★ 姜瓔娜 吉燕華 傅靈艷 張吉日木吐 聶鵬,2 徐國(guó)良,2,3 曾治君,2 劉紅寧,2（.江西中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)基礎(chǔ)理論分化發(fā)展研究中心 南昌 330004；2.江西省中醫(yī)病因?qū)W重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南昌 330004；3.江西省中藥藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南昌 330004）

現(xiàn)代不合理的飲食習(xí)慣引發(fā)的肥胖及代謝性疾病已經(jīng)成為了全球性健康問(wèn)題。由于長(zhǎng)期機(jī)體能量攝入大于能量消耗，脂肪組織緩沖能力不足，導(dǎo)致多余能量無(wú)法以甘油三酯的形式儲(chǔ)存而溢入體循環(huán)，進(jìn)而機(jī)體發(fā)生高脂血癥，外周和肝臟發(fā)生胰島素抵抗最終形成2型糖尿?。?-3］。除了遺傳和生活方式導(dǎo)致的肥胖，越來(lái)越多的學(xué)者將目光聚焦到腸道菌群，腸道菌群可以將不能消化的碳水化合物轉(zhuǎn)化為可消化的能量［4-5］，微生物對(duì)能量代謝的調(diào)節(jié)作用可能是便捷有效的減肥方式，腸道微生物發(fā)酵最終產(chǎn)物為短鏈脂肪酸（SCFAs），其中乙酸、丙酸和丁酸占據(jù)SCFAs含量96%以上，SCFAs含量是評(píng)價(jià)腸道微生物環(huán)境的重要指標(biāo)。大量研究表明SCFAs與能量代謝有關(guān)，其中SCFAs可刺激飽腹感激素產(chǎn)生是其研究最深入的機(jī)制之一，SCFAs可以通過(guò)中樞神經(jīng)系統(tǒng)及相關(guān)機(jī)制刺激瘦素產(chǎn)生，腸腦軸抑制食欲和能量攝入［6-8］；激活棕色脂肪，上調(diào)脂質(zhì)氧化基因增加能量消耗［9］；其中丙酸鹽和丁酸鹽通過(guò)誘導(dǎo)腸道糖異生來(lái)預(yù)防肥胖和胰島素抵抗［10］。

SCFAs與中長(zhǎng)鏈脂肪酸相比，其碳鏈更短，可以快速為腸道細(xì)胞提供能量，同時(shí)由于其易揮發(fā)的特性，人們多運(yùn)用氣相色譜（GC）、氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）等方法進(jìn)行SCFAs的檢測(cè)［11］，本文尋求更簡(jiǎn)便的樣品前處理方法和在大規(guī)模樣品中檢測(cè)SCFAs的方法，首先構(gòu)建氣相色譜法檢測(cè)SD大鼠糞便中SCFAs含量的方法學(xué)，再應(yīng)用該方法檢測(cè)正常和肥胖SD大鼠糞便及盲腸內(nèi)容物SCFAs的含量，并對(duì)比盲腸內(nèi)容物與糞便SCFAs含量的差異。

1 材料

1.1 動(dòng)物3～4周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠20只，體質(zhì)量（180±10）g，購(gòu)自江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技中心，許可證號(hào)：SCXK（贛）2018-0003，飼養(yǎng)于該中心屏障系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室［SYXK（贛）2017-0004］。

1.2 主要試劑與儀器標(biāo)準(zhǔn)品：乙酸（批號(hào)：A801294）、丙酸（批號(hào)：P816182）、丁酸（批號(hào)：B802730）均購(gòu)于麥克林（上海）。儀器：氣相色譜儀Agligent 7890B，配備FID檢測(cè)器（安捷倫，美國(guó)）；超純水儀Millipore Milli-Q Advantage A10（默克，美國(guó)）；小型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（賽默飛，德國(guó)）電子分析天平BT225（賽多利斯，德國(guó)）；渦旋儀（賽默飛，美國(guó)）。

2 方法

2.1 分組及造模20只雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按照體質(zhì)量隨機(jī)分為空白組和模型組（n=10），空白組給予普通飼料（10 %脂肪含量），模型組給予高脂飼料（60 %脂肪含量），以體重超過(guò)正常體重的15 %，Lee’s指數(shù)有顯著差異視為肥胖模型造模成功。

2.2 大鼠糞便、盲腸內(nèi)容物采集糞便：無(wú)菌環(huán)境佩戴一次性手套采集糞便，采集糞便樣品轉(zhuǎn)移至-80 ℃低溫冰箱保存；盲腸內(nèi)容物：剪斷盲腸連接處的腸道并以剪斷處為開(kāi)口，將盲腸內(nèi)容物直接擠出到2.0 mL的無(wú)菌凍存管內(nèi)，并立刻放入液氮后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存。

