陳 威， 彭 燦， 勵(lì) 勇， 章建飛， 王新東△

（1寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，浙江寧波315211；2寧波市臨床病理診斷中心，浙江寧波315021）

惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲正常腦組織是造成膠質(zhì)瘤不良預(yù)后的主要原因之一［1］，但膠質(zhì)瘤的侵襲性機(jī)制仍待進(jìn)一步探索。眾所周知，缺氧微環(huán)境是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的特征之一，缺氧可誘導(dǎo)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變［2］，缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia-inducible factor，HIF）是與缺氧相關(guān)的最重要的轉(zhuǎn)錄因子［3-4］。HIF 轉(zhuǎn)錄因子有助于腫瘤細(xì)胞適應(yīng)缺氧，在許多惡性腫瘤的研究中發(fā)現(xiàn)通過(guò)缺氧條件的誘導(dǎo)，會(huì)使HIF-2α 蛋白表達(dá)水平上調(diào)，使腫瘤細(xì)胞適應(yīng)缺氧，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展［5-6］。據(jù)報(bào)道，HIF-2α 在惡性膠質(zhì)瘤的化療耐藥性中也起著至關(guān)重要的作用［7］，但具體機(jī)制還不甚清楚。轉(zhuǎn)錄因子叉頭框蛋白C1（forkhead box C1，F(xiàn)OXC1）屬于叉頭框轉(zhuǎn)錄子基因家族的一員［8-9］。國(guó)內(nèi)有文獻(xiàn)報(bào)道，通過(guò)過(guò)表達(dá)FOXC1 后，會(huì)促使膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力明顯增強(qiáng)［10］，但缺氧條件是否能影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞中FOXC1 的表達(dá)，進(jìn)而影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性暫無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)初步探討了在缺氧情況下FOXC1 在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)情況及HIF 對(duì)其表達(dá)的影響，進(jìn)一步闡明HIF-2α 與FOXC1之間的關(guān)系，為臨床治療膠質(zhì)瘤提供新的靶點(diǎn)和理論依據(jù)。

材料和方法

1 材料

人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87 購(gòu)于ATCC；人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251 獲得于日本理化研究中心。BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒、I 抗稀釋液、超敏ECL 化學(xué)顯色劑和Tween-20 購(gòu)自江蘇碧云天公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購(gòu)自Gibco；0.25%胰蛋白酶、高糖DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)自HyClone；二甲基亞砜（dimerthyl suifoxide，DMSO）購(gòu)于北京索萊寶公司；Trizol Regent 試劑購(gòu)于 Ambion；小鼠抗人 β-actin 單克隆抗體、小鼠抗人FOXC1 單克隆抗體、小鼠抗人HIF-1α 單克隆抗體、兔抗人 HIF-2α 多克隆抗體、兔抗人N-cadherin 多克隆抗體、小鼠抗人vimentin 單克隆抗體和小鼠抗人E-cadherin 單克隆抗體等均購(gòu)自Abcam；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG 購(gòu)于武漢普美克生物有限公司；FOXC1和GAPDH的PCR引物購(gòu)于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）干擾序列購(gòu)自上海吉瑪公司；Transwell 小室購(gòu)自Millipore；基質(zhì)膠購(gòu)于Sigma。PCR分析儀和電泳儀裝置購(gòu)于Amersham；凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自Bio-Rad。

2 主要方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) U87 和U251 細(xì)胞置于含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。陰性對(duì)照組在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期膠質(zhì)瘤細(xì)胞置于缺氧培養(yǎng)箱（37 ℃、5% CO2、1% O2、94% N2）進(jìn)行培養(yǎng)，缺氧培養(yǎng)的時(shí)間分別為3、12、24和48 h。并以CoCl2模擬缺氧條件，取24 孔板，每孔中接種1×104個(gè)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的膠質(zhì)瘤細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，棄去原培養(yǎng)液，加入含CoCl2的細(xì)胞培養(yǎng)液，CoCl2的濃度分別為0、100、150、200和250 μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，再進(jìn)行細(xì)胞RNA或者蛋白的提取。

