李俊毅，王大紅,2,3*，蘇佳杰，姬翔，李陽,2,3*

1(河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽， 471023)2(河南省食品微生物工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽， 471023) 3(河南科技大學(xué)，微生物資源開發(fā)與利用校級重點實驗室，河南 洛陽，471023)

馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)作為一種食品安全級酵母[1-2]，具有耐熱性強、生長快、可利用的底物范圍廣等特點[3-5]，被越來越多的研究人員用于構(gòu)建微生物細胞工廠[6]，成為潛在的工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用菌[7]。相較于釀酒酵母，馬克斯克魯維酵母不僅能夠利用葡萄糖，還擁有完整的木糖和阿拉伯糖代謝酶系統(tǒng)[8-9]。木糖進入酵母細胞后，首先在木糖還原酶和還原型輔酶Ⅱ(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)的作用下生成木糖醇，而后在木糖醇脫氫酶和輔酶NAD+的作用下形成D-木酮糖，最后在木酮糖激酶的催化下合成木酮糖-5-磷酸，繼而進入五碳糖磷酸途徑和糖酵解途徑。因此，馬克斯克魯維酵母具有利用木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)生產(chǎn)生物燃料和生物基化學(xué)品的潛力[10]。然而木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)通常是混合碳源，由于葡萄糖效應(yīng)的存在，其他碳源尤其是木糖的代謝會被抑制，導(dǎo)致其利用效率的下降[11]。因此，進行馬克斯克魯維酵母葡萄糖效應(yīng)方面的研究對于解決其葡萄糖、木糖共利用的問題具有積極意義。

目前釀酒酵母的葡萄糖效應(yīng)研究基礎(chǔ)較好[12]。mig1基因作為葡萄糖轉(zhuǎn)錄負調(diào)控中的關(guān)鍵因子，其編碼的蛋白MIG1具有C2H2鋅指結(jié)構(gòu)，可在葡萄糖的作用下與多個基因的啟動子結(jié)合，從而抑制基因的轉(zhuǎn)錄[13]。在無葡萄糖或葡萄糖含量很低時，MIG1蛋白不再結(jié)合到相關(guān)基因的啟動子上，解除阻遏基因轉(zhuǎn)錄的抑制。因此，通過敲除釀酒酵母mig1基因的方式可以有效地解除其葡萄糖效應(yīng)。與釀酒酵母相比，目前馬克斯克魯維酵母中葡萄糖效應(yīng)相關(guān)的研究較少，其葡萄糖對木糖代謝抑制的機理研究還不明確。結(jié)合馬克斯克魯維酵母基因組中存在釀酒酵母MIG1蛋白同源基因mig1(GenBank ID:34714544)，本研究擬將出發(fā)菌株LJ0的mig1基因敲除，并對野生型菌株和敲除菌株的葡萄糖、木糖以及混合糖利用能力進行檢測評價，研究其對馬克斯克魯維酵母葡萄糖效應(yīng)和對利用不同碳源發(fā)酵的影響，具有較大的理論意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與培養(yǎng)基

出發(fā)菌株：K.marxianus菌株LJ0由本校微生物基因工程研究室保藏。

YPD培養(yǎng)基(g/L)：酵母浸粉10，蛋白胨20，葡萄糖20。

篩選培養(yǎng)基：潮霉素終質(zhì)量濃度為100 μg/mL的YPD培養(yǎng)基。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：酵母浸粉10，蛋白胨20，一定濃度的葡萄糖(或木糖)。

1.1.2 主要試劑

逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒，康為世紀(jì)生物科技有限公司；木糖、TaqDNA聚合酶、Ezup柱式酵母基因組DNA抽提試劑盒，生工生物工程(上海)股份有限公司；葡萄糖測定試劑盒，上海榮盛生物藥業(yè)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1mig1基因的敲除

采用同源重組法[14-15]進行基因敲除研究，擬用編碼潮霉素基因hptII的CDS(蛋白質(zhì)編碼區(qū))替換基因組DNA中的mig1基因的CDS，過程見圖1。根據(jù)GenBank中K.marxianusDMKU3-1042菌株的基因組DNA序列設(shè)計引物，擴增mig1基因CDS上下游各500 bp的同源臂片段mig1a、mig1b，并利用重疊延伸PCR技術(shù)[16]將兩者與hptII的CDS序列構(gòu)建拼接獲得同源重組敲除片段mig1a-hptII-mig1b。利用電轉(zhuǎn)化法[17]將敲除片段導(dǎo)入酵母細胞中，通過含有潮霉素的YPD平板篩選出敲除菌株，并進行hptII基因的PCR驗證。

