張靜悅 張世恒 楊月明 劉伶

摘要：目的：臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞移植對大鼠心肌病的影響。方法：采用阿霉素誘導(dǎo)大鼠心肌病模型，提取臍血間充質(zhì)干細(xì)胞，尾靜脈注射進(jìn)行治療，10 d后處死大鼠，檢測炎癥介質(zhì)與心肌酶等指標(biāo)。結(jié)果：心肌病模型大鼠心肌組織壞死面積明顯增大，腫瘤壞死因子-a、白介素-6、白介素-10、B型腦鈉利肽、心臟I型膠原含量均顯著升高，肌酸激酶和同工酶、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、乳酸脫氫酶含量均顯著升高。臍血間充質(zhì)干細(xì)胞治療后，大鼠心肌組織壞死面積明顯縮小，腫瘤壞死因子-a、白介素-6、白介素-10、B型腦鈉利肽、心臟I型膠原含量均顯著下降，肌酸激酶和同工酶、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、乳酸脫氫酶含量均顯著下降。結(jié)論：臍血間充質(zhì)干細(xì)胞是治療阿霉素誘導(dǎo)的大鼠心肌病的一種新方法。

關(guān)鍵詞：臍血間充質(zhì)干細(xì)胞，阿霉素，心肌病，心肌功能，移植

臍帶血干細(xì)胞（MSCs）具有多向分化的優(yōu)勢和強(qiáng)大自我更新潛能，且來源豐富、易于采集、對供者無傷害、不受倫理及法律限制、分化性強(qiáng)、免疫原性低等優(yōu)勢，是治療心血管疾病的研究熱點(diǎn)[1]。本研究成功建立了高劑量阿霉素誘導(dǎo)的大鼠心肌病模型，檢測MSCs治療前后血漿細(xì)胞因子水平、心肌I型膠原比例、心肌酶表達(dá)及B型腦鈉利肽（BNP）水平，為MSCs治療心肌病提供臨床依據(jù)?，F(xiàn)報道如下：

1資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

8周齡雄性Wistar-Kyoto大鼠，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。單獨(dú)飼養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水。放置在相對濕度40%～70%、溫度20℃～25℃的房間中，每小時換氣10～15次。光照時間為23：15～11：15 h，光照強(qiáng)度為60～80 lux。隨機(jī)分為WKY對照組（WKY-C）、WKY-ADR模型組（WKY-M）和WKY心肌病治療組（WKY-T），每組20只。WKY-C組給予正常復(fù)合飼料，0.9%生理鹽水腹腔注射，1次/周，共10周。WKY-M組給予正常飼料（不含ADR），腹腔注射阿霉素（ADR），2.5 mg/kg，1次/周，持續(xù)10周。WKY-T組給予正常飼料（不含ADR），腹腔注射ADR，2.5 mg/kg，1次/周，持續(xù)10周，采用尾靜脈注射臍帶血MSCs（108 cells ml，100 μl）。

1.2 MSCs培養(yǎng)

取自無菌條件下自然出生或剖腹產(chǎn)的健康嬰兒。收取臍帶血，肝素抗凝，將臍帶血與D-hanks液按1：1比例混合，慢慢加入淋巴分離液中。稀釋后的臍血和人淋巴細(xì)胞分離液以2000 r/min離心20 min，提取白膜層MSCs。MSCs加入D-hanks液，1000 r/min離心5 min，棄上清。采用低糖DMEM （DMEM-LG，pH7.4）或Mesencult培養(yǎng)基培養(yǎng)。繪制原代臍血MSCs和P2臍血MSCs的生長曲線。在倒置顯微鏡下對培養(yǎng)的臍帶血MSCs進(jìn)行觀察和拍照。選擇生長良好的P2臍血間充質(zhì)干細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，CD11b、CD29、CD34、CD45、CD90熒光標(biāo)記，流式細(xì)胞儀分析染色細(xì)胞。

1.3 大鼠心功能測定

腹腔注射戊巴比妥鈉溶液（35 mg/kg）麻醉法術(shù)。測量大鼠心功能，包括左心室舒張末期尺寸（LVEDd）、左心室收縮舒張末期內(nèi)徑（LVESd）、左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）和左心室短縮率（LVFS）。

1.4 HE染色

取心臟標(biāo)本，10%福爾馬林固定，包埋，切成4 μm薄片。蘇沐瑾和伊紅染色分析。

1.5 ELISA檢測

大鼠眼眶取血，110 g離心10 min，-20℃保存。ELISA試劑盒檢測腫瘤壞死因子-a（TNF-a）、白介素-6（IL-6）、白介素-10（IL-10）、B型腦納肽（BNP）、心臟I型膠原含量。

1.6 心肌酶檢測

試劑盒購自南京建成生物工程研究所，檢測心肌天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶（CK）和同工酶（CK- mb）含量。

1.7 Masson染色

試劑盒購自上海波谷生物技術(shù)有限公司。Masson染色觀察心肌膠原。

2統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)均以平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差（SEM）表示。采用GraPHPad Prism，students雙尾未配對t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3結(jié)果