2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將U87 和U251 細(xì)胞接種到6 孔板中，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好、融合度達(dá)60%～70%時(shí)，換為無(wú)胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液靜置24 h，使細(xì)胞生長(zhǎng)同步化，24 h后換為含有2%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基。計(jì)算所需要轉(zhuǎn)染的siRNA 的量，在200 μL DMEM 培養(yǎng)基中分別加入5μL siRNA 以及 8 μL 的Lipofectamine 2000，使其充分混勻；室溫下靜置18 min后加入細(xì)胞中；再按實(shí)驗(yàn)需求放入相對(duì)應(yīng)的正常氧或缺氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)轉(zhuǎn)染48 h后，方可行細(xì)胞RNA或者蛋白的提取。

2.3 Western blot 法檢測(cè) U87 和 U251 瘤細(xì)胞中 HIF-1α、HIF-2α、FOXC1、N-cadherin、E-cadherin 和vimentin 的蛋白水平 吸棄細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS 清洗3 次，吸凈殘余液體，6 孔板每孔中加120 μL 裂解液，置于冰上裂解5 min，用細(xì)胞刮充分刮取，將細(xì)胞裂解物收集到 1.5 mL EP 管中，4 ℃、12 000 r/min 離心 20 min，提取上清液，加入5×上樣緩沖液，煮沸后經(jīng)SDSPAGE 分離蛋白；上膠恒壓 80 V，42 min，下膠恒壓120 V，65 min。轉(zhuǎn)膜恒流300 mA、60 min；50 g/L脫脂牛奶常溫封閉1 h。TBST 洗膜后，分別加小鼠抗人β-actin 抗體（1∶4 000）、小鼠抗人FOXC1 單克隆抗體（1∶1 000）、小鼠抗人HIF-1α 單克隆抗體（1∶1 000）、兔抗人HIF-2α 多克隆抗體（1∶1 000）、兔抗人N-cadherin 多克隆抗體（1∶1 000）、小鼠抗人vimentin 單克隆抗體（1∶1 000）、小鼠抗人E-cadherin 單克隆抗體（1∶1 000），4 ℃孵育過(guò)夜；回收Ⅰ抗，TBST洗滌后，分別加入相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG或辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（1∶3 000），室溫孵育1 h，TBST洗滌3次后用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，經(jīng)Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)曝光，用Image Lab 6.1軟件分析圖像。

2.4 Transwell 侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè) U87 和 U251 細(xì)胞的侵襲能力 按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，進(jìn)行基質(zhì)膠的制備：從-80 ℃冰箱中提前將Matrigel 膠取出后放至4 ℃的冰箱過(guò)夜，使其由固態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)；將液態(tài)的Matrigel 膠和無(wú)血清培養(yǎng)基充分混勻，混勻體積比為1∶3，將體積為 80 μL 的 Matrigel 膠稀釋后加入到上室，使其均勻的鋪至上室的底部，放入37 ℃的培養(yǎng)箱，使得Matrigel 膠凝固。用移液吸槍將細(xì)胞懸液加入鋪有Matrigel 膠的Transwell 小室的上室中，量約200 μL。將 Transwell 小室放至 24 孔板中，孔板內(nèi)形成Transwell 的下室，在每個(gè)Transwell 小室的下室加入500 μL 含有20%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基，再將小室放至37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行孵育。經(jīng)過(guò)24 h 的孵育后，將小室從細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出，用潔凈的醫(yī)用棉簽將小室上室中的細(xì)胞輕輕拭去，用PBS緩沖液將Transwel 小室的上室清洗3 次，用4%的多聚甲醛固定細(xì)胞20 min，再用PBS 緩沖液洗滌3 次。將小室內(nèi)的細(xì)胞用0.1%的結(jié)晶紫染色20 min，然后用PBS 緩沖液反復(fù)沖洗3 次，用顯微鏡取3 個(gè)獨(dú)立的視拍野照計(jì)數(shù)，計(jì)算平均值。