1.2.2 敲除菌株的驗證

以敲除菌株的基因組DNA為模板，擴增抗性標(biāo)記基因hptII進行PCR驗證，以原始菌株與敲除菌株的總RNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后得到相應(yīng)的cDNA。以得到的cDNA為模板，分別針對mig1基因進行熒光定量PCR驗證，內(nèi)參基因為act1基因。每個樣品取3個重復(fù)根據(jù)2株菌株的循環(huán)閾值(cycle threshold，Ct)，計算平均值，依照RATE=2-ΔΔCt來計算相關(guān)基因的相對表達量，驗證菌株的mig1是否已經(jīng)被敲除。

1.2.3 以不同碳源進行發(fā)酵

以不同濃度的葡萄糖、木糖以及不同比例的混合糖為碳源對野生型菌株和敲除菌株進行發(fā)酵，檢測mig1基因的敲除是否對利用不同碳源的發(fā)酵產(chǎn)生影響。

1.2.4 生長曲線的測定

將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基當(dāng)中，每隔12 h取樣1次，對樣品進行適當(dāng)稀釋，以無菌水作為參比，測定菌液在波長為600 nm時的吸光度，吸光度=稀釋倍數(shù)×OD600。

1.2.5 發(fā)酵液殘?zhí)欠治?/p>

利用DNS法[18]測定發(fā)酵液中還原糖的含量，利用葡萄糖測定試劑盒測定發(fā)酵液中葡萄糖的含量。

1.2.6 木糖代謝關(guān)鍵酶基因表達量的檢測

以40 g/L的木糖為碳源對原始菌株與敲除菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)，分別提取總RNA為模板，針對木糖代謝關(guān)鍵酶木糖還原酶基因xyl1、木糖醇脫氫酶基因xdh、木酮糖激酶基因xks1進行熒光定量PCR分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 敲除菌株的驗證

通過重疊PCR獲得同源重組片段mig1a-hptII-mig1b，電泳結(jié)果如圖2-a所示，片段大小與預(yù)期一致。從潮霉素篩選平板中挑取長勢良好的單菌落LJ37菌株后，提取基因組DNA擴增hptII基因，電泳結(jié)果如圖2-b所示，片段大小為1 026 bp，與預(yù)期一致，表明同源重組片段已成功整合到酵母基因組DNA中。提取野生型菌株和敲除菌株的基因組RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后、利用熒光定量PCR檢測2株菌株的mig1相對表達量。結(jié)果顯示熒光擴增曲線圖中無法檢測出敲除菌株的mig1的信號，證明目的基因mig1并未表達，敲除菌株成功構(gòu)建。

2.2 對葡萄糖利用的影響

以葡萄糖為碳源對野生型菌株LJ0和敲除菌株LJ37進行發(fā)酵。圖3為2株菌株利用不同濃度葡萄糖發(fā)酵的菌株生長曲線。當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度為40 g/L時，敲除菌株LJ37最終生長量OD600為17.43，是野生型菌株LJ0的1.24倍。當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度提升到80、120、160 g/L時，野生型菌株生長量有所提高，但達到的最大生長量基本一致，而敲除LJ37菌株的最大生長量可隨著糖濃度的增加繼續(xù)增加。在糖濃度達到160 g/L時，LJ37的生長量提升為原始菌株的1.17倍，盡管提升程度較低濃度發(fā)酵有所降低，但在糖濃度較高時敲除菌株能夠在12 h迅速生長到平臺期，達到最大生長量。在ZHANG等[19]的相關(guān)研究中，構(gòu)建的mig1敲除菌株較親本葡萄糖抑制效應(yīng)降低了49.88%，葡萄糖代謝能力得到顯著提高，與本文結(jié)果一致。同時根據(jù)其他相關(guān)研究[20-21]中的內(nèi)容，mig1基因的敲除也能夠有效提高釀酒酵母、面包酵母菌株葡萄糖的利用速率和生物量。結(jié)果表明，敲除菌株LJ37可以適應(yīng)更高濃度的葡萄糖，mig1基因的敲除有助于提高其在高濃度葡萄糖條件下的生長量，這對于馬克斯克魯維酵母高密度發(fā)酵的研究具有參考價值。

2.3 對木糖利用的影響

以木糖為碳源對野生型菌株LJ0和敲除菌株LJ37進行發(fā)酵，圖4為2株菌株在不同濃度木糖下生長的發(fā)酵曲線及殘?zhí)亲兓€。在生長量方面，敲除菌株的整體生長量較原始菌株高。當(dāng)木糖質(zhì)量濃度為20 g/L時，2株菌株均達到最大生長量且此時2株菌株的生長量差距最大，較原始菌株生長量提高19.1%。當(dāng)?shù)孜锬咎琴|(zhì)量濃度高于20 g/L時，2株菌株的生長量都會隨著底物碳源濃度的升高而降低，但敲除菌株的整體生長量仍高于野生型菌株。在XU等[22]通過構(gòu)建mig1突變體提高釀酒酵母木糖利用率的研究中發(fā)現(xiàn)，mig1基因的敲除對木糖代謝途徑中多個關(guān)鍵基因相對表達量的提升有促進作用，與本文的實驗結(jié)果相一致?？傮w而言，相較于野生型菌株，敲除菌株LJ37的生長量隨著底物木糖濃度的增長變化更為明顯。