3.1 MSCs鑒定

原代培養(yǎng)7 d后，臍血間充質(zhì)干細(xì)胞由圓形變?yōu)樗笮?。隨著培養(yǎng)時間的延長，貼壁生長細(xì)胞逐漸減少，形成集落，細(xì)胞呈漩渦狀排列。4周后臍血MSCs可融合成單層細(xì)胞，5～7 d即可基本覆蓋瓶底。P2的MSCs形態(tài)均勻，沒有明顯變化（見圖1A）。MSCs接種后第1 d和第2 d細(xì)胞增殖無明顯變化。從第三天起MSCs細(xì)胞的數(shù)量急劇增加，呈現(xiàn)對數(shù)生長，在6～7 d達(dá)到增長高峰。原代和P2細(xì)胞的生長曲線基本一致，表明傳代后細(xì)胞仍能保持良好的生長速率（見圖1B）。此外，這些MSCs均呈CD11b、CD29、CD90陽性表達(dá)，CD34、CD45表達(dá)陰性，并有向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和肌肉細(xì)胞分化的潛能（見圖1C）。

3.2 WKY-C組與模型組左室各指標(biāo)對比

排除在建立心肌病模型過程中死亡的大鼠。模型組動物在心肌病發(fā)生10周后，左室LVEDd、LVESd、LVEF、LVFS高與WKY-C組（P<0.01），提示心功能下降。見表1。

3.3 造模前后因子表達(dá)變化

與WKY-C組相比，WKY-M組大鼠心臟心臟I型膠原含量、BNP水平、心臟AST水平、LDH、心肌酶CK、CK-mb、IL-6、IL-10、TNF-a水平均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.5）。

3.4 MSCs移植后心功能變化

與WKY-C組相比，模型組動物左室各指標(biāo)升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），MSCs移植后，左室各指標(biāo)均下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），提示心功能恢復(fù)。

3.5 MSCs移植后因子變化

與WKY-C組相比，WKY-M組大鼠心臟I型膠原含量水平升高（P<0.01），MSCs移植后，大鼠心臟I型膠原含量水平降低（P<0.5）。與WKY-C組相比，WKY-M組大鼠心臟BNP水平升高（P<0.01），MSCs移植后，大鼠心臟BNP水平降低（P<0.5）。與WKY-C組相比，WKY-M組大鼠心臟AST水平、LDH水平、心肌酶CK、CK-mb水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.5），MSCs移植后均降低。與WKY-C組相比，WKY-M組大鼠血清炎癥介質(zhì)IL-6、IL-10、TNF-a水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.5），MSCs移植后均降低（P<0.5）。

4討論

ADR誘導(dǎo)心肌病模型的病理、血流動力學(xué)和激素變化與人類充血性心力衰竭的表現(xiàn)類似。因此，本研究建立了ADR心肌病大鼠模型，為分析心肌病的發(fā)病機(jī)制、心力衰竭及新的治療措施提供基礎(chǔ)[2]。

心臟膠原蛋白是心臟間質(zhì)的重要成分，其形態(tài)改變以及各種膠原蛋白的比例變化對心臟功能也有重要影響。許多心臟病與膠原蛋白比例失衡密切相關(guān)，目前，心肌膠原蛋白的形態(tài)結(jié)構(gòu)、調(diào)控機(jī)制以及與心肌功能的關(guān)系已引起國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，WKY-M誘導(dǎo)心臟I型膠原水平升高，說明心臟功能下降。

BNP是目前診斷心肌病最有效的血清學(xué)指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)，與WKY-C組相比，WKY-M組血清BNP升高。同時，WKY-M組心肌組織壞死面積明顯增大。血清心肌酶的測定對心肌病的診斷和治療評價具有重要價值。ADR導(dǎo)致心肌酶CK、CK-mb、AST和LDH水平升高，與心功能下降結(jié)果相一致。WKY-M組心肌病導(dǎo)致血清促炎因子IL-6、TNF-a和抗炎因子IL-10水平升高。提示心肌病可誘導(dǎo)促炎和抗炎因子失衡，從而介導(dǎo)免疫或炎癥反應(yīng)。

研究結(jié)果顯示，臍血MSCs移植可以改善受損心臟局部和整體的收縮或舒張功能。目前，移植細(xì)胞改善心臟功能的機(jī)制尚不清楚，其機(jī)制可能是臍血間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)心肌再生和旁分泌效應(yīng)。

參考文獻(xiàn)

[1]韓小改，李建斌，單泓，等.兩種狀態(tài)臍血間充質(zhì)干細(xì)胞移植對腦梗死大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)的對比研究[J].中國組織工程研究，2018，22（9）：1395-1401.

[2]柳爽爽，王本臻，毛成剛，等.人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體對多柔比星致擴(kuò)張型心肌病大鼠心肌纖維化的影響[J].中華實(shí)用兒科臨床雜志，2020，35（11）：842-846.