張曉霞，李筱筱，孫雅煊，戴雪伶

(北京聯(lián)合大學 生物化學工程學院，生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點實驗室，北京，100191)

阿爾茲海默癥(Alzheimer′s disease，AD)是全世界最常見且多發(fā)于老年人群的一種神經(jīng)退行性疾病，隨著人口老齡化的增加，我國AD患者的數(shù)量也在急劇增加，因此，發(fā)現(xiàn)延緩并預防AD的潛在活性物質(zhì)是目前亟待解決的問題[1]。研究表明，AD患者腦內(nèi)氧化應(yīng)激水平顯著增加，是AD的重要發(fā)病機理之一[2]。線粒體是調(diào)控氧化應(yīng)激和產(chǎn)生活性氧的主要細胞器之一，當機體抗氧化防御系統(tǒng)不足以平衡機體生成的活性氧時[3]，會導致線粒體功能障礙，并造成神經(jīng)細胞的氧化損傷，最終導致神經(jīng)元凋亡[4]，因此抑制氧化損傷是預防AD的重要途徑。

殼寡糖(chitooligosaccharide，COS)是殼聚糖的生物酶解產(chǎn)物，由2～20個氨基葡糖通過β-1,4糖苷鍵連接而成的低聚合度糖類化合物。COS是自然界迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一帶正電離子的多糖，且安全無毒，具有多種生物學活性，包括神經(jīng)保護、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗腫瘤、抗氧化等，在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣泛的發(fā)展?jié)摿颓熬癧5]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)COS在體內(nèi)外均能通過降低Aβ1-42介導的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，丙二醛(malondialdehyde，MDA)和神經(jīng)元凋亡而發(fā)揮神經(jīng)保護作用，并通過降低Bax/Bcl-2及caspase3水平緩解Aβ1-42誘導的細胞凋亡[6-7]。此外，研究表明COS能夠通過抑制氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎癥反應(yīng)來緩解AD大鼠的認知功能障礙，也可緩解氧化應(yīng)激所引發(fā)的大鼠視網(wǎng)膜病變[8-9]。本實驗通過研究COS干預H2O2誘導的人神經(jīng)母細胞瘤SK-N-SH細胞氧化損傷，探究COS對神經(jīng)細胞的保護作用及其機制，為合理開發(fā)和利用COS提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

人神經(jīng)母細胞瘤SK-N-SH細胞株，北京協(xié)和細胞資源中心；COS，脫乙酰度為91.3%，分子質(zhì)量≤1 000 Da，大連Glycobio公司；DMEM(dulbecco′s modified eagle medium)，美國Life Technologies公司；H2O2、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide，MTT]、JC-10線粒體膜電位試劑盒、抗體Nrf2、HO-1，美國Sigma公司；細胞凋亡檢測ELISA試劑盒、乳酸脫氫酶檢測試劑盒，Roche Applied Science公司；抗體Bax、Bcl-2、β-actin，Cell Signaling Technology公司；BCA蛋白定量測定試劑盒、蛋白marker、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)，碧云天生物技術(shù)有限公司；電泳試劑，Bio-Rad公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組處理

將人神經(jīng)母細胞瘤SK-N-SH細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃，5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞密度為80%左右時消化傳代，實驗全程在生物安全柜中操作。

將SK-N-SH細胞分為4組：(1)對照組：無處理的細胞培養(yǎng)基；(2)H2O2組：加入100 μmol/L的H2O2；(3)COS組：加入200 μg/mL的COS；(4)COS+H2O2組：200 μg/mL的COS預處理4 h后加入100 μmol/L的H2O2培養(yǎng)24 h。

1.2.2 MTT法檢測細胞活力

通過MTT法測定細胞活力。將對數(shù)生長期的SH-N-SH細胞以1×104個細胞/孔的密度接種在96孔板中。與指定的藥物孵育后，將細胞與0.5 mg/mL MTT孵育4 h后，小心除去培養(yǎng)基，并向每個孔中添加100 μL二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)。在570 nm處并以參比波長630 nm時測量樣品的吸光度。

1.2.3 乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)釋放水平測定

LDH從細胞釋放到培養(yǎng)基中是膜完整性的重要指標。在該測定中，將細胞在24孔板中培養(yǎng)，并在不同處理后，收集培養(yǎng)基，并根據(jù)試劑盒說明書測定LDH活性。使用TriStar LB 941 Berthold酶標儀在490 nm處測量吸光度。

