肖嵐，李娟，孟金蕾

1(四川旅游學院 食品學院，四川 成都，610100)2(成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學院，四川 成都，610000)

大蒜(AlliumsatirumL．)俗稱蒜、大蒜頭，為百合科蔥屬多年生草本植物[1]。近幾年，廣大學者對大蒜的生物活性進行了深入研究，證實大蒜具有多方面的生物活性，如降血脂作用[2-3]，抗心肌缺血作用[4-5]，抗氧化、清除自由基作用[6-7]，抗腫瘤作用[8-9]，抗病原微生物的作用[10]等，大蒜的生物活性與大蒜中的含硫化合物(蒜氨酸、大蒜辣素、大蒜素)密切相關(guān)[11]，而大蒜中含硫化合物的存在正是大蒜辛辣刺激性風味的主要形成原因[12]。陳海濤等[12]采用溶劑輔助風味蒸發(fā)方法結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對新鮮大蒜和炸蒜油的揮發(fā)性風味成分進行分析，發(fā)現(xiàn)新鮮大蒜關(guān)鍵性風味成分主要為含硫雜環(huán)化合物和硫醚類化合物；炸蒜油關(guān)鍵性風味成分主要為雜環(huán)化合物、硫醚類化合物和醛類，并且由于炸蒜油中雜環(huán)類、醚類化合物的含量相較于新鮮大蒜中的有所下降，導致刺激性辛辣味減弱。劉春菊等[13]采用固相微萃取和GC-MS分析新鮮大蒜、醋浸后大蒜中揮發(fā)性風味成分的變化。結(jié)果表明，新鮮大蒜的風味主要由含硫化合物貢獻，經(jīng)過醋浸后大蒜中的含硫化合物在數(shù)量和相對含量上均有所減少，而相應的醇類、醛類、酮類和酯類化合物的數(shù)量和相對含量都相應增加，因此醋浸大蒜的辛辣刺激性氣味有所降低。陸俊等[14]研究發(fā)現(xiàn)，微生物發(fā)酵能去除大蒜中的蒜臭味，發(fā)酵 45 d后的大蒜其蒜味已經(jīng)明顯降低,且有一種淡淡的香味，大蒜辣味由辣變成不辣，其原因可能與微生物轉(zhuǎn)化大蒜素，大蒜素含量的下降和大蒜中蒜酶的降解有關(guān)。

綜上，部分人難以接受大蒜的辛辣刺激性風味，但又希望長期食用大蒜防病保健，因此大蒜制品推陳出新，開發(fā)出了大蒜凍干粉及制劑、大蒜素、大蒜提取物(蒜氨酸、蒜氨酸酶)等產(chǎn)品[15-17]，但是普通老百姓更喜愛食用傳統(tǒng)大蒜食品來防病保健，例如老壇泡蒜、糖醋蒜、臘八蒜等。以上 3 種傳統(tǒng)大蒜食品均采用腌制工藝制備，然而腌制過程中有無發(fā)酵、發(fā)酵程度以及腌制時間、腌制時使用的調(diào)味料均有可能影響大蒜的風味以及生物活性物質(zhì)含量。目前，關(guān)于老壇泡蒜、糖醋蒜、臘八蒜中生物活性物質(zhì)含量與其風味的關(guān)系的研究報道鮮見。因此，本研究采用四川壇泡咸大蒜、糖醋蒜、臘八蒜以及完整鮮大蒜(陽性對照)為樣品，比較研究其風味特征以及生物活性物質(zhì)含量，并找出活性物質(zhì)含量與其風味的關(guān)系。本研究結(jié)果旨在了解傳統(tǒng)腌制大蒜食品的風味特征以及活性成分含量，篩選出刺激性氣味小且活性成分含量高的腌制大蒜制品，為更好地利用大蒜資源，開發(fā)大蒜功能保健食品提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

食鹽，中鹽上海市鹽業(yè)公司；白砂糖，成都市糖酒有限責任公司；釀造米醋，李錦記食品有限公司；色譜級甲醇、乙腈，德國默克公司；蒜氨酸標準品，上海Sigma公司；植物蒜氨酶酶聯(lián)免疫分析試劑盒，江蘇科特生物科技有限公司。

鮮大蒜(樣品編號 XS)：四川本地紫皮大蒜，購于四川省成都市菜市場，鮮大蒜去皮后備用。

四川壇泡咸大蒜(樣品編號 PS)：鮮紫皮大蒜去皮后，放入四川泡菜的老壇中腌制(5 年的老壇壇水)，腌制時添加蒜頭凈重3%的食鹽，10 ℃ 腌制 30 d，四川壇泡咸大蒜呈咸辣略酸味型。