通過測定野生型菌株LJ0和敲除菌株LJ37在不同木糖濃度條件下發(fā)酵培養(yǎng)基中的殘?zhí)菨舛?，進行木糖消耗量分析。當(dāng)起始木糖質(zhì)量濃度較低時(20～40 g/L)，2株菌株均能在48 h內(nèi)將底物木糖基本全部利用，隨著初始底物中木糖含量的增加，敲除菌株在代謝速率上的優(yōu)勢愈明顯。在此過程中，2株菌株均在木糖質(zhì)量濃度為40 g/L、發(fā)酵12 h時達到最大糖利用速率，其中敲除菌株的最大糖利用速率達到2.44 g/(L·h)，為野生型菌株的1.6倍，提升較為明顯。結(jié)合2株菌株的生長情況得出，較于原始菌株，mig1基因的敲除除了提升菌株木糖的代謝能力外，對于底物木糖濃度的變化也更加敏感。當(dāng)木糖質(zhì)量濃度提升到60 g/L時，敲除菌株最終的木糖利用率達到86.2%，為野生型菌株的1.16倍，但此條件下2株菌株的整體木糖代謝速率差異明顯減小，可能是高底物濃度對于馬克斯克魯維酵母木糖代謝有負面影響。王亮[23]在針對馬克斯克魯維酵母高密度發(fā)酵條件的優(yōu)化研究中也指出，當(dāng)木糖質(zhì)量濃度超過65 g/L時，酵母的生長量開始降低。以上結(jié)果表明mig1基因的敲除有利于馬克斯克魯維酵母木糖代謝能力提升，可能是基因敲除解除了部分木糖代謝途徑中關(guān)鍵酶基因的抑制作用。

2.4 對混合糖利用的影響

以不同比例葡萄糖、木糖的混合糖為碳源對野生型菌株LJ0和敲除菌株LJ37進行發(fā)酵。由于總糖濃度過高會影響滲透壓使酵母菌的生長受到抑制，本文選用混合糖中木糖含量為20 g/L，葡萄糖的添加量分別為20、40、60、80 g/L。圖5為2株菌株利用不同比例混合糖進行發(fā)酵的生長曲線。敲除菌株整體生長量較原始菌株高，隨著混合糖濃度的增大，菌株的生長量逐漸升高。當(dāng)混合糖質(zhì)量濃度為20～80 g/L時，LJ37達到最大生長量，OD600達到30.27，為原始菌株的1.19倍。

通過研究2株菌株發(fā)酵過程中總殘?zhí)羌捌咸烟菤執(zhí)堑臐舛茸兓?，可以計算出葡萄糖、木糖的消耗情況。分別測定2株菌株不同比例混合糖發(fā)酵液中的總殘?zhí)呛推咸烟菤執(zhí)菨舛龋?jīng)對比敲除菌株的糖利用率和糖利用速率均優(yōu)于原始菌株，與利用純木糖進行發(fā)酵時的情況一致。其中混合糖質(zhì)量濃度為20～80 g/L時差異最為顯著，如圖6-a所示。經(jīng)過計算，2株菌株木糖殘?zhí)亲兓厔菀妶D6-b，可以看出2株菌株在發(fā)酵初期基本不利用木糖，發(fā)酵前18 h內(nèi)仍以葡萄糖為主要碳源進行生長，當(dāng)18 h后葡萄糖基本消耗完全，2株菌株開始代謝木糖進行生長，在后續(xù)消耗木糖進行生長的階段中，敲除菌株LJ37的木糖代謝能力要強于原始菌株。另外，敲除菌株發(fā)酵底物中在12 h出現(xiàn)木糖逐漸減少的現(xiàn)象，但由于消耗的木糖量較少且并未在發(fā)酵初始就能夠利用木糖，因此無法認為敲除菌株具有同時代謝2種糖的能力，即敲除菌株的木糖代謝能力雖然得到提高，但并未出現(xiàn)葡萄糖和木糖共代謝能力提高的現(xiàn)象。