2.3 樣品制備糞便（盲腸內(nèi)容物）樣品室溫解凍，稱取糞便（盲腸內(nèi)容物）0.30 g± 0.05 g于2.0 mL無(wú)菌EP管中，按1∶5（W∶V）的體積加入1 500 μL的超純水，渦旋30 s，離心4 min（5 000 rpm，25 ℃），取上清液500 μL置于新2.0 mL 無(wú)菌EP管中，加入100 μL 25 %偏磷酸溶液，渦旋30 s，離心15 min（15,000 rpm，25 ℃）過(guò)0.45 μm水系膜，取上清液置于進(jìn)樣小瓶用于氣相色譜（Agilent 7890B）分析。

2.4 氣相色譜條件儀器型號(hào)：Agilent 7890B；色譜 柱：DB-FFAP（30 m×0.25 μm×0.25 mm）；進(jìn)樣口溫度：220 ℃；載氣：高純氮?dú)?，載氣流速1.0 mL/min；檢測(cè)器（FID）溫度：250℃；升溫條件：初始溫度100 ℃，每分鐘升高30 ℃保持6 min；分流模式：不分流。

2.5 SCFAs標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備取乙酸、丙酸、丁酸標(biāo)準(zhǔn)品加入偏磷酸并過(guò)0.45 μm水系膜，配制成1 000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，超純水稀釋為5 μg/mL，10 μg/mL，20 μg/mL，50 μg/mL，100 μg/mL，200 μg/mL，500 μg/mL，800 μg/mL 8個(gè)濃度制作成標(biāo)準(zhǔn)工作液，儲(chǔ)存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2.5.2 空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備選取空白組大鼠糞便作為空白基質(zhì)加入“2.5.1”項(xiàng)下制備的混標(biāo)（V空白基質(zhì)∶ V混標(biāo)=1∶1），配制成8個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液，為了使?jié)舛确秶泳_，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)中樣品乙酸、丙酸、丁酸含量范圍選取濃度梯度制成空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.6 SCFAs含量測(cè)定方法學(xué)考察

2.6.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線取“2.4.1”項(xiàng)下配制的標(biāo)準(zhǔn)品混合工作液進(jìn)入氣相，測(cè)定的結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合回歸方程，橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品濃度，縱坐標(biāo)為不同濃度條件下標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積。最低檢測(cè)限（LOD）與最低定量限（LQD）一般使用信噪比（S/N）表示。國(guó)際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)規(guī)定，被測(cè)物的S/N=3時(shí)的濃度即為L(zhǎng)OD；S/N=10時(shí)的濃度即為L(zhǎng)QD。

2.6.2 基質(zhì)效應(yīng)基質(zhì)效應(yīng)指生物樣品基質(zhì)對(duì)于待測(cè)樣品的干擾，將純標(biāo)準(zhǔn)液標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率作為分母，空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率作為分子，計(jì)算得到基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果為100 %表示沒(méi)有基質(zhì)效應(yīng)，大于100 %表明基質(zhì)對(duì)物質(zhì)的檢測(cè)具有增強(qiáng)信號(hào)的作用，低于100 %表明基質(zhì)對(duì)物質(zhì)的檢測(cè)具有減弱信號(hào)的作用。

2.6.3 準(zhǔn)確度（相對(duì)回收率）準(zhǔn)確度是指采用這種方法測(cè)定的結(jié)果，與真實(shí)值或者參考值比較后接近的程度，一般用相對(duì)回收率表示。方法：取高、中、低三個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品加入空白基質(zhì)后平行進(jìn)樣六次取平均值（中濃度樣品選取與生物樣品濃度一致，分別取其±50 %作為高低濃度，以下選取方式同此一致），代入空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線回算標(biāo)準(zhǔn)品濃度，其結(jié)果與真實(shí)值的比值作為其準(zhǔn)確度。

2.6.4 日內(nèi)和日內(nèi)精密度實(shí)驗(yàn)

2.6.4.1 日內(nèi)精密度實(shí)驗(yàn)24 h內(nèi)選高、中、低三個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品連續(xù)進(jìn)樣6次，每個(gè)濃度配制平行三份樣品作為三組，每組三個(gè)濃度，每個(gè)濃度平行進(jìn)6針，取其平均值計(jì)算RSD（%）值。

2.6.4.2 日間精密度實(shí)驗(yàn)連續(xù)三天，選高、中、低三個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品每天連續(xù)進(jìn)樣6次，每個(gè)濃度配制平行三份樣品作為三組，每組三個(gè)濃度，每個(gè)濃度平行進(jìn)6針，取其平均值計(jì)算RSD（%）值。

