★ 鐘倩 朱才豐 宋小鴿 楊駿 潘洪萍 賀成功 楊坤 秦曉鳳（.安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院 合肥 008；.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院老年病三科 合肥 006；.安徽中醫(yī)藥大學(xué)針灸經(jīng)絡(luò)研究所 合肥 008；.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院針灸康復(fù)科 合肥 008）

老年性癡呆，即阿爾茨海默病（alzheimer’s disease，AD），是一種器質(zhì)性精神障礙疾病，主要表現(xiàn)為認知功能的下降，隨著全球人口老齡化步伐加快，本病的發(fā)病率迅速攀升，已經(jīng)日益成為醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)的沉重負擔(dān)［1］。P300認知電位是對認知功能進行評價的的一種客觀方法，是反映大腦對信息加工、處理的一項有用的指標。從當(dāng)前研究來看運用P300認知電位來分析阿爾茨海默病小鼠認知電位變化的機制研究相對不足，因此本實驗從P300事件相關(guān)電位出發(fā)來分析艾灸督脈對AD小鼠的認知功能改善的是否有效。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組實驗采用雄性APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠和同齡同背景的雄性野生型C57BL/6J小鼠，所有小鼠由第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供（許可證號：SCXK（軍）2012-0007，SPF級）。購回后，在通風(fēng)條件良好的清潔級動物房分籠飼養(yǎng)，溫度保持（24±2）℃，每日定時喂養(yǎng)專用飼料及清潔水，環(huán)境設(shè)置為晝夜明暗交替，交替時間為12 h/12 h，飼養(yǎng)1月。

動物分組：購入的雄性AD轉(zhuǎn)基因小鼠和健康野生型雄性C57BL/6J小鼠共計68只，經(jīng)過Morris水迷宮篩選實驗剔除測試成績較差者，剩余健康野生型C57BL/6J小鼠10只，雄性AD轉(zhuǎn)基因小鼠40只。將健康小鼠設(shè)置為正常組，按完全隨機法將40只AD轉(zhuǎn)基因小鼠分為模型組、艾灸組、西藥I組、西藥II組，每組10只。

動物的飼養(yǎng)和實驗程序均經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會批準（參考編號：#AUCM-2017-0216）。實驗過程中，善待實驗動物，避免不必要的傷害或減輕痛苦。

1.2 治療方法正常組：采用同齡同背景健康野生型 C57BL/6J 雄性小鼠10只，常規(guī)飼養(yǎng)，作為空白對照組，不做特殊處理。

模型組：采用10只AD轉(zhuǎn)基因小鼠作為模型組，常規(guī)飼養(yǎng)，作為空白對照組，不做特殊處理。

艾灸組：將AD轉(zhuǎn)基因小鼠固定于自制鼠板上，在保持其清醒狀態(tài)下，根據(jù)“十五”規(guī)劃《實驗針灸學(xué)》［2］取督脈穴“百會”“天門(風(fēng)府)”“大椎”并參照模擬人體解剖學(xué)定位。在“百會”穴上放置直徑2 cm、厚4～6 mm的附子餅，予實按灸使灸火直接實按于附子餅上，待皮膚灼熱潮紅時迅速提起，反復(fù)灸20 min；“天門”“大椎”穴予溫和灸，灸至皮膚局部灼熱潮紅，時間為20min，施灸過程中避免燙傷小鼠。每日治療1次，周期為2周，每周休息1 d。

西藥I組：采用AD轉(zhuǎn)基因小鼠，予腹腔注射雷帕霉素2 mg·kg-1·d-1，1 次/d，療程與艾灸組平行。

西藥II組：采用AD轉(zhuǎn)基因小鼠，艾灸督脈治療的同時予腹腔注射抑制自噬藥物3-甲基腺嘌呤（3 - methlyadenine，3- MA）1.5 mg·kg-1·d-1，1 次/d，療程與艾灸組平行。

1.3 P300電位測定使用丹麥產(chǎn)CounterpointMK2型誘發(fā)電位儀捕捉小鼠頭皮的長潛伏期電位，通過 Neuroscan Nuamps 腦電記錄儀分析及記錄電位變化，Scan 4.3信號處理軟件離線分析腦電數(shù)據(jù)。實驗中于基線、2周后檢測N2潛伏期、P3 潛伏期及P3波幅。正常組及模型組僅于基線時測試。