糖醋蒜(樣品編號 TS)：鮮紫皮大蒜去皮后，放到8%(質(zhì)量分數(shù))的食鹽水中浸泡 2 d 后，撈出瀝干。蒜頭和糖醋汁放入陶壇中，糖醋汁剛好淹沒蒜頭(白砂糖50 g、釀造米醋 400 g 調(diào)制糖醋汁)，10 ℃腌制30 d 即可，糖醋蒜呈甜酸味型。

臘八蒜(樣品編號 LS)：鮮紫皮大蒜去皮后入陶壇，添加釀造米醋剛好淹沒大蒜即可，10 ℃ 腌制20 d，蒜呈翠綠色即可，臘八蒜呈酸辣味型。

1.2 儀器與設(shè)備

FlavourSpec@風味分析儀(配 CTC PAL RSI 自動頂空進樣裝置)，德國 G.A.S mbH公司；TG-16G 臺式高速離心機，湖南凱達科學儀器有限公司；Aglient1260高效液相色譜儀，美國Aglient公司；PS40A超聲清洗儀，深華泰科學儀器有限公司；梅特勒 LE204E 型萬分之一天平，梅特勒-托利多集團；SpectraMax 190 全波長酶標儀，美國 MD 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 氣相離子遷移譜(gas chromatography-ion mobility spectroscopy,GC-IMS)分析

四川壇泡咸大蒜、臘八蒜、糖醋蒜以及完整鮮大蒜(陽性對照)作為研究對象，進行 GC-IMS 檢測分析。取 3 g 樣品，置于 20 mL 頂空瓶中，自動頂空進樣及氣相-離子遷移譜的工作條件見表1。

表1 GC-IMS 工作條件Table 1 GC-IMS working conditions

載氣/漂移氣為 N2(純度≥99.999%)，漂移管溫度 45 ℃，β射線，3H 為放射源，正離子化模式，載氣流速程序見圖1。

1.3.2 蒜氨酸及蒜氨酸酶的測定

蒜氨酸不具有揮發(fā)性的含硫化合物，采用HPLC方法[17]。色譜柱：Agilent LC-C18(250 mm×4.6 mm)；柱溫：25 ℃；流動相：V(甲醇)∶V(水)=30∶70；流速：0.5 mL/min；檢測波長：217 nm；進樣體積：20 μL。

蒜氨酸酶的活性濃度按照植物蒜氨酶酶聯(lián)免疫分析試劑盒的說明書進行操作。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

采用設(shè)備自帶 Laboratory Analytical Viewer分析軟件及 Library Search 定性軟件對大蒜中的揮發(fā)性物質(zhì)進行采集和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 腌制大蒜中活性成分的比較分析

目前，國內(nèi)學者對大蒜素(All- tride，C6H10S3，三硫二丙烯)進行研究發(fā)現(xiàn)其具有抗病原微生物、抗炎及抗腫瘤等作用[1]，且中國藥典(2010 版)將大蒜素作為大蒜藥材的指標成分。然而，國外學者主要圍繞大蒜中蒜氨酸、蒜氨酸酶及大蒜辣素的降血脂、保護血管內(nèi)皮細胞及心肌細胞、抗氧化、抗腫瘤、抗病原微生物等生物活性作用進行研究，且美國藥典、歐盟藥典收載的大蒜相關(guān)產(chǎn)品均以蒜氨酸及(或)大蒜辣素為質(zhì)控指標[15-16,18]。大蒜素并不是大蒜中的天然有效成分，而是蒜氨酸與蒜氨酸酶的反應產(chǎn)物——大蒜辣素在介質(zhì)中進一步分解的產(chǎn)物[1]，故本試驗選擇大蒜中天然成分蒜氨酸及蒜氨酸酶作為評價腌制大蒜生物活性高低的指標。由表2 可知，各腌制大蒜中蒜氨酸酶的活性濃度差異不顯著(P>0.05)，而蒜氨酸含量差異較大。XS 中蒜氨酸含量最高(22 875.05 μg/g)，極顯著高于所有腌制大蒜(P<0.01)；TS 中蒜氨酸含量最低(341.34 μg/g)，極顯著低于LS、PS(P<0.01)；LS中蒜氨酸含量極顯著低于PS(P<0.01)，這可能與腌制環(huán)境的 pH 值[19]、化學組分、微生物菌群[14，20]有密切關(guān)系，誘導蒜氨酸發(fā)生分解。綜上，鮮大蒜的生物活性應該最強，其次分別是四川壇泡咸大蒜、臘八蒜、糖醋蒜。

表2 腌制大蒜中蒜氨酸含量及蒜氨酸酶活性濃度Table 2 Alliin content and alliinase activity concentration in pickled garlic