1.2.4 線粒體膜電位檢測

JC-10用于測量細胞中的線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)。JC-10是一種陽離子親脂性染料，濃縮后會在具有極化線粒體膜的細胞線粒體中形成可逆的紅色熒光JC-10聚集體(波長590 nm)。在凋亡細胞中，MMP崩潰導致無法將JC-10保留在線粒體中，并使染料返回其單體綠色熒光形式(波長525 nm)。不同處理結(jié)束后，將細胞用PBS洗滌2次，然后與1×JC-10溶液共同溫育30 min。計算紅色/綠色熒光強度的比率，并將該值相對于對照組標準化。

1.2.5 細胞內(nèi)ATP水平測定

使用ATP發(fā)光測定試劑盒測定細胞內(nèi)ATP的水平。將細胞在裂解緩沖液中裂解，并以12 000×g離心以收集上清液。將100 μL ATP檢測工作溶液添加到白色96孔培養(yǎng)板中，并將板在室溫下振蕩孵育15 min。然后，將20 μL細胞裂解物添加至孔中，并立即使用TriStar LB 941 Berthold酶標儀測量550 nm處的吸光度。

1.2.6 ELISA分析細胞凋亡水平

將細胞接種在6孔板中，并使其在37 ℃的細胞培養(yǎng)箱中(含5% CO2)培養(yǎng)24 h。將不同處理組的細胞進行裂解，并將裂解物轉(zhuǎn)移到預先涂有組蛋白抗體的96孔板中。孵育90 min后，依次加入過氧化物酶結(jié)合物和顯色底物，然后使用Thermo Varioskan多模式微孔板分光光度計測量405 nm處的吸光度。

1.2.7 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot)

將培養(yǎng)好的細胞用預冷的PBS洗滌2次，加入一定量的細胞裂解液裂解后收集，4 ℃，12 000 r/min離心20 min后收集上清液，利用BCA蛋白定量測定試劑盒檢測蛋白質(zhì)的濃度。使用SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)樣品，并將其電轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上。用5%脫脂奶粉封閉膜1 h后，使用特異的一抗(體積比1∶1 000)在4 ℃下?lián)u床過夜孵育。第2天用TBST洗滌3次，然后辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗(體積比1∶2 000)孵育，TBST洗滌3次后使用Millipore ECL化學發(fā)光試劑盒進行顯色。利用Image J軟件分析條帶的強度。

1.2.8 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差，每次試驗至少重復3次。使用SPSS 26.0和GraphPad Prism 6.0來分析數(shù)據(jù)，多組間進行單因素方差分析(ANOVA)，然后采用Student-Newman-Keuls進行兩兩比較，P<0.05被認為具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 COS對H2O2誘導的細胞形態(tài)的影響

如圖1所示，正常對照組細胞貼壁生長，狀態(tài)良好，視野內(nèi)細胞數(shù)量較多，細胞間突觸連接緊密；與正常對照組細胞相比，100 μmol/L的H2O2處理組細胞數(shù)量較少，細胞間突觸連接減少，部分細胞胞體變圓；與H2O2處理組相比，200 μg/mL的COS預處理組細胞數(shù)量明顯增加，細胞間突觸連接更為緊密。

2.2 COS對H2O2誘導的細胞活力的影響

首先采用MTT法分析了不同濃度的H2O2和COS對SK-N-SH細胞活力的影響。如圖2-a所示，不同濃度的H2O2處理SK-N-SH細胞24 h后，與對照組相比，50 μmol/L的H2O2對SK-N-SH細胞活力無顯著性影響，但隨著H2O2濃度的升高，SK-N-SH細胞活力表現(xiàn)出顯著下降趨勢，并以濃度依賴性方式降低細胞活力，其中100 μmol/L甚至更高的濃度會導致細胞活力顯著降低。因此，我們在后續(xù)的實驗中選擇濃度為100 μmol/L的H2O2作用細胞24 h作為建立SK-N-SH細胞氧化損傷的誘導條件。如圖2-b所示，與對照組相比，COS在50～400 μg/mL時處理細胞24 h后對SK-N-SH細胞活力沒有明顯抑制作用，無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。并且200 μg/mL的COS處理細胞使細胞活力提高了21.8%(相對于對照，P<0.01)。所以本研究采用100、200和400 μg/mL 作為COS對H2O2誘導的細胞活力下降的干擾劑量，并進行進一步研究。

