陳智偉 姚栩 謝乃鴻 陳艷 張曉陽(yáng)

摘要：目的 全基因組測(cè)序用于福州地區(qū)2019新冠病毒（nCov-2019）病原的基因組進(jìn)化分析。方法 構(gòu)建捕獲法-病毒全基因組測(cè)序方法，利用Tn5酶能夠設(shè)別切割雙鏈DNA并掛上特定標(biāo)簽的特性構(gòu)建SARS-cov2的測(cè)序文庫(kù)，使用MiSeq進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果 我們對(duì)5例CT值低于35的新冠核酸陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行建庫(kù)，獲得3株（FZ20LG957、FZ20LG1462和FZ20LG398）覆蓋率大于95%的病毒株序列。討論 課題數(shù)據(jù)可用于提高新型冠狀病毒監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)的監(jiān)測(cè)能力。

【中圖分類(lèi)號(hào)】R563.1 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1673-9026（2021）07-409-01

介紹

2019年12月，中國(guó)湖北省武漢市出現(xiàn)了一種新型冠狀病毒[1]被指定為嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥冠狀病毒2（SARS-CoV-2），該疾病被稱(chēng)為冠狀病毒病2019（COVID-19）。世界衛(wèi)生組織宣布該疾病為國(guó)際關(guān)注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件[2]，該項(xiàng)研究中，我們進(jìn)行全基因組測(cè)序，并應(yīng)用于SARS-CoV-2的臨床標(biāo)本。

方法

標(biāo)本采集

標(biāo)本的收集與前處理：收集福州地區(qū)新型冠狀病毒qPCR陽(yáng)性的標(biāo)本5份，進(jìn)行RNA提取并采用Random引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄（去人基因組gRNA的試劑）。

構(gòu)建捕獲法-病毒全基因組測(cè)序方法

利用多重?cái)U(kuò)增方案快速擴(kuò)增新冠病毒的全基因組序列，利用Tn5酶能夠設(shè)別切割雙鏈DNA并掛上特定標(biāo)簽的特性構(gòu)建SARS-cov2的測(cè)序文庫(kù)，使用MiSeq進(jìn)行測(cè)序，并對(duì)下機(jī)數(shù)據(jù)通過(guò)生物信息學(xué)方法進(jìn)行分析獲得福州地區(qū)SARS-cov2的全基因組序列。將福州地區(qū)的序列信息與各地公開(kāi)數(shù)據(jù)比對(duì)探索福州地區(qū)新冠肺炎病人的來(lái)源。

系統(tǒng)發(fā)育和序列分析

結(jié)果：

我們采集的5份新冠核酸陽(yáng)性標(biāo)本，進(jìn)行測(cè)序建庫(kù)，其中覆蓋率高于95%的病毒有三株分別是FZ20LG957、FZ20LG1462和FZ20LG398。我們進(jìn)一步下載了所有完整和高覆蓋率的基因組截至2020年3月14日來(lái)自GISAID的序列。一株參考菌株（登錄號(hào)MN908947.3）從GenBank（NCBI）下載。使用MAFFT對(duì)3個(gè)序列進(jìn)行比對(duì)（版本7.427）進(jìn)行進(jìn)一步分析。系統(tǒng)發(fā)育系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示福州的SARS-CoV-2病毒基因組位于和武漢標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)化枝中（圖1）。這三株的與武漢新冠標(biāo)準(zhǔn)株的同源性高達(dá)99.5%、99.2%和98.9%。最分散的應(yīng)變3個(gè)福州病毒序列中有FZ20LG957，顯示9個(gè)核苷酸變化（與FZ20LG1462相比）（導(dǎo)致5個(gè)氨基酸變化）。值得注意的是，我們?cè)诨蚪M位置27，848-發(fā)現(xiàn)了32個(gè)核苷酸（nt）序列的缺失FZ20LG1462中的27，894-27，927。

圖1. FZ20LG957、FZ20LG1462和FZ20LG398三株新冠病毒株基因組進(jìn)化分析

討論

這項(xiàng)研究完成了3株病毒株基因組測(cè)序。利用MAGE-X軟件中的Neighbor-Joining tree構(gòu)建溯源樹(shù)探究福州地區(qū)主要的病毒來(lái)源地區(qū)。通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析表明這些序列位于不同的進(jìn)化枝，根據(jù)測(cè)序獲得的序列和已公開(kāi)序列構(gòu)建fasta格式文件。3個(gè)基因組中觀察到更少的核苷酸差異。我們檢測(cè)到一個(gè)32 nt缺失，幾乎覆蓋了該序列的整個(gè)開(kāi)放閱讀框。一個(gè)相似的據(jù)報(bào)道，新加坡有8名住院患者接受了觀察。在SARS冠狀病毒2003年爆發(fā)期間，觀察到ORF8缺失，這與減少人細(xì)胞中病毒復(fù)制的能力[3-4]?；蚪M這些病毒的變異被認(rèn)為有助于成功適應(yīng)環(huán)境。進(jìn)一步的研究是需要調(diào)查SARS-CoV-2 nsp14在復(fù)制保真度中的功能[5]。從不同位置及時(shí)共享SASR-CoV-2的完整基因組對(duì)于監(jiān)測(cè)病毒的遺傳變化，這些變化可能與病毒傳播和臨床表現(xiàn)[6]。我們確定了福州不同地區(qū)的SARS-CoV-2序列進(jìn)化枝。

參考文獻(xiàn)：

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福州市科技局新冠肺炎項(xiàng)目 020-XG-026

作者簡(jiǎn)介：陳智偉（1979-），男，博士研究生，主管技師，分子病毒學(xué)