吳靜，李偉，馮靜靜，周夢潔，胡汶松，汪劍，SOKHNA MBACKE Gningue，吳佳雯，趙禮軍，徐文瀚，薛正蓮,2，王洲,2，劉艷,2*

1(安徽工程大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院，安徽 蕪湖，241000)2(安徽省工業(yè)微生物分子育種工程實驗室，安徽 蕪湖，241000)

維生素K2是枯草芽胞桿菌及納豆芽胞桿菌能量代謝電子傳遞系統(tǒng)的重要組成元素，在電子傳遞、氧化磷酸化、主動運(yùn)輸、內(nèi)生孢子形成以及體內(nèi)ATP的生成和維持生命活動等方面，都起著舉足輕重的作用[1-3]。枯草芽胞桿菌及納豆芽胞桿菌合成食品級維生素K2，近幾年主要有CUI等[4-5]、MAHDINIA等[6]和BERENJIAN等[7]在研究，研究的內(nèi)容大多集中于發(fā)酵過程的代謝調(diào)控。其中BERENJIAN等[8]通過多年的研究發(fā)現(xiàn)，納豆芽胞桿菌搖瓶規(guī)模下靜態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生了大量生物膜，而這些生物膜的形成明顯促進(jìn)了維生素K2的合成。隨后，美國賓夕法尼亞州立大學(xué)MAHDINIA等[9]為促使納豆芽胞桿菌維生素K2的大規(guī)模合成，專門研制了可以增強(qiáng)生物膜形成的生物反應(yīng)器，通過優(yōu)化發(fā)酵過程參數(shù)發(fā)現(xiàn)，形成生物膜后納豆芽胞桿菌維生素K2的合成量比游離狀態(tài)時的合成量增加了58%[10]。然而，當(dāng)在野生型芽胞桿菌培養(yǎng)基中添加維生素K2抑制劑二苯胺時，培養(yǎng)基中沒有生物膜形成。外源添加維生素K2后，生物膜結(jié)構(gòu)又重新出現(xiàn)[11]。并且，在其他革蘭氏陽性菌中，同樣發(fā)現(xiàn)維生素K2是形成復(fù)雜菌落形態(tài)和生物膜的重要元素[12]。因此，枯草芽胞桿菌生物膜的形成，對于促進(jìn)維生素K2的合成代謝，具有十分重要的意義；并且，維生素K2對于枯草芽胞桿菌生物膜的形成，同樣舉足輕重。

研究表明sinR參與BS168生物膜的形成，但具體哪些因素影響sinR基因?qū)ι锬さ恼{(diào)控機(jī)制尚未見完整報道，并且該基因表達(dá)量的不同對維生素K2的合成是否有影響尚未可知。因此，本論文以微生物生長外部調(diào)節(jié)因素為介質(zhì)，通過研究pH值、溫度、金屬離子對BS168、BS168-ΔsinR菌株生物膜形成和維生素K2合成能力的影響，為分析SinR蛋白在調(diào)控生物膜過程受哪些外界因素干擾，并為進(jìn)一步研究革蘭氏陽性菌生物膜的調(diào)控機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗菌株：枯草芽胞桿菌BS168、大腸桿菌JM109、P7C6、PDG-CRE質(zhì)粒均為本實驗室保存。

培養(yǎng)基：大豆蛋白胨、KH2PO4、K2HPO4、甘油、胰蛋白胨、瓊脂條、NaCl、酵母提取物、葡萄糖，國藥集團(tuán)化學(xué)有限公司。

其他相關(guān)試劑：PRIME STAR、膠回收純化試劑盒，Takara；50×TAE緩沖液、氨芐霉素、氯霉素，上海生工生物；細(xì)菌基因組試劑盒，天根生物；苯酚、H2SO4、結(jié)晶紫、無水乙醇、MnCl2、FeSO4、CaCl2，國藥集團(tuán)化學(xué)有限公司。

儀器：PCR儀，美國伯樂；SK-1快速混勻器，上海醫(yī)用激光儀器廠；雙層振蕩培養(yǎng)箱、恒溫培養(yǎng)箱，知楚儀器；酶標(biāo)儀，賽默飛世爾儀器有限公司；水浴鍋、pH計，梅特勒；核酸定量儀、HPLC，島津。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制

