3條轉(zhuǎn)錄-翻譯反饋環(huán)路通過控制鐘基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物的節(jié)律，維持各器官生理功能的穩(wěn)定。

Figure 1.Transcriptional-translational feedback loop of clock genes.圖1 鐘基因的轉(zhuǎn)錄-翻譯反饋環(huán)路

2 鐘基因與炎癥性腸病的關(guān)系

克羅恩?。–rohn disease，CD）和潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是IBD 的兩種主要類型。IBD患者如不能進(jìn)行及時(shí)、有效治療，約三分之一的結(jié)腸炎患者會(huì)發(fā)生癌變［12］。因此，進(jìn)一步明確IBD 的發(fā)病機(jī)制、防止其惡化，并提供更加行之有效的治療方法是臨床治療和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中所要解決的重要問題。

腸道免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子、腸道菌群等被證明與內(nèi)部時(shí)鐘密切相關(guān)。這些因素一方面受到鐘基因的調(diào)控呈現(xiàn)晝夜變化，另一方面也干擾鐘基因的表達(dá)［13］，例如Bmal1、Rev-erbα等鐘基因能夠參與調(diào)控細(xì)胞分化、脂質(zhì)代謝、線粒體生物發(fā)生和炎癥等各種生理病理過程。因此，以生物鐘系統(tǒng)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)或?qū)⒊蔀橹委熌c道炎癥疾病的一種新方法［14］。

2.1 鐘基因調(diào)控固有免疫細(xì)胞參與炎癥反應(yīng) 特定的固有免疫細(xì)胞亞群對(duì)IBD 的發(fā)生發(fā)展發(fā)揮著關(guān)鍵調(diào)控作用［15-17］。單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞等多種固有免疫細(xì)胞［18］已被證明具有內(nèi)在的“時(shí)鐘機(jī)制”，這些“時(shí)鐘”影響細(xì)胞的功能，如調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞吞噬活性、細(xì)胞因子釋放、抗病毒活性、肥大細(xì)胞的組胺釋放、過敏反應(yīng)等［19］，是調(diào)節(jié)固有免疫細(xì)胞發(fā)揮作用的關(guān)鍵因素。

周期性蛋白PER1是脾臟NK細(xì)胞發(fā)揮有效功能所必需的［20］，而在巨噬細(xì)胞中含有Bmal1 的時(shí)鐘轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)能夠通過調(diào)控增強(qiáng)子的表觀遺傳狀態(tài)來控制巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)［21］。髓系來源的細(xì)胞在干擾Bmal1 后抑制了核因子E2 相關(guān)因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而促進(jìn)白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）的產(chǎn)生［22］，加重炎癥反應(yīng)。

NLRP3（NLR family pyrin domain containing 3）炎癥小體是由NLRP3、ASC 和caspase-1 組成的大蛋白復(fù)合物［23］，在對(duì)病原體相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）或損傷相關(guān)分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs）的先天免疫反應(yīng)中起著核心作用［24-25］。巨噬細(xì)胞中激活的NLRP3 炎癥體促進(jìn)caspase-1、促炎細(xì)胞因子IL-1β 和IL-18 的成熟和分泌，而這一過程同樣也受到REV-ERBα的嚴(yán)格調(diào)控［26］。此外，巨噬細(xì)胞中Bmal1的敲除可上調(diào)丙酮酸激酶M2（pyruvate kinase M2，PKM2）蛋白水平并促進(jìn)乳酸產(chǎn)生，最終導(dǎo)致免疫檢查點(diǎn)蛋白程序性死亡配體1（programmed death ligand 1，PD-L1）高表達(dá)［27］。

隱花色素（cryptochromes，CRYs）通過對(duì)腺苷酸環(huán)化酶的作用直接影響炎癥通路。在敲除Cry1的情況下，cAMP 的基礎(chǔ)水平升高導(dǎo)致蛋白激酶A 激活增強(qiáng)，進(jìn)而誘導(dǎo)p65 亞基S276 位點(diǎn)磷酸化，促進(jìn)NF-κB信號(hào)通路激活。Cry1-/-Cry2-/-小鼠的巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和骨髓細(xì)胞中幾種促炎細(xì)胞因子，如IL-6、TNF-α 和 CXC 趨化因子配體 1（CXC chemokine ligand 1，CXCL1）的基礎(chǔ)水平升高［28］。

中性粒細(xì)胞被募集至利什曼原蟲感染位點(diǎn)也已被證明受到鐘基因的調(diào)節(jié)［29］；Godinho-Silva 等［30］證明，第3 組固有淋巴樣細(xì)胞（group 3 innate lymphoid cells，ILC3s）內(nèi)也存在生物鐘。