2.6.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)考察待測(cè)樣品的能夠穩(wěn)定存放的時(shí)間，考察樣品于-20 ℃以及12 h -4℃/12 h -20 ℃循環(huán)在5天內(nèi)的穩(wěn)定性，測(cè)定于室溫下進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)前樣品平行準(zhǔn)備三份。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 7.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果均以（）表示，兩組之間數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線將“2.5”項(xiàng)下所配制的標(biāo)準(zhǔn)工作液與空白基質(zhì)工作液分別進(jìn)樣，將系列標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)入GC分析，純標(biāo)準(zhǔn)液氣相色譜圖與空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液氣相色譜圖如圖1所示，專屬性結(jié)果、線性結(jié)果如表1、2所示，兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線均顯示乙酸、丙酸、丁酸基線分離度良好，出峰時(shí)間快，測(cè)樣效率高，顯示了良好的相關(guān)性，取信噪比S/N大于3作為方法的檢測(cè)限，S/N大于10作為方法的定量限，見(jiàn)表3。

表1 SCFAs（標(biāo)準(zhǔn)液）的保留時(shí)間、標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍

圖1 氣相色譜圖

3.2 基質(zhì)效應(yīng)通過(guò)基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果得出，基質(zhì)對(duì)于SCFAs檢測(cè)略有增強(qiáng)，但影響較?。?06 %～111 %），見(jiàn)表3。

表2 SCFAs（空白基質(zhì)）的保留時(shí)間、標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍

表3 SCFAs的最低檢測(cè)限（LOD）、最低定量限（LOQ）和基質(zhì)效應(yīng)

3.3 準(zhǔn)確度（相對(duì)回收率）、日內(nèi)及日間精密度測(cè)定如表4所示，乙酸的相對(duì)回收率為104.27 %～ 111.21 %，丙酸的相對(duì)回收率為98.36 %～113.68 %，丁酸的相對(duì)回收率為95.19 %～107.00 %；SCFAs空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液的日內(nèi)及日間精密度為1.94 %～ 3.68 %（n=6）和4.24 %～7.10 %（n=18），表現(xiàn)了較好的日間及日內(nèi)精密度。

表4 SCFAs的準(zhǔn)確度、日內(nèi)、日間精密度

3.4 穩(wěn)定性檢測(cè)待測(cè)樣品5天內(nèi)在-20 ℃以及12 h -4 ℃/12 h -20 ℃循環(huán)溫度下的穩(wěn)定性。分別在第1、3、5天考察2種儲(chǔ)存狀態(tài)下待測(cè)樣品的穩(wěn)定性。-20 ℃存放條件下，3種SCFAs在5天內(nèi)的RSD %均小于6 %，而循環(huán)溫度下前3天中各種酸的RSD%均小于9 %，在兩種儲(chǔ)存條件下，乙酸、丙酸、丁酸儲(chǔ)存在-20 ℃時(shí)在5天內(nèi)表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，在12 h -4 ℃/12 h -20 ℃循環(huán)溫度條件下在3天內(nèi)表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。

3.5 大鼠糞便及盲腸內(nèi)容物檢測(cè)運(yùn)用本文建立的方法學(xué)對(duì)空白組和模型組大鼠的糞便以及盲腸內(nèi)容物進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組大鼠糞便和盲腸內(nèi)容物中乙酸、丙酸、丁酸含量均有顯著性下降（P＜0.01）；兩組大鼠盲腸內(nèi)容物中SCFAs含量均高于糞便中SCFAs含量：盲腸內(nèi)容物與其糞便結(jié)果相比，模型組中乙酸和丙酸含量顯著增加（P＜0.01），空白組中呈現(xiàn)類似結(jié)果，丙酸和丁酸含量顯著增加（P＜0.01、P＜0.05），見(jiàn)圖2；模型組糞便和盲腸內(nèi)容物中乙酸、丙酸和丁酸含量比值分別為10∶3∶4和18∶5.5∶4，在空白組該比值分別為9∶2∶3和7.25∶2∶3.25。與空白組相比，模型組糞便丙酸/丁酸比值上升（P＜0.05），與盲腸內(nèi)容物中比例趨勢(shì)一致（P＜0.01），見(jiàn)表5。

圖2 大鼠糞便和盲腸內(nèi)容物中短鏈脂肪酸含量的變化（，n=10）

表5 大鼠短鏈脂肪酸含量比值（，n=10）

表5 大鼠短鏈脂肪酸含量比值（，n=10）

注：模型組與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

基質(zhì) 組別 乙酸/丙酸/丁酸 乙酸/丙酸 丙酸/丁酸 乙酸/丁酸糞便空白組 9∶2∶3 5.10±2.21 0.68±0.13 3.41±1.54模型組 10∶3∶4 3.63±2.60** 0.90±0.33* 2.76±1.36*空白組 7.25∶2∶3.25 3.65±0.41 0.68±0.22 2.45±0.65模型組 18∶5.5∶4 4.07±2.54* 1.46±1.02** 4.99±2.89**盲腸內(nèi)容物