Sipizizen感受態(tài)培養(yǎng)基：SPI溶液、SPII溶液、50 mmol/L CaCl2、250 mmol/L MgCl2。

平板活化培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10、NaCl 10、酵母提取物5、瓊脂條20，調(diào)pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10、NaCl 10、酵母提取物5，調(diào)節(jié)pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

生物膜與發(fā)酵SYG培養(yǎng)基(g/L)：大豆蛋白胨50、酵母提取物20、甘油50、K2HPO43.86、KH2PO41.62、微量元素2 mL(過濾除菌后加入滅菌后的培養(yǎng)基中)。將配制好的培養(yǎng)基分裝并調(diào)節(jié)pH為5、6、7、8、9，121 ℃滅菌20 min。

1.2.2 構(gòu)建BS168-ΔsinR菌株

根據(jù)枯草芽胞桿菌基因組圖譜用Snapgene設(shè)計3對引物，分別是左同源臂上下游引物、中間部分(目的基因)上下游引、右同源臂上下游引物(約1 000 bp)。引物合成委托金唯智生物技術(shù)有限公司來完成(見表1)。利用三重融合PCR將3個片段進(jìn)行連接。將純化后的PCR產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，再通過使用cre/lox系統(tǒng)去除宿主細(xì)胞的抗性標(biāo)記，最終得到陽性克隆菌株。將菌株用甘油管保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2.3 枯草芽胞桿菌的活化及培養(yǎng)

從-80 ℃冰箱取出菌種在LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線培養(yǎng)，得到單菌落。將單菌落挑入到100 mL LB液體培養(yǎng)基中，放入搖床37 ℃、220 r/min，培養(yǎng)12～16 h，按5%的接種比例將種子培養(yǎng)液加入每孔含2 mL的SYG培養(yǎng)基的24孔板中，放入恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，測定72 h形成的生物膜，每組樣品做3組平行。

表1 用于基因敲除和過表達(dá)的擴(kuò)增引物Table 1 Primers used for gene knockout and overexpression

1.2.4 生物膜的形成與測定

參照文獻(xiàn)方法[13]，以24孔板為載體，每孔中加入5%的菌液，然后加入2 mL的SYG培養(yǎng)基，3個重復(fù)孔，并且以空SYG培養(yǎng)基作為對照，37 ℃培養(yǎng)72 h定量測定生物膜。首先緩慢移除每孔中的培養(yǎng)物，然后用無菌的PBS緩沖液清洗2～3次，洗去未黏附的菌體，室溫干燥后加入2 mL的0.1%結(jié)晶紫染液進(jìn)行染色20 min，再用PBS進(jìn)行緩慢沖洗，直至流出無色為止，室溫靜置干燥，除去多余水分，隨后加入2 mL 的95%乙醇進(jìn)行脫色15 min, 然后混勻。最后用酶標(biāo)儀測定OD570nm的值衡量生物膜的多少。

1.2.5 培養(yǎng)條件對BS168與BS168-ΔsinR生物膜的影響

培養(yǎng)溫度對BS168與BS168-ΔsinR生物膜的影響：菌株按1.2.3培養(yǎng)并置于20、25、30、37、40、45 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。按1.2.4，檢測不同溫度所形成的生物膜的OD570nm值。

不同pH值對BS168與BS168-ΔsinR生物膜的影響：按1.2.4生物膜形成測定方法，用HCl和NaOH調(diào)節(jié)生物膜培養(yǎng)基的pH值。測定pH分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0時形成生物膜的OD570nm值。

Mn2+、Fe2+和Ca2+對生物膜形成的影響：生物膜培養(yǎng)基中分別加入不同濃度的Mn2+、Fe2+和Ca2+，使其中Mn2+濃度分別為0、0.01、0.1、1、10和100 mmol/L；Fe2+濃度分別為0、1、10、50和100 μmol/L；Ca2+濃度分別為0、0.01、0.1、1、10 mmol/L。分別置于37 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)72 h，每個樣品做3次平行，按1.2.4，檢測不同濃度金屬離子所形成生物膜的OD570nm值。

1.2.6 胞外蛋白的檢測

菌株按1.2.