2.5 RT-qPCR檢測(cè)FOXC1的mRNA水平 用Trizol 試劑從細(xì)胞中提取總RNA。然后根據(jù)RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 說(shuō)明書(shū)操作逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄之后獲得的cDNA 按照天根SuperReal熒光定量預(yù)混試劑盒的20 μL 體系操作，按照 2-ΔΔCt方法計(jì)算 RNA 的相對(duì)表達(dá)量。使用引物序列見(jiàn)表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.The sequences of the primers for RT-qPCR

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。每組實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3 次。多組間的比較使用單因素方差分析，方差分析后各組均數(shù)間使用q檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中，F(xiàn)OXC1、HIF-1α 和HIF-2α隨缺氧時(shí)長(zhǎng)增加及加入CoCl2濃度的增加而表達(dá)逐步上升

為了探尋缺氧環(huán)境下FOXC1 在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的表達(dá)水平，分別在正常氧條件下及缺氧3、12、24和48 h 條件下培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87 和U251，通過(guò)RT-qPCR 檢測(cè) FOXC1 的 mRNA 表達(dá)，通 過(guò) Western blot 實(shí)驗(yàn)檢測(cè) HIF-1α、HIF-2α 及 FOXC1 蛋白的表達(dá)水平。Western blot 結(jié)果顯示，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87和U251 中，缺氧條件下HIF-1α、HIF-2α 和FOXC1 蛋白表達(dá)水平與正常氧條件相比均明顯升高（P＜0.05），見(jiàn)圖 1A。RT-qPCR 結(jié)果顯示，在缺氧條件下，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87 和U251 中FOXC1 的mRNA表達(dá)水平與正常氧條件相比均明顯升高，且隨缺氧時(shí)間延長(zhǎng)，F(xiàn)OXC1 的 mRNA 表達(dá)逐步升高（P＜0.05），見(jiàn)圖1B。應(yīng)用HIF 誘導(dǎo)劑CoCl2模擬缺氧條件，發(fā)現(xiàn)CoCl2處理的膠質(zhì)瘤U87 和U251 細(xì)胞系中FOXC1 的 mRNA 表達(dá)水平及 FOXC1、HIF-1α 和 HIF-2α 的蛋白表達(dá)水平均較陰性對(duì)照組明顯升高，且升高水平與加入CoCl2的濃度呈正相關(guān)（P＜0.05），見(jiàn)圖1C、D。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)缺氧環(huán)境能誘導(dǎo)FOXC1的表達(dá)，HIF-1α 和 HIF-2α 可能參與缺氧環(huán)境下FOXC1的表達(dá)上調(diào)。

Figure 1.The expression of FOXC1 at mRNA and protein levels，and the protein levels of HIF-1α and HIF-2α in the glioma U87 cells and U251 cells under normoxic and hypoxic conditions.A，C：the images and quantitative analysis by Western blot for determining the protein levels of HIF-1α，HIF-2α and FOXC1；B，D：the mRNA expression of FOXC1 detected by RT-qPCR detection.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs normoxia group；#P＜0.05 vs 0 μmol/L CoCl2 group.圖1 常氧和缺氧環(huán)境下，F(xiàn)OXC1、HIF-1α和HIF-2α在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)

2 缺氧環(huán)境下HIF-2α上調(diào)FOXC1的表達(dá)水平

為了探尋 HIF-1α 和 HIF-2α 在缺氧環(huán)境下對(duì)FOXC1 表達(dá)水平的影響，我們?cè)谀z質(zhì)瘤細(xì)胞系U87和 U251 中分別敲減HIF-1α和HIF-2α的表達(dá)水平，通過(guò)Western blot 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，正常氧條件下，轉(zhuǎn)染HIF-1αsiRNA（siHIF-1α）和HIF-2αsiRNA（siHIF-2α）后，細(xì)胞中FOXC1 蛋白的表達(dá)水平無(wú)明顯變化。而轉(zhuǎn)染 siHIF-1α 后，缺氧條件下細(xì)胞中HIF-1α 蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯降低（P＜0.05），而FOXC1 蛋白的表達(dá)水平無(wú)明顯變化（圖2A）；但在轉(zhuǎn)染siHIF-2α后，缺氧條件下培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中FOXC1 以及HIF-2α 的蛋白表達(dá)水平均較陰性對(duì)照組下降（P＜0.05），見(jiàn)圖2B。進(jìn)一步證實(shí)缺氧環(huán)境下FOXC1 的上調(diào)與HIF-2α表達(dá)相關(guān)。