2.2 腌制大蒜揮發(fā)性風味物質(zhì)的比較分析

2.2.1 GC-IMS分析

圖2為Reporter插件制作的不同腌制大蒜中揮發(fā)性物質(zhì)的差異化譜圖，以XS為參照，對比所有揮發(fā)性物質(zhì)在不同樣品中的差異情況，紅色越深、面積越大，說明對應揮發(fā)性物質(zhì)濃度高于XS樣品，藍色越深則相反。如圖2所示，具有相同遷移時間和保留時間的揮發(fā)性物質(zhì)(即同一揮發(fā)性化合物)在不同腌制大蒜樣品中的濃度存在較大差異。LS、PS中大部分揮發(fā)性物質(zhì)的濃度較XS更高；而TS中大部分揮發(fā)性物質(zhì)的濃度較XS更低；其中，PS中大部分揮發(fā)性物質(zhì)的濃度較LS低。

2.2.2 腌制大蒜中揮發(fā)性風味物質(zhì)的鑒定

根據(jù)保留時間和遷移時間，從4個大蒜樣品中分離出78種揮發(fā)性物質(zhì)(圖3)。通過 GC×IMS Library Search 軟件從78種揮發(fā)性物質(zhì)中定性 39 種揮發(fā)性物質(zhì)，包括含硫化合物類(9種)、酯類(10種)、醛類(5種)、酮類(6種)、醇類(2種)、酚類(1種)、酸類(1種)及其他類(5種)(表3)。

表3 腌制大蒜中揮發(fā)性物質(zhì)定性分析Table 3 Qualitative analysis of volatile compounds in pickled garlic

續(xù)表3

揮發(fā)性含硫有機化合物是大蒜中重要的風味物質(zhì)，也是重要的生物活性物質(zhì)。劉春菊等[13]采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC-MS)技術(shù)檢測鮮大蒜中共有 22 種揮發(fā)性風味物質(zhì)，其中 14 種含硫化合物，主要含硫化合物是二烯丙基二硫醚、1,3-二噻烷、二烯丙基硫醚、硫化丙烯、二甲基二硫醚、甲基烯丙基硫醚。如表3 所示，SX 中鑒定出 9 種含硫化合物，分別是二烯丙基三硫醚、二丙基二硫醚、二烯丙基二硫醚、二甲基三硫醚、二甲基二硫醚、2,4,5-三甲基噻唑、3-甲硫基丙醛、二烯丙基硫醚、3-甲基烯丙基硫醚，然而 SX 中無 1,3-二噻烷、硫化丙烯、2,4-二甲基噻吩、2-乙烯基噻吩、甲基烯丙基三硫醚、甲基丙烯基二硫醚、烯丙基異丙基硫醚。此外，劉春菊等[13]報道的鮮蒜中含硫化合物不包括二丙基二硫醚、2,4,5-三甲基噻唑、3-甲硫基丙醛。以上結(jié)果的差異可能與檢測分析方法、不同大蒜品種、GC×IMS Library Search 檢索庫有關(guān)系。

劉春菊等[13]報道，大蒜經(jīng)過醋浸后，醋蒜中檢出 10 種含硫化合物，主要包括二烯丙基二硫醚、二烯丙基三硫醚、甲基烯丙基三硫醚、二烯丙基硫醚、1,3-二噻烷、二甲基三硫醚、甲基烯丙基硫醚，即醋浸處理導致大蒜中含硫化合物的種類減少，且二烯丙基二硫醚、二烯丙基硫醚、甲基烯丙基硫醚、甲基丙烯基二硫醚、二甲基二硫醚的相對含量減少。本試驗中，腌制處理并未導致大蒜中含硫化合物種類的減少，這可能與GC×IMS Library Search 檢索庫中的標樣數(shù)量有關(guān)系。