4 討論

大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，SCFAs通過(guò)多種機(jī)制影響食欲和能量攝入，SCFAs在預(yù)防和治療肥胖相關(guān)的胰島素抵抗方面有著重要作用［12-14］。因此，建立一種快速穩(wěn)定的方法學(xué)來(lái)測(cè)定SCFAs含量有助于后續(xù)研究分析及臨床檢測(cè)。

SCFAs樣品具有揮發(fā)性強(qiáng)，極性大等特點(diǎn)，對(duì)SCFAs樣品前處理的方法有水提法、高速離心法、超濾法、蒸餾法和萃取法等［15-19］。為了快速檢測(cè)大規(guī)模生物樣品，本文采用水提法，該處理方法操作簡(jiǎn)便，省去了衍生化的繁瑣步驟，加快了處理樣品時(shí)間。本研究制備了純標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)工作液和加入空白基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)工作液，其結(jié)果均展現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，通過(guò)計(jì)算兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值得出基質(zhì)效應(yīng)，證明水提法后的基質(zhì)對(duì)后續(xù)含量檢測(cè)略有增強(qiáng)，但影響不大，同時(shí)日內(nèi)、日間精密度的檢測(cè)結(jié)果均顯示此方法可以穩(wěn)定的檢測(cè)糞便以及盲腸內(nèi)容物的SCFAs含量，為了確保生物樣品穩(wěn)定，考察了SCFAs儲(chǔ)存在2種條件下在5天內(nèi)表現(xiàn)出的穩(wěn)定性，SCFAs在-20 ℃條件下至少可以保存5天，而12 h -4 ℃/12 h -20 ℃循環(huán)溫度下可保存3天，故樣品處理后建議低溫保存，且不宜反復(fù)凍融。

SCFAs含量在腸道是一個(gè)動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)的過(guò)程，其比值約為60∶20∶20［20］，其中乙酸含量最高，丙酸與丁酸含量相似，這與本研究方法最后測(cè)得SCFAs含量結(jié)論一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明肥胖組大鼠與正常組相比SCFAs含量均下降，并且SCFAs的動(dòng)態(tài)比值也發(fā)生了變化，其中丙酸與丁酸的比值上升，該比值比較有代表意義，有報(bào)道指出，丙酸與T2D風(fēng)險(xiǎn)增加有因果關(guān)系［21］，而丁酸其衍生物對(duì)腸上皮細(xì)胞的正常生長(zhǎng)發(fā)揮重要作用，此外，丁酸鹽還可以作為結(jié)腸細(xì)胞的燃料來(lái)源，促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡，減少腸道炎癥［22-24］。

盲腸是腸道菌群產(chǎn)生SCFAs主要部位之一，其位于遠(yuǎn)端小腸和結(jié)腸之間，定植足夠數(shù)量并易于獲得的微生物群，微生物發(fā)酵就會(huì)產(chǎn)生大量SCFAs［4］。相比盲腸內(nèi)容物，體外糞便方便易取、無(wú)創(chuàng)傷，還可以及時(shí)反映大鼠生理和病理狀態(tài)，但糞便樣品雜質(zhì)多，因此，干擾性也大。SCFAs的濃度從盲腸遠(yuǎn)端到糞便，在向下的傳遞過(guò)程中有明顯由高到低的變化趨勢(shì)［20］，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示糞便與盲腸內(nèi)容物中SCFAs含量確實(shí)存在差異（P＜0.05），盲腸內(nèi)容物中有更低的乙酸與更高的丁酸。在產(chǎn)生的SCFAs中，只有5 %～10 %隨糞便排出［25］，研究顯示，產(chǎn)生丁酸鹽的微生物群通路PWY-5022與體外糞便丁酸水平的相關(guān)性較差［21］，表明體外糞便丁酸水平不能很好地反映丁酸的生成和吸收，這可能是丁酸在體外糞便中含量下降的原因之一。

綜上所述，本文建立了高效穩(wěn)定的氣相檢測(cè)短鏈脂肪酸方法學(xué)，并應(yīng)用此方法檢測(cè)了正常和肥胖SD大鼠的SCFAs含量，發(fā)現(xiàn)與正常大鼠相比，肥胖SD大鼠的SCFAs含量都顯著降低，相應(yīng)比值也發(fā)生了變化，其中丙酸/丁酸比值上升；同時(shí)也發(fā)現(xiàn)盲腸內(nèi)容物與體外糞便SCFAs的含量與比值均存在差異，所以糞便中的SCFAs是否是微生物產(chǎn)生SCFAs的最佳預(yù)測(cè)因子還存在爭(zhēng)議，但其結(jié)果可以作為腸道產(chǎn)SCFAs含量的參考依據(jù)。