胡鵬鈺，于俊娟，王鵬，張臣臣，康文麗，戴智勇，汪家琦，潘麗娜，顧瑞霞*

1(江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(揚(yáng)州大學(xué)), 江蘇 揚(yáng)州，225127)2(揚(yáng)州大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院, 江蘇 揚(yáng)州，225127)3(澳優(yōu)乳業(yè)(中國)有限公司 澳優(yōu)食品與營養(yǎng)研究院，湖南 長沙，410000)

益生菌為一類在攝入適當(dāng)數(shù)量后會(huì)對宿主機(jī)體產(chǎn)生益處的活體微生物，篩選具有益生功能特性的優(yōu)良益生菌菌株已經(jīng)成為了研究熱點(diǎn)[1]。

2003年首次從母乳中分離出乳酸菌之前，早期研究人員認(rèn)為母乳可能是無菌液體[2]。隨著研究的進(jìn)行，人們認(rèn)識(shí)到母乳是嬰兒腸道菌群的重要來源。母乳是嬰兒最適宜的天然食物，不僅為嬰兒生長發(fā)育提供獨(dú)特而又均衡的營養(yǎng)物質(zhì)，而且其中的人乳低聚糖是益生乳酸菌的選擇培養(yǎng)物質(zhì)，維持著嬰兒腸道菌群的健康發(fā)育。嬰兒腸道內(nèi)的益生菌群與母乳益生菌群具有相似性，相比其他來源的益生菌，母嬰來源的益生菌更加安全，且具有更好的抑菌、抗感染、促進(jìn)腸道健康的活性[3-4]。

近年來，人乳源益生菌正受到越來越多的關(guān)注，研究人員開始從不同地區(qū)的母乳中分離益生菌，并研究其耐酸耐膽鹽、黏附性、抗生素耐受、抑制病原菌、吸收重金屬、降解霉菌毒素、緩解兒童肥胖等的潛在功能特性[5-6]。2014年，通過對德國和奧地利的66份母乳樣品的研究，發(fā)現(xiàn)母乳中的益生菌占到母乳中所有菌類的92%，其中，乳桿菌占66%，包括唾液乳桿菌(Lactobacillussalivarius)，發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)等；雙歧桿菌占26%，包括短雙歧桿菌(Bifidobacteriumbreve)和長雙歧桿菌(Bifidobacteriumloungum)等[7]。國外對母乳來源益生菌篩選的研究越來越多，而國內(nèi)相關(guān)的研究處于起步階段。

本研究以母乳為分離源篩選乳酸菌，評價(jià)其胃腸道環(huán)境耐受能力、抗生素耐受能力和抑菌能力，以期獲得自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的優(yōu)質(zhì)乳酸菌菌株。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

母乳樣品采集自湖南地區(qū)的健康婦女。采樣前志愿者先戴好一次性無菌手套，使用無菌水清洗單側(cè)乳頭及周圍皮膚，丟棄第一滴母乳，收集4～5 mL左右母乳置于5 mL、體積分?jǐn)?shù)為30%甘油的無菌離心管中，做好標(biāo)記，放入裝有干冰的泡沫箱中，立即送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離，隨后樣品及時(shí)保存于-80 ℃超低溫冰箱中。

1.2 材料與試劑

莫匹羅星鋰鹽、半胱氨酸鹽酸鹽溶液、2.5 L圓底立式厭氧袋、2.5 L厭氧產(chǎn)氣包，青島海博生物；胃蛋白酶(1∶10 000)、細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒，生工生物工程(上海)股份有限公司；牛膽鹽，北京索萊寶科技有限公司；2×TaqPCR MasterMix，寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)Marker，南京維諾贊生物科技有限公司；常用藥敏試紙，杭州濱和微生物試劑有限公司。

人工胃液：0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))NaCl，0.3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))胃蛋白酶(1∶10 000)，用1 mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)pH至2.5。

LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，NaCl 10，酵母膏5。

莫匹羅星鋰鹽和半胱氨酸鹽酸鹽溶液改良 MRS培養(yǎng)基：按照GB 4789.35—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》配制。

大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)、傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphi)、假單胞菌(Pseudomonasbrenneri)，揚(yáng)州大學(xué)江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 儀器與設(shè)備

1510型分光光度計(jì)，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；5424R型臺(tái)式冷凍離心機(jī)，艾本德中國有限公司；JF-SX-500型全自動(dòng)滅菌鍋，日本TOMY公司；SW-CJ-1F型超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；SPX-150BSH型生化培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；Nexus+x2eco型PCR儀，德國艾本德公司；3026型凝膠圖像分析系統(tǒng)，法國VILBER公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 雙歧桿菌菌株的培養(yǎng)