1.4 數(shù)據(jù)分析實驗結(jié)果均采用均值±標準差（）表示，統(tǒng)計結(jié)果運用Spss 22.0軟件分析，各組數(shù)據(jù)方差齊時采用兩獨立樣本t檢驗，方差不齊采用非參數(shù)檢驗；組內(nèi)治療前后比較采用配對樣本t檢驗；以P＜0.05記為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 治療前各組事件相關(guān)電位比較治療前正常組與模型組、艾灸組、西藥I組、西藥II組的N2潛伏期、P3潛伏期、P3波幅相比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），AD小鼠的N2潛伏期、P3潛伏期均是高于正常小鼠，P3波幅降低；模型組與艾灸組、西藥I組、西藥II組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 治療前各組小鼠N2潛伏期、P3潛伏期、P3波幅比較（n=10）

2.2 治療后各組事件相關(guān)電位比較艾灸組與西藥I組在治療后N2潛伏期較治療前無明顯變化（P＞0.05），P3潛伏期較治療前縮短，P3波幅升高（P＜0.05），說明艾灸督脈與注射雷帕霉素的處理方法均能改善AD小鼠的認識功能；西藥II組治療前后比較N2潛伏期、P3潛伏期、P3波幅均無差異（P＞0.05）；艾灸組與西藥I組在治療后P3潛伏期、P3波幅比較無差異（P＞0.05），說明兩者在改善認知功能方面無較大差別。見表2。

表2 治療后各組小鼠N2潛伏期、P3潛伏期、P3波幅比較（n=10）

3 討論

阿爾茨海默病主要表現(xiàn)為認知功能下降、精神癥狀和行為障礙、日常生活能力的逐漸下降，調(diào)查顯示60歲以上的老人隨著年齡的增長，每往后年長5歲，老年癡呆患者的百分數(shù)將上升2倍，65歲以上老人患老年癡呆的概率是13 %，而85歲以上的老人患該病的概率達到45 %［3］。在古代文獻中，本病多記載為“健忘”“癡呆”，其病機關(guān)鍵是本虛標實、虛實夾雜，多為心、肝、脾、腎等臟腑虧損，運化無力使水濕、痰瘀停結(jié)，阻滯腦絡(luò)，使清空受擾，神機失用而致癡呆。中醫(yī)治療根據(jù)“髓海不足”“氣血虧虛”等虛證分型，“痰濁蒙竅”“瘀血內(nèi)阻”“心肝火旺”等實證分型各有治則治法。西醫(yī)學(xué)目前普遍認為AD的發(fā)生與Aβ生成與清除機制失衡使Aβ沉積過多形成的細胞外老年斑息息相關(guān)，除此還認為過度磷酸化的Tau蛋白也能影響神經(jīng)元及突觸的正常功能［4］。在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療中尚無特效藥物可治愈或有效逆轉(zhuǎn)疾病進程，但可一定程度上減輕癥狀及延緩病情發(fā)展。在改善認知功能上常用乙酰膽堿酯酶抑制劑、N-甲基-D-門冬氨酸受體拮抗劑，并結(jié)合抗抑郁和抗精神病藥物來控制精神癥狀的發(fā)生。在中醫(yī)學(xué)的治療探索中，經(jīng)現(xiàn)代研究證明針刺在減少Aβ沉積、抑制Tau蛋白過度磷酸化、促進中樞神經(jīng)傳遞等方面的具有一定作用，可改善認知功能［5］。

ERP現(xiàn)在研究較多的是P300電位，按性質(zhì)特性歸屬為內(nèi)源性成分，因其不易受外界刺激的物理特性影響，與認知關(guān)系最密切，也被稱為“認知電位”。P300與特定的認知活動相關(guān)，其敏感性和客觀性較神經(jīng)心理學(xué)更高，可以反應(yīng)語言、記憶、執(zhí)行功能域的損害。P300的潛伏期反映了大腦對外界刺激的反映速度，難度大時反應(yīng)速度相應(yīng)增加；P300波幅表明大腦對信息加工時所匹配的有效資源的程度［6］。據(jù)研究表明在癡呆的早期階段，P300較量表而言更能準確識別疾病的發(fā)生，同時也能區(qū)分與癡呆臨床表現(xiàn)相似的假性癡呆患者，且對認知功能藥物的療效也能做出可靠的評估，可作為臨床評估認知功能的一種有效工具［7］。