為了進一步評估COS的保護作用，先用100、200和400 μg/mL的COS預處理SK-N-SH細胞4 h，然后加入100 μmol/L的H2O2培養(yǎng)細胞24 h后，利用MTT法測定細胞活力。如圖2-c所示，與對照組相比，100 μmol/L的H2O2處理細胞后，其細胞活力降至對照的(73.2±4.15)%。而經(jīng)不同濃度的COS(100、200和400 μg/mL)預處理細胞后，與H2O2處理組相比，細胞活力顯著升高(P<0.05)；并且200 μg/mL COS的細胞保護作用大于所使用的其他2種濃度(100和400 μg/mL)，因此，本研究選用200 μg/mL的COS進行后續(xù)實驗研究。

2.3 COS對H2O2誘導的LDH釋放的影響

為了進一步研究COS對H2O2誘導的氧化損傷的潛在機制，進行了LDH含量測定(另一種細胞毒性指標)，LDH釋放量反映了氧化應(yīng)激引起的細胞膜損傷。如圖3所示，與對照組相比，100 μmol/L的H2O2處理導致LDH的釋放顯著增加，達到了(148.9±10.17)%(P<0.01)；而200 μg/mL的COS單獨處理的細胞未顯示出LDH泄漏的顯著增加(P>0.05)。但是，與H2O2處理組相比，質(zhì)量濃度為200 μg/mL的COS預處理后可顯著抑制LDH在細胞培養(yǎng)基中的釋放，并且LDH的釋放量降至(116.1±11.03)%(P<0.01)。

2.4 COS改善了H2O2誘導的線粒體損傷導致的能量耗竭

為了測定H2O2介導的氧化應(yīng)激下的線粒體功能和能量代謝水平，采用了JC-10染料和ATP試劑盒。JC-10是JC-1的衍生物，JC-1是一種親脂性陽離子染料，當線粒體膜極化時會以單體形式進入內(nèi)部線粒體基質(zhì)中[10]。如圖4-a所示，與對照組相比，100 μmol/L的H2O2處理使MMP顯著降低，并降低至(73.9±6.08)%(P<0.01)，表明氧化應(yīng)激導致了SK-N-SH細胞中MMP的損失；單獨用200 μg/mL的COS處理對SK-N-SH細胞中的MMP無顯著影響(P>0.05)。然而，與H2O2處理組相比，200 μg/mL的COS預處理顯著抑制了H2O2誘導的MMP的降低(P<0.01)，表明線粒體功能得以恢復。這些結(jié)果提示COS顯著減弱了MMP損失。

由于線粒體是為細胞生存和功能所必需的各種生物活動提供ATP的主要能量產(chǎn)生細胞器[11-12]，因此我們檢測了ATP水平是否與H2O2觸發(fā)的線粒體功能障礙有關(guān)。如圖4-b所示，與對照組相比，100 μmol/L的H2O2處理使細胞內(nèi)ATP水平顯著下降(P<0.001)，200 μg/mL的COS單獨處理則對SK-N-SH細胞中的ATP水平無顯著影響(P>0.05)。而與H2O2處理組相比，COS預處理可以顯著提高因暴露于H2O2而降低的細胞內(nèi)ATP水平(P<0.05)。因此，我們得出結(jié)論，COS可以通過維持線粒體功能來改善H2O2介導的能量代謝功能障礙。

2.5 COS對H2O2誘導的細胞凋亡的影響

接下來，我們使用細胞凋亡試劑盒檢測不同處理對SK-N-SH細胞的細胞凋亡的影響。如圖5所示，與對照組相比，100 μmol/L的H2O2處理細胞24 h后導致細胞凋亡率增加至(211±20)%(P<0.001)。而與H2O2處理組相比，200 μg/mL的COS預處理可顯著抑制H2O2誘導的細胞凋亡，并降低至(82±18)%(P<0.001)。