菌株液體厭氧培養(yǎng)：改良MRS液體培養(yǎng)基經(jīng)高溫滅菌后，立即在液體培養(yǎng)基上封滅菌液體石蠟，溫度降至常溫時(shí)添加莫匹羅星鋰鹽和L-半胱氨酸鹽酸鹽溶液，進(jìn)行接種，于厭氧袋中培養(yǎng)。

菌株固體厭氧培養(yǎng)(平板計(jì)數(shù))：MRS液體培養(yǎng)基經(jīng)高溫滅菌后，立即在固體培養(yǎng)基中添加莫匹羅星鋰鹽和L-半胱氨酸鹽酸鹽溶液，傾注時(shí)采用雙層傾注法，即菌液傾注于固體培養(yǎng)基，凝固后在培養(yǎng)基表面覆蓋一層培養(yǎng)基以隔絕氧氣，于厭氧袋中培養(yǎng)。

1.4.2 菌株的分離純化

將采集到的母乳樣品做梯度稀釋，選取合適的稀釋梯度傾注于MRS固體培養(yǎng)基和雙層傾注于改良MRS固體培養(yǎng)基中，分別常規(guī)培養(yǎng)和厭氧培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)24～48 h至長出單菌落，挑選具有乳酸菌形態(tài)的單菌落，劃線接種于含溴甲酚紫的MRS固體培養(yǎng)基和改良MRS培養(yǎng)基中進(jìn)行產(chǎn)酸復(fù)篩，培養(yǎng)48 h，長出單菌落經(jīng)革蘭氏染色后在顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，挑選具有乳桿菌和典型雙歧桿菌形態(tài)的菌株。

1.4.3 16S rDNA鑒定

利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株的DNA，將提取的菌株基因組DNA作為PCR的模板進(jìn)行擴(kuò)增，乳桿菌引物為通用引物(27F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；1492R:GGTTACCTTGTTACGA-CTT)，雙歧桿菌引物為特異性測序引物(Bif164-f：GGGTGGTAATGCCGGATG；PbiR2：GACCATGCACCACCTGTGAA)[8]，電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物后，送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測序。綜合測序峰圖將測序結(jié)果截取800 bp的區(qū)域；通過BLAST程序(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome)與GenBank基因庫進(jìn)行比對得出結(jié)果。

1.4.4 菌株對人工胃液耐受能力的測定

將菌株按3%的接種量接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h后，離心收集菌體，用滅菌的PBS緩沖液將菌體洗滌2次后懸浮，取1.0 mL的菌懸液接種至9.0 mL的pH 2.5人工胃液，37 ℃培養(yǎng)3 h，分別在0 h和3 h利用平板計(jì)數(shù)法測定活菌數(shù)，存活率計(jì)算如公式(1)所示。每組重復(fù)3次。

(1)

1.4.5 菌株對膽鹽耐受能力的測定

將菌株按3%的接種量接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h后，離心收集菌體，用滅菌的PBS緩沖液將菌體洗滌2次后懸浮，取1.0 mL的菌懸液接種至9.0 mL的0.1%膽鹽的MRS培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)3 h，分別在0 h和3 h用平板計(jì)數(shù)法測定活菌數(shù)，存活率計(jì)算如公式(1)所示。每組重復(fù)3次。

1.4.6 菌株對抗生素耐藥性測定

采用藥敏紙片瓊脂擴(kuò)散法檢測益生菌對抗生素的耐藥性，選取12種抗生素包括利福平，氨芐西林，萬古霉素，復(fù)方新諾明，環(huán)丙沙星，頭孢拉定，頭孢唑林，克拉霉素，青霉素P，氯霉素，鏈霉素，四環(huán)素。吸取0.1 mL菌懸液(1×108～1×109CFU/mL)涂布到15.0 mL MRS瓊脂培養(yǎng)基表面，待完全吸收后，將藥敏紙片貼放表面，每個(gè)培養(yǎng)基貼3片，于37 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)48 h，然后測量并記錄抑菌圈直徑，所得結(jié)果由表1進(jìn)行判斷，每個(gè)菌株重復(fù)2次。

表1 美國CLSI抗微生物藥物敏感試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)Table 1 American CLSI antimicrobial drug sensitivity test executive standard