本研究中mig1基因的單敲除未能真正有效解除葡萄糖的抑制效應(yīng)，推測葡萄糖阻遏效應(yīng)的解除可能同時受到多個轉(zhuǎn)錄因子的共同調(diào)控。蔡艷青等[25]研究發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母中mig1基因的敲除對于混合糖發(fā)酵中的木糖代謝并沒有明顯促進作用，原因可能是由于在葡萄糖效應(yīng)中mig1還受到另一個關(guān)鍵因子snf1的負調(diào)控，需要進一步敲除snf1才可解除葡萄糖對次級碳源的阻礙作用。盧敏[11]對于馬克斯克魯維酵母混合糖共利用菌株構(gòu)建的研究指出，由己糖激酶基因Hxk介導(dǎo)產(chǎn)生的葡萄糖磷酸化信號對于SNF1形成蛋白復(fù)合體以及后續(xù)MIG1蛋白的磷酸化起到調(diào)控作用，導(dǎo)致非葡萄糖碳源部分代謝基因的轉(zhuǎn)錄受到抑制，并通過敲除KmHxk基因成功解除了葡萄糖的抑制效應(yīng)，但Hxk作為葡萄糖代謝通路的關(guān)鍵基因，敲除會導(dǎo)致葡萄糖代謝的嚴重缺陷，菌株將無法繼續(xù)利用葡萄糖。由于目前針對馬克斯克魯維酵母的葡萄糖抑制效應(yīng)的研究相對較少，后續(xù)實驗仍需要進一步對葡萄糖效應(yīng)的其他調(diào)控因子和解除葡萄糖阻遏的其他方式進行研究。

2.5 木糖代謝關(guān)鍵酶基因表達量的檢測

以木糖為唯一碳源時，當(dāng)木糖質(zhì)量濃度為40 g/L，發(fā)酵12 h時木糖代謝速率達到最大值。為了在基因轉(zhuǎn)錄水平揭示mig1基因的敲除對于木糖代謝途徑中關(guān)鍵酶的影響，在該發(fā)酵條件下分別檢測野生型菌株和敲除菌株3個關(guān)鍵基因木糖還原酶基因xyl1、木糖醇脫氫酶基因xdh、木酮糖激酶基因xks1的相對表達量。圖7為2株菌株關(guān)鍵基因相對表達量差異圖。以木糖為碳源時，敲除菌株LJ37基因xyl1、xdh、xks1的相對表達量是野生型菌株的2.25、2.43、2.00倍。3種關(guān)鍵酶基因的相對表達量較野生型菌株均有一定程度的提升，證明mig1基因的敲除有利于提高3種關(guān)鍵酶基因的轉(zhuǎn)錄水平。在蔡艷青等[25]對釀酒酵母轉(zhuǎn)錄組的分析研究中指出，mig1敲除菌株中上調(diào)表達的基因中有部分與色氨酸的降解、精氨酸的吸收以及甘氨酸的代謝相關(guān)，這些基因可能直接或間接受到mig1基因的控制。這些氨基酸作為檸檬酸循環(huán)的關(guān)鍵中間代謝物對總反應(yīng)中還原型輔酶I(nicotinamide adenine dinucleotide，NADH)的合成起到了關(guān)鍵作用，進而影響NADH作為輔酶在木糖代謝中催化木糖醇轉(zhuǎn)化為D-木酮糖的過程，加快了木糖進入細胞后的催化過程，使得關(guān)鍵酶基因的表達量得到提高。

3 結(jié)論

本文以馬克斯克魯維酵母LJ0為出發(fā)菌株，通過同源重組法敲除mig1基因，構(gòu)建了敲除菌株LJ37，通過檢測2株菌株在不同碳源下的發(fā)酵性能，找出敲除mig1對于馬克斯克魯維酵母利用不同碳源的影響。實驗結(jié)果表明，mig1基因的敲除對于葡萄糖和木糖條件下菌株發(fā)酵的最大生長量均有所提升。在木糖發(fā)酵過程中，敲除菌株的生長量提升為野生型菌株的1.19倍，最大生長速率提升到2.44 g/(L·h)，為野生型菌株的1.6倍。在葡萄糖發(fā)酵過程中生長量提升則更為明顯，敲除菌株的最大生長量提升為野生型菌株的1.24倍。但在混合糖發(fā)酵中2株菌株的代謝糖能力差異較小，發(fā)酵過程中木糖的消耗速率差別不大，說明mig1基因的敲除并未完全解除葡萄糖的抑制效應(yīng)。在對木糖代謝關(guān)鍵酶基因的測定結(jié)果方面，發(fā)現(xiàn)敲除菌株在木糖發(fā)酵條件下的部分關(guān)鍵酶基因的表達量得到提高，進一步確認了mig1基因的敲除有利于促進馬克斯克魯維酵母對于木糖的利用?？傮w而言，mig1基因的敲除對于混合糖發(fā)酵的影響不明顯，但是提高了菌株利用葡萄糖和木糖的能力。此外敲除菌株除了在葡萄糖發(fā)酵中代謝能力得到有效提高，還能夠利用較高濃度葡萄糖進行生長，在高密度發(fā)酵方面具有一定的潛力。