2.2 鐘基因調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫細(xì)胞的發(fā)育及遷移 早期人們認(rèn)為適應(yīng)性免疫從激活到發(fā)揮作用再到結(jié)束的整個(gè)過程發(fā)生速度較快，因而不受生物鐘的調(diào)控。近些年分子水平的研究表明淋巴細(xì)胞的發(fā)育分化及功能發(fā)揮同樣受到生物鐘的調(diào)控［31］。

2.2.1 BMAL1 與淋巴細(xì)胞的發(fā)育 鐘基因參與B淋巴細(xì)胞的發(fā)育機(jī)制尚不明確，但淋巴細(xì)胞發(fā)育的晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)對(duì)于每天維持細(xì)胞類型的平衡至關(guān)重要。Bmal1-/-小鼠血液和脾臟中B 細(xì)胞數(shù)量明顯減少，過繼轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)表明阻礙B細(xì)胞分化的不是B細(xì)胞的內(nèi)在“時(shí)鐘”，而是骨髓微環(huán)境中BMAL1 的缺失［32］。關(guān)于生物鐘對(duì)T 細(xì)胞發(fā)育的影響，研究認(rèn)為總的T 細(xì)胞數(shù)目不受整體或細(xì)胞特異性Bmal1敲除的影響［33］。

2.2.2 NFIL3 與T 細(xì)胞的發(fā)育 轉(zhuǎn)錄因子NFIL3 又稱E4BP4，在多種免疫細(xì)胞中表達(dá)并可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞類型不同的免疫功能，而Nfil3轉(zhuǎn)錄同樣受細(xì)胞生物鐘控制［11］。在活化的Rev-erbα-/-CD4+T 細(xì)胞中，NFIL3 的表達(dá)通常高于未敲除Rev-erbα的 CD4+T 細(xì)胞［9］。NFIL3 通過節(jié)律性抑制Rorc的轉(zhuǎn)錄以實(shí)現(xiàn)對(duì)TH17 細(xì)胞的調(diào)節(jié)（Rorc編碼的 RORγt 是 TH17 所必需的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子）；細(xì)胞分化研究發(fā)現(xiàn)，NFIL3在白天表達(dá)較低，夜間表達(dá)較高，RORγt 在白天表達(dá)較高，夜間表達(dá)較低，因此白天分離的純CD4+T細(xì)胞在體外極化后更容易分化為TH17細(xì)胞［34］。

在Nfil3-/-小鼠中ILC3s 發(fā)育受阻，從而導(dǎo)致TH17細(xì)胞的分化受到抑制［35］。但這一差異在Nfil3-/-細(xì)胞中是不存在的，這表明體內(nèi)TH17細(xì)胞的數(shù)量平衡是依賴NFIL3的，并通過生物鐘在整個(gè)T細(xì)胞群體中同步進(jìn)行。也有研究表明，夜間信號(hào)激素褪黑素的水平較低會(huì)影響TH17 細(xì)胞的分化，褪黑素對(duì)人T細(xì)胞的治療已被證明可以通NFIL3-RORγt途徑抑制TH17細(xì)胞的分化來實(shí)現(xiàn)［36］。

2.2.3 淋巴細(xì)胞的節(jié)律性轉(zhuǎn)移 血液中T 細(xì)胞和B細(xì)胞表現(xiàn)出強(qiáng)烈的晝夜節(jié)律振蕩。在小鼠體內(nèi)穩(wěn)態(tài)條件下，淋巴結(jié)內(nèi)的淋巴細(xì)胞也呈現(xiàn)晝夜節(jié)律振蕩，而且淋巴細(xì)胞數(shù)量峰值出現(xiàn)在小鼠活動(dòng)階段［37］。在夜間CC 趨化因子受體 7（CC chemokine receptor 7，CCR7）和 CC 趨化因子配體 21（CC chemokine receptor 21，CCL21）表達(dá)水平達(dá)到最高，CD4+T 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞和B 細(xì)胞在淋巴節(jié)中大量募集；而在Bmal1表達(dá)受到抑制后，依賴于時(shí)間的T 淋巴細(xì)胞歸巢與分布則受到抑制［38］。淋巴細(xì)胞從淋巴結(jié)進(jìn)入傳出淋巴管并最終排出的節(jié)律性依賴于鞘氨醇1-磷酸受體 1（sphingosine 1-phosphate receptor 1，S1P1）的節(jié)律性表達(dá)。Nakai 等［39］的研究表明，晚上遷移到淋巴結(jié)的細(xì)胞停留的時(shí)間也比白天遷移的細(xì)胞要長(zhǎng)。