1.4.7 菌株抑菌能力測定

選取大腸埃希氏菌，金黃色葡萄球菌等6種致病菌作為指示菌，采用牛津杯法測定菌株對致病菌的抑制作用。在平板底部傾倒薄層水瓊脂；將致病菌于LB液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)24 h，取0.1 mL的致病菌菌液涂布于30 mL LB固體培養(yǎng)基表面。在水平放置的平板中均勻地放置滅菌的牛津杯，吸取0.2 mL待測菌菌懸液(1×107CFU/mL)于牛津杯中。將平板放置4 ℃冰箱中擴(kuò)散24 h，然后在37 ℃中培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈大小，每個(gè)菌株重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌株的形態(tài)和鑒定結(jié)果

從母乳來源樣品中共分離出69個(gè)菌株，經(jīng)純化后在MRS培養(yǎng)基和改良MRS培養(yǎng)基上菌落形態(tài)呈白色且表面光滑；經(jīng)革蘭氏染色后，初篩得到25株革蘭氏陽性菌。通過NCBI Blast比對，結(jié)合菌株鏡檢形態(tài)和來源，初步確定22株菌株為乳桿菌，其中包括11株鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)，8株副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)，1株干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)，1株發(fā)酵乳桿菌，1株植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)。3株菌株為雙歧桿菌，其中包括1株短雙歧桿菌和2株兩歧雙歧桿菌(Bifidobacteriumbifidum)(表2)。

表2 菌株16S rDNA序列同源性Table 2 Homology of 16S rDNA sequence

2.2 菌株對人工胃液的耐受能力

益生菌從人的口腔進(jìn)入到消化道后，胃中的胃液形成的強(qiáng)酸環(huán)境對益生菌的脅迫能力最強(qiáng)，只有少數(shù)耐酸能力強(qiáng)的菌株才能存活并發(fā)揮益生作用。因此，研究益生菌在胃液中受到強(qiáng)酸脅迫時(shí)的生長情況對提高在人體內(nèi)的活菌數(shù)量和存活時(shí)間具有重要意義[9-10]。由表3可知，從母乳來源中分離出的22株乳桿菌均具有一定的耐酸能力，其中除菌株M33以外，其余桿菌表現(xiàn)出較好的耐酸能力；3株雙歧桿菌存活率都>50%。REIS等[11]從6份母乳樣品中分離出33株乳酸菌，其中71%菌株在pH 3.0的人工胃液中3 h后存活，只有2株糞腸球菌在pH 2.0和pH 2.5中存活。張歡暢[12]從母乳樣品中分離出的2株植物乳桿菌在pH 3.0的人工胃液中培養(yǎng)3 h后，活菌數(shù)>1×107CFU/mL。鄭麗君等[13]從嬰兒糞便中分離出5株乳酸菌在pH 3.0人工胃液中培養(yǎng)2 h后活菌數(shù)達(dá)到了1×108CFU/mL。本研究中25株乳酸菌在pH 2.5人工胃液中培養(yǎng)3 h后有16株乳酸菌存活率>70%。

表3 菌株對pH 2.5人工胃液的耐受能力Table 3 Tolerance of strain to pH 2.5 artificial gastric juice

2.3 菌株對膽鹽的耐受能力

益生菌經(jīng)過胃的消化后進(jìn)入小腸會(huì)受到高膽鹽的脅迫，因此研究益生菌的耐膽鹽能力是益生菌在腸道內(nèi)發(fā)揮益生作用的標(biāo)準(zhǔn)之一[14]。由表4可知，乳桿菌M53，M60，M71，M113培養(yǎng)3 h后活菌數(shù)>1×106CFU/mL，其中菌株M53存活率最高，達(dá)到了45.72%；其余乳桿菌菌株存活率均<1%。楊焱炯等[15]從健康嬰兒和青年糞便中分離出的乳桿菌和雙歧桿菌在0.1%膽鹽中培養(yǎng)2 h后下降2個(gè)數(shù)量級(jí)，與本研究結(jié)果基本一致。AWASTI等[16]從印度健康母乳，嬰兒和成人糞便中分離出假鏈狀雙歧桿菌，短雙歧桿菌和動(dòng)物雙歧桿菌，其中3株短雙歧桿菌耐膽鹽能力最強(qiáng)，與本研究結(jié)果基本一致，短雙歧桿菌grx05存活率最高，達(dá)到了75.54%。