2.6 COS對H2O2誘導的SK-N-SH細胞中Bax和Bcl-2蛋白表達的影響

細胞凋亡與Bcl-2蛋白家族相關(guān)，即必需的線粒體通透性調(diào)節(jié)蛋白，包括抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax等。因此，本研究進一步利用Western Blot檢測Bax和Bcl-2蛋白的表達情況。如圖6所示，與對照組相比，100 μmol/L的H2O2處理細胞后導致Bax蛋白表達量增加，Bcl-2蛋白的表達量下降，且Bax/Bcl-2比值極顯著升高(P<0.001)；與H2O2組相比，200 μg/mL的COS預處理可降低Bax蛋白的表達，增加Bcl-2蛋白的表達，并且Bax/Bcl-2比值顯著降低(P<0.01)。

2.7 COS對H2O2誘導的SK-N-SH細胞中Nrf2和HO-1蛋白表達的影響

如圖7所示，與對照組相比，100 μmol/L的H2O2處理細胞導致HO-1和Nrf2的表達顯著降低，而200 μg/mL的COS可顯著提高Nrf2的表達(P<0.01)；與H2O2處理組相比，200 μg/mL的COS預處理可顯著提高HO-1的表達，但對Nrf2的表達無顯著影響(P>0.05)。

3 討論與結(jié)論

氧化應(yīng)激是神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機制之一，H2O2是由超氧化物歧化形成的，是主要的活性氧之一，會導致細胞中脂質(zhì)過氧化、DNA損傷以及細胞凋亡，并且氧化應(yīng)激能夠?qū)е戮€粒體膜受損、降低線粒體膜電位，并進一步減少ATP的產(chǎn)生。此外，氧化應(yīng)激也是細胞凋亡的重要原因之一[13]。凋亡過程調(diào)節(jié)蛋白，包括促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2，主要位于線粒體膜中，是細胞凋亡的主要參與者，可以通過調(diào)節(jié)氧化還原的平衡調(diào)控細胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，H2O2可以打破Bcl-2基因家族中Bcl-2和Bax之間的平衡，導致氧化應(yīng)激下間充質(zhì)干細胞中Bcl-2/Bax比值降低，從而激活線粒體通路促進細胞凋亡[14]。此外，LDH是存在于活細胞中的一種酶，可催化乳酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸，當細胞受到刺激或損傷時，LDH就會從受損的組織或細胞中釋放出來[15-16]。本研究檢測了H2O2的細胞毒性作用和COS的神經(jīng)保護作用，揭示了H2O2以濃度依賴性抑制了SK-N-SH細胞的生存力，而COS以濃度依賴性抑制了H2O2誘導的細胞毒性。此外，COS可有效抑制H2O2誘導的MMP下降、提高SK-N-SH細胞內(nèi)ATP水平、并降低細胞凋亡，同時還可提高抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，降低促凋亡蛋白Bax的表達。

核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)介導的HO-1表達被證明對氧化應(yīng)激起關(guān)鍵作用[17]。HO-1是一種細胞保護介質(zhì)，可對抗H2O2介導的氧化應(yīng)激，在調(diào)節(jié)線粒體功能時也發(fā)揮重要作用[18]。Nrf2能有效平衡線粒體呼吸作用時產(chǎn)生的ROS并防止線粒體產(chǎn)生毒素[19]。研究表明，COS可顯著上調(diào)D-半乳糖誘導的肝功能受損小鼠體內(nèi)Nrf2及其下游靶基因HO-1的表達，并通過激活Nrf2抗氧化信號，保護人肝細胞L02細胞免受H2O2誘導的氧化應(yīng)激損傷[20]。TAO等[21]研究發(fā)現(xiàn)，COS可通過激活Nrf2通路上調(diào)抗氧化酶如谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的表達來改善肝臟的氧化應(yīng)激。本研究結(jié)果表明，H2O2處理導致SK-N-SH細胞中Nrf2和HO-1的表達顯著下降，而COS干預可有效提高SK-N-SH細胞中Nrf2下游分子HO-1的表達。

綜上所述，COS可顯著降低H2O2誘導的SK-N-SH細胞氧化損傷，能夠保護SK-N-SH細胞免受H2O2誘導的細胞死亡，并且COS干預可促進線粒體膜電位的恢復和提高細胞內(nèi)ATP水平來維持線粒體功能，還通過抑制凋亡相關(guān)蛋白Bax的表達以及促進Bcl-2蛋白的表達抑制細胞凋亡，提高HO-1的表達，從而起到神經(jīng)保護作用。