2.2.3 腌制大蒜 GC-IMS 指紋圖譜分析

為識別不同腌制大蒜的特征峰區(qū)域，根據(jù) GC-IMS 二維圖譜中所有譜峰重構(gòu)指紋圖譜[21-22]，詳見圖4，GC-IMS 指紋圖譜右側(cè) Y 軸為大蒜樣品編號(每個大蒜樣品3個平行)，X 軸為揮發(fā)性化合物名稱，其中的數(shù)字表示化合物未鑒定出。同 2.2.1，圖中色點的顏色及深淺表示濃度的高低。由圖4 可知，組內(nèi)的 3 個樣品具有明顯的相似性，3 個腌制大蒜樣品及鮮大蒜樣品(陽性對照)組間則呈現(xiàn)出明顯的差異性，且各大蒜樣品均有各自的特征峰區(qū)域，同時也有共同區(qū)域[23]。相對于 XS，各腌制大蒜中的二甲基二硫醚、3-甲基烯丙基硫醚、3-甲硫基丙醛等揮發(fā)性物質(zhì)含量下降較多(見黃色框)，這與劉春菊等[20]報道不一致；此外，MEE等[24]報道，腌制貯藏導致大蒜中二烯丙基二硫醚、甲基烯丙基硫醚含量逐漸減少，而甲基烯丙基三硫醚和二烯丙基三硫醚含量逐漸增加；JUNG[25]將大蒜浸漬于醬油和鹽水中，二烯丙基三硫醚、甲基烯丙基三硫醚、二甲基三硫醚、甲基丙烯基二硫醚含量增加，二烯丙基二硫醚和甲基烯丙基二硫醚含量降低，這與本研究的結(jié)果也不完全一致。一方面，各腌制大蒜中蒜氨酸含量差異顯著(見 2.1 結(jié)果)，而蒜氨酸的含量可影響其裂解產(chǎn)物——揮發(fā)性含硫有機化合物的種類和含量；此外，大蒜中揮發(fā)性含硫有機化合物的種類及含量受揮發(fā)性物質(zhì)提取、檢測分析時的溫度、加熱時間影響[26]。劉春菊等[20]、MEE等[24]、JUNG[25]采用 SPME-GC- MS 技術(shù)測定大蒜中揮發(fā)性物質(zhì)，而本試驗采用 GC-IMS 技術(shù)進行檢測分析，無需樣品前處理，而是直接加熱(60 ℃)待測樣品，頂空進樣后檢測樣品中的揮發(fā)性有機組分，也就是說 GC-IMS 檢測的揮發(fā)性物質(zhì)是最接近大蒜樣品的實際風味。

綠框為 TS 的特征峰區(qū)域，鑒定出的特色風味物質(zhì)有二烯丙基硫醚、二烯丙基二硫醚、異丁香酚、乙酸丁酯(M)、乙酸丁酯(D)、3-甲基丁醇、丙酮、乙酸等，其在 3 種腌制大蒜中均具有一定含量，但是在 TS 中相對含量最高，這可能與腌制時添加的白砂糖有關(guān)。PS 的特征風味物質(zhì)包括己酸乙酯(M)、己酸乙酯(D)、2-癸烯醛、2,3-二乙基-5-甲基吡嗪、乙酸異戊酯、惕各酸乙酯、2-戊基呋喃、2-甲基丁酸乙酯、2,3-戊二酮、甲基吡嗪、3-苯丙酸乙酯、羥基丙酮、2，6-二甲基-4-庚酮、3-己烯酸乙酯、2,4,5-三甲基噻唑(D)、2,4,5-三甲基噻唑(M)、2-丁酮。LS 的特征風味物質(zhì)包括二丙基二硫、苯甲醛、2-戊酮、己醛(M)、己醛(D)、2-庚基呋喃、二烯丙基三硫、2(3H)-二氫呋喃酮、二甲基三硫、E-2-庚烯醛(M)、E-2-庚烯醛(D)、戊酸乙酯(D)、戊酸乙酯(M)、糠醛。綜上，本試驗制備的 3 種腌制蒜的特色風味物質(zhì)中的鏈狀含硫化合物較少，但含有豐富的酯類、醛類、酮類、吡嗪類等，這與腌制的酸堿環(huán)境、腌制時間、微生物組成有密切關(guān)系[17]。大蒜腌制時未受機械損傷，保持大蒜完整，大蒜中的蒜氨酸在酸堿條件下、各種微生物及其酶的作用下降解生成烯丙醇和絲氨酸，絲氨酸進一步降解生成氨、硫化氫、乙醛等小分子物質(zhì)，這些小分子物質(zhì)相互反應生成噻吩和噻烷等化合物[27]，從而形成腌制大蒜的特色風味。

2.2.4 腌制大蒜的主成分分析

通過儀器軟件自帶的 Dynamic 進行主成分分析，結(jié)果如圖5所示。由圖5 可知，各大蒜樣品在 PC1(貢獻率為44%)和 PC2(貢獻率為35%) 上均能得到較好地分離且組內(nèi)各樣品相對集中于一定范圍內(nèi)，通過二維空間的數(shù)據(jù)分布差異可以直觀地觀察到各樣品間的彼此距離較遠，但聚類清晰。TS與XS彼此距離相對較近，LS與 PS 彼此相距相對較近。

3 結(jié)論

(1)根據(jù)大蒜中蒜氨酸含量及蒜氨酸酶的濃度活性，鮮大蒜的生物活性最強，其次分別是四川壇泡咸大蒜、臘八蒜、糖醋蒜。

(2)通過繪制GC-IMS指紋圖譜，明確了四川壇泡咸大蒜、臘八蒜、糖醋蒜中的主要風味物質(zhì)及特征風味物質(zhì)。

(3)根據(jù)GC-IMS指紋圖譜的主成分分析，臘八蒜與四川壇泡咸大蒜在風味上較為接近。