Figure 2.Western blot was used to detect the protein expression of FOXC1 under hypoxia when knock-down of HIF-1α and HIF-2α in glioma cell lines U87 and U251 after transfection of HIF-1α siRNA（A）and HIF-2α siRNA（B），respectively.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs normoxia group；#P＜0.05 vs hypoxia group.圖2 缺氧環(huán)境下，分別敲減膠質(zhì)瘤細(xì)胞中HIF-1α或HIF-2α表達(dá)后的FOXC1蛋白的表達(dá)變化

3 缺氧環(huán)境下下調(diào)FOXC1表達(dá)水平抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲能力

分別在常氧和缺氧條件下培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87和U251，Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與常氧條件下相比，缺氧條件下膠質(zhì)瘤細(xì)胞系侵襲能力明顯增強(qiáng)；缺氧條件下轉(zhuǎn)染FOXC1siRNA（siFOXC1）后，與缺氧組相比侵襲能力明顯減弱（P＜0.05），見(jiàn)圖3A。通過(guò)Western blot 實(shí)驗(yàn)繼續(xù)探尋缺氧環(huán)境下FOXC1 與細(xì)胞上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)錄因子 N-cadherin、E-cadherin 和 vimentin 的關(guān)系。如圖3B 所示，膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87和U251在缺氧環(huán)境下，與常氧環(huán)境相比，間質(zhì)化標(biāo)記蛋白N-cadherin和vimentin表達(dá)明顯上升，而上皮標(biāo)記蛋白E-cadherin的表達(dá)明顯下降（P＜0.05）；缺氧環(huán)境下，敲減FOXC1的表達(dá)會(huì)降低N-cadherin和vimentin表達(dá)，升高E-cadherin 的表達(dá)（P＜0.05）。這些結(jié)果說(shuō)明在缺氧條件下，F(xiàn)OXC1的表達(dá)變化與腫瘤的侵襲能力息息相關(guān)。

Figure 3.The changes of the invasive ability and the protein expression of N-cadherin，E-cadherin and vimentin in U87 and U251 cells with knock-down of FOXC1 expression.A：representative images and quantitative analysis showed that the invasive ability of glioma cell lines U87 and U251 was changed after knock-down of FOXC1 expression under normoxic and hypoxic conditions（×200）；B：Western blot was used to detect the changes of FOXC1，N-cadherin，E-cadherin and vimentin protein levels in glioma cell lines U87 and U251 after knock-down of FOXC1 expression under normoxic and hypoxic conditions.Mean±SD. n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs normoxia group；#P＜0.05 vs hypoxia group.圖3 缺氧環(huán)境下，敲減FOXC1表達(dá)后膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力以及N-cadherin、E-cadherin和vimentin蛋白表達(dá)的變化

討 論

腦膠質(zhì)瘤是來(lái)源于神經(jīng)上皮的一種最常見(jiàn)的腫瘤，占所有原發(fā)性腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的24%［11］。盡管目前對(duì)腦膠質(zhì)瘤的治療方法取得了很大的進(jìn)展，但是由于惡性膠質(zhì)瘤侵襲能力強(qiáng)這一特點(diǎn)導(dǎo)致外科治療及放化療后腫瘤容易復(fù)發(fā)，以至于患者的預(yù)后仍極差，膠質(zhì)瘤的總體治療效果并不理想［12-14］。因此當(dāng)前對(duì)于抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞高度侵襲能力的相關(guān)研究迫在眉睫。