表4 菌株對膽鹽耐受能力Table 4 Tolerance of strain to bile salt

2.4 菌株對抗生素的耐藥性

根據(jù)上述結(jié)果，確定對菌株M53、M60、M71、M113、grx05、S16、S18進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)?？股乜梢詺缬泻?xì)菌從而達(dá)到治療疾病的作用，因此被廣泛應(yīng)用到食品行業(yè)中。隨著抗生素被廣泛使用，甚至濫用，益生菌在抗生素的選擇壓力下逐漸產(chǎn)生耐藥性，并且益生菌的耐藥基因也可能轉(zhuǎn)移到其他腸道菌群和致病菌中，對人類的健康造成威脅[17]。RIAZ RAJOKA等[18]研究發(fā)現(xiàn)從母乳中分離出的7株鼠李糖乳桿菌對鏈霉素，氨芐西林，慶大霉素，卡那霉素，青霉素，頭孢毒素和環(huán)丙沙星耐藥。D′AIMMO等[19]研究發(fā)現(xiàn)從商業(yè)乳制品和藥品中分離出的雙歧桿菌對卡那霉素，慶大霉素，鏈霉素，多黏菌素b，萘啶酸，巴龍霉素和新霉素具有耐藥性，對青霉素P，氯霉素，潔霉素，桿菌肽和萬古霉素不具有耐藥性。參照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)抗微生物藥物敏感試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)，本文對篩選到的7株菌進(jìn)行耐藥性測試，結(jié)果表明不同樣品來源的同種菌株在耐藥性方面存在差異。其中4株乳桿菌對頭孢類，利福平和氯霉素敏感，菌株M71同時(shí)對氨芐西林，青霉素，克拉霉素和四環(huán)素敏感，與鼠李糖乳桿菌(LactobacillusrhamnosusGG，LGG)有9種抗生素耐藥性相同，具有良好的安全性。3株雙歧桿菌對萬古霉素，頭孢類和氯霉素敏感，其中g(shù)rx05同時(shí)對利福平，氨芐西林，環(huán)丙沙星和青霉素敏感，較D′AIMMO等[19]的研究菌株更加安全，這可能與雙歧桿菌的來源有關(guān)。

表5 菌株對抗生素耐藥性Table 5 Resistance to antibiotics

2.5 菌株抑菌能力

益生菌進(jìn)入人體后黏附在機(jī)體胃腸道，產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物包括有機(jī)酸、抑菌蛋白類，脂肽類和細(xì)菌素類等物質(zhì)對抑制有害菌增殖起重要的作用[20]。YANG等[21]研究發(fā)現(xiàn)從泡菜中分離出的乳酸乳球菌能夠產(chǎn)生細(xì)菌素類物質(zhì)，從而達(dá)到抑制金黃色葡萄球菌的目的。DELCARU等[22]研究發(fā)現(xiàn)從健康嬰兒糞便中分離出的4株雙歧桿菌對從嬰兒糞便分離出的大腸埃希氏菌具有明顯的抑制作用。由表6可知，本文從母乳中分離出的鼠李糖乳桿菌和雙歧桿菌對3株革蘭氏陽性菌均具有明顯的抑制效果，抑菌圈直徑均>15 mm，其中菌株M113對蠟樣芽胞桿菌有一定的抑制能力，抑菌圈直徑為5～10 mm，可以有效抑制腸道內(nèi)病原微生物的生長，其余菌株對蠟樣芽胞桿菌沒有抑制效果，而LGG可以有效抑制蠟樣芽胞桿菌的生長。雙歧桿菌對金黃色葡萄球菌抑制效果較弱。因此組合使用不同菌株更有利于防治細(xì)菌引起的嬰兒腹瀉。

表6 菌株對致病菌抑制能力Table 6 Inhibition ability of strains to pathogenic bacteria

3 結(jié)論

本研究利用選擇培養(yǎng)基從湖南地區(qū)健康婦女的母乳中分離篩選出22株乳桿菌和3株雙歧桿菌菌株。除乳桿菌M33外，其余菌株都表現(xiàn)出較好的耐酸能力；鼠李糖乳桿菌M53和M60，副干酪乳桿菌M71，植物乳桿菌M113和3株雙歧桿菌在0.1%膽鹽脅迫3 h后存活率較高，其中短雙歧桿菌菌株grx05存活率最高，達(dá)到了75.54%。4株乳桿菌對頭孢類，利福平和氯霉素敏感，3株雙歧桿菌對萬古霉素，青霉素P和氯霉素敏感，菌株M71和grx05對8種抗生素敏感，具有較高的安全性；4株乳桿菌和3株雙歧桿菌對3株革蘭氏陽性菌和1株革蘭氏陰性菌具有明顯抑制能力，而3株雙歧桿菌對金黃色葡萄球菌和蠟樣芽胞桿菌沒有抑制效果。綜合而言鼠李糖乳桿菌M53和短雙歧桿菌grx05具有良好的益生特性，可作為有潛力的菌株進(jìn)行下一步的研究和開發(fā)。