2.3 鐘基因與腸道菌群互作控制腸道穩(wěn)態(tài) 微生物是腸道功能的重要調(diào)節(jié)因子，其代謝產(chǎn)物影響宿主免疫系統(tǒng)的發(fā)育，鐘基因異常表達(dá)可能通過改變腸道微生物群導(dǎo)致IBD的發(fā)病。

腸上皮細(xì)胞通過Toll 樣受體（Toll-like receptors，TLRs）及共同信號(hào)受體MyD88 來感知微生物以調(diào)節(jié)關(guān)鍵基因的表達(dá)［40］。腸樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DC）-ILC3 通路由革蘭氏陰性菌外膜中存在的鞭毛素或脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）激活DC中的TLR-MyD88信號(hào)，并通過細(xì)胞因子IL-23將細(xì)菌信號(hào)從 DC 傳遞到 ILC3，ILC3 通過產(chǎn)生 IL-22 向上皮細(xì)胞發(fā)出信號(hào)［41］，激活的 IL-22R 導(dǎo)致 STAT3 的磷酸化而與Rev-erbα啟動(dòng)子結(jié)合并抑制其轉(zhuǎn)錄。

腸道微生物通過NFIL3 調(diào)節(jié)身體內(nèi)的代謝［42］。腸道微生物能夠通過組蛋白脫乙酰酶3 來調(diào)節(jié)宿主代謝的晝夜節(jié)律，并且脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因CD36的節(jié)律性轉(zhuǎn)錄也同樣依賴于腸道微生物［43］。

2.4 褪黑素減輕腸道炎癥 褪黑素作為一種激素分子產(chǎn)物從松果體釋放到循環(huán)系統(tǒng)中調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)和晝夜節(jié)律，其發(fā)揮作用主要存在兩種方式：依賴和不依賴于褪黑素受體［44］。研究顯示褪黑素也可由松果體以外組織和細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生，包括腸黏膜、自然殺傷細(xì)胞、腸嗜鉻細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞［45］。此外，線粒體可能是所有真核細(xì)胞褪黑素合成的主要部位［46］。

由小鼠睡眠剝奪引起的腸黏膜損傷及腸道微生物群失調(diào)與褪黑素受到抑制密切相關(guān)［47］。褪黑素可被用作抗氧化劑，通過抑制氧化應(yīng)激和NF-κB 途徑的激活來逆轉(zhuǎn)因睡眠剝奪誘導(dǎo)的小腸黏膜損傷［48］。睡眠剝奪的小鼠腸道中活性氧（reactive oxygen species，ROS）的積累導(dǎo)致小鼠的死亡率上升，在使用褪黑素進(jìn)行治療后，小鼠腸道ROS含量降低，存活率顯著升高［49］。持續(xù)的環(huán)加氧酶（cyclooxygenase-2，COX-2）過表達(dá)參與了炎癥相關(guān)結(jié)直腸癌的發(fā)生［50］。在IL-1β 刺激的人腸上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)中，褪黑素能抑制COX-2的表達(dá)，但褪黑素對(duì)腸上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的抑制作用只有在褪黑素的濃度與治療睡眠障礙膳食中褪黑素濃度相近時(shí)才會(huì)發(fā)生，生理?xiàng)l件下納摩爾級(jí)別濃度的褪黑素不具備這樣的效果［51］。此外，褪黑激素可以通過減少巨噬細(xì)胞中炎癥小體多蛋白復(fù)合物的形成減輕炎癥小體相關(guān)的血管疾?。?2］。

3 總結(jié)

雖然鐘基因的節(jié)律性表達(dá)能夠在一定程度上通過調(diào)控CD4+T 細(xì)胞的發(fā)育及遷移、固有免疫細(xì)胞釋放炎性因子以及與腸道菌群等的相互作用來改變炎癥免疫微環(huán)境，干預(yù)炎癥疾病的發(fā)生發(fā)展，但是仍然還有許多值得深入研究的問題：鐘基因介導(dǎo)免疫系統(tǒng)干預(yù)腸道炎癥的具體機(jī)制是什么？不同的鐘基因在炎癥中是如何發(fā)揮作用的？在不改變光照周期的條件下，不同光譜是否能通過鐘基因抑制IBD 的發(fā)展？能否針對(duì)鐘基因設(shè)計(jì)相應(yīng)的治療方案？隨著對(duì)鐘基因和IBD 更加深入的研究，將會(huì)提出更為行之有效的治療方案。