腫瘤生長(zhǎng)的微環(huán)境中缺氧是其一個(gè)基本的特征［15-16］。腫瘤細(xì)胞在低氧條件下可以通過(guò)激活適應(yīng)性反應(yīng)繼續(xù)存活［17-18］。缺氧誘導(dǎo)因子是與缺氧相關(guān)的最重要的轉(zhuǎn)錄因子，在缺氧條件下，起著傳遞缺氧信號(hào)、介導(dǎo)缺氧效應(yīng)的重要作用［19-20］。HIFs 是一個(gè)異二聚體復(fù)合物，由 HIF-α 和 HIF-β 組成，HIF-β 是一個(gè)穩(wěn)定的亞基，HIF-α 是親氧亞基［21-22］。哺乳動(dòng)物的 HIF-α 有 3 種 亞型 ，即 HIF-1α、HIF-2α 和 HIF-3α［3-4］。目前研究表明 HIF-2α 的高度表達(dá)與乳腺癌和小細(xì)胞肺癌的侵襲及轉(zhuǎn)移有關(guān)，其機(jī)制可能是HIF間接或直接誘導(dǎo)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）［23］。HIF-2α過(guò)度表達(dá)也是預(yù)測(cè)肝癌、大腸癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、腦部腫瘤和卵巢癌等惡性腫瘤不良預(yù)后的重要相關(guān)標(biāo)志物［24］。

叉頭框（forkhead box，F(xiàn)OX）家族成員的分子結(jié)構(gòu)都有一個(gè)明顯的叉頭和螺旋翼狀DNA 結(jié)合區(qū)域，其是錄轉(zhuǎn)因子的大家族，家族成員眾多，參與調(diào)控基因的表達(dá)，與細(xì)胞的生長(zhǎng)周期、增殖、分化、遷移、新陳代謝、DNA 的損傷應(yīng)答及腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著重要的關(guān)系［25-27］。人類叉頭框基因家族成員的命名從FOXA 到 FOXS，有著不同的功能與結(jié)構(gòu)［28］。轉(zhuǎn)錄因子FOXC1 屬于叉頭框轉(zhuǎn)錄子基因家族的一員［8-9］。目前FOXC1 蛋白的功能還不是十分清楚，現(xiàn)已有文獻(xiàn)報(bào)道FOXC1 的表達(dá)缺失可促進(jìn)上皮性卵巢癌發(fā)生 EMT［29］。國(guó)內(nèi)有文獻(xiàn)報(bào)道，過(guò)度表達(dá) FOXC1 后膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力明顯增強(qiáng)［10］，但其具體機(jī)制還不甚清楚。

本實(shí)驗(yàn)中，與常氧培養(yǎng)相比，缺氧環(huán)境下培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力明顯增強(qiáng)，F(xiàn)OXC1 的表達(dá)水平明顯上調(diào)，而FOXC1沉默則會(huì)降低N-cadherin、vimentin 表達(dá)，升高E-cadherin 的表達(dá)，抑制了缺氧條件下增強(qiáng)的侵襲能力，證實(shí)了FOXC1 的表達(dá)與膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力息息相關(guān)。其次發(fā)現(xiàn)在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，隨缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)以及加入CoCl2濃度的增加，不僅FOXC1 的表達(dá)水平不斷上調(diào)，HIF-1α、HIF-2α 的表達(dá)水平也逐步上升，由此，猜想 FOXC1 與HIF-1α、HIF-2α 兩者之間存在聯(lián)系。我們分別轉(zhuǎn)染HIF-1α siRNA 和 HIF-2α siRNA 進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染 HIF-1α siRNA 后，F(xiàn)OXC1 蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯變化，但在轉(zhuǎn)染HIF-2α siRNA后，缺氧條件下培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中FOXC1 的蛋白表達(dá)水平較陰性對(duì)照組下降。證實(shí)缺氧環(huán)境下FOXC1 的上調(diào)與HIF-2α表達(dá)相關(guān)，進(jìn)一步驗(yàn)證了缺氧條件下HIF-2α 可以通過(guò)調(diào)控FOXC1 表達(dá)從而改變膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力，明確了HIF-2α/FOXC1調(diào)節(jié)軸在缺氧環(huán)境下膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲中的作用。