本實驗中艾灸組小鼠取穴“百會”“天門（風(fēng)府）”“大椎”，三穴選取思路來源于國家級名老中醫(yī)蔡圣朝主任醫(yī)師學(xué)術(shù)思想，認為治療癡呆應(yīng)從從“神-腦-督脈-腎-任脈”軸入手［8］。在治療癡呆時應(yīng)重視督脈取穴：腦為元神之府，督脈“入絡(luò)腦”，如張錫純所言“督脈者，腦髓神經(jīng)之所也”，調(diào)節(jié)督脈可起到安神定志的作用；督脈為“陽脈之海”，任脈為“陰脈之海”，二者均起于胞中，為腎所主，上連與神明之府，在針刺督脈時易于調(diào)動任脈之經(jīng)氣共同作用于腦；且腎“主骨生髓”，腦為“髓?！保矫}之別絡(luò)貫脊屬腎，腎充則髓充，從而補益于腦。督脈將腦、腎、任脈聯(lián)系起來共同作用來補益腦髓、調(diào)控神志的作用。百會穴為督脈要穴，《灸法秘傳》曰：“忘前失后，曰健忘也……病因雖異，皆當(dāng)灸百會一穴而記憶自強矣?！备舾阶语灳哂信嘣瘫?，益氣升陽作用，與百會共奏益腦之效。大椎、風(fēng)府，配合百會取“腧穴所在，主治所在”之意，溫和灸輔之，三穴同用，加強醒腦開竅的作用?，F(xiàn)代實驗研究認為AD大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元體積縮小，數(shù)量減少，而艾灸療法能改善海馬神經(jīng)細胞水腫，促進海馬神經(jīng)細胞修復(fù)，改善大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙［9］。而且在造模前對大鼠進行艾灸預(yù)刺激的研究中也認為預(yù)艾灸組在與模型組大鼠比較中能改善減少大鼠腦內(nèi)cyclin A 和 cyclinB 陽性細胞數(shù)，從而緩解AD的病理改變［10］。在本實驗的前期研究結(jié)果顯示艾灸督脈改善小鼠認知功能的作用機制與提升小鼠腦內(nèi)的細胞自噬水平有關(guān)，可改善因Aβ聚集形成的老年斑及神經(jīng)細胞毒性所導(dǎo)致的腦損傷，有效的阻斷Aβ過度表達引發(fā)的炎性反應(yīng)級聯(lián)效應(yīng)，從而改善小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙［11］。

本實驗中艾灸組小鼠隔附子餅灸“百會”，溫和灸“天門（風(fēng)府）”“大椎”，西藥I組用雷帕霉素腹腔注射給藥，西藥II組在艾灸組治療同時予以3-甲基腺嘌呤腹腔注射給藥；正常組和模型組動物常規(guī)飼養(yǎng)，不予特殊處理，僅進行治療前的P300測定。結(jié)果顯示治療前正常組與模型組相比較：AD小鼠的N2潛伏期、P3潛伏期延長，P3波幅則是較之更低，表明了AD小鼠認知功能的下降，此結(jié)果與大多數(shù)學(xué)者對AD患者的研究結(jié)果是一致的［12-14］。而艾灸組在治療后在P300的測定中表現(xiàn)為P3潛伏期縮短，P3波幅上升，說明艾灸對改善小鼠的認知功能有作用。在西藥I組中雷帕霉素作為新型的大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑，具有高效免疫抑制作用，其通過增強自噬功能，顯著減少腦內(nèi)異常蛋白質(zhì)聚集體，維持腦內(nèi)功能物質(zhì)的動態(tài)平衡，從而抑制神經(jīng)變性過程的發(fā)生來保護腦功能［15］，在P300的測定結(jié)果中與艾灸組結(jié)果相似，間接能推測艾灸發(fā)揮作用于誘導(dǎo)自噬有關(guān)。而3-MA作為經(jīng)典的自噬抑制劑，具有抑制細胞自噬激活的作用［16］，在艾灸的同時采用3-MA腹腔注射治療，兩相作用使艾灸自噬功能降低，從而P300測定表現(xiàn)為治療前后P3潛伏期與P3波幅無明顯改變。

總的來說，艾灸對阿爾茨海默病的作用機理逐漸明朗，臨床運用也越來越多。運用P300事件相關(guān)電位對疾病進行篩查及預(yù)后判斷的研究也逐漸豐富，研究認為在P300測定時發(fā)現(xiàn)阿爾茨海默病可與MCI、額顳葉癡呆、血管性癡呆相區(qū)別，說明P300在認知功能障礙患者診斷中對可以作為AD早期診斷的敏感性較高［17-19］。因此在臨床中可逐漸推廣P300電位研究，從而減少量表評估的單一性。本實驗艾灸組與雷帕霉素組在治療后測定P300顯示能有效縮短AD小鼠P3潛伏期、升高P3波幅，說明艾灸督脈與使用自噬劑雷帕霉素均能改善小鼠認知功能。但本實驗同樣存在樣本量不足的缺點，有待在今后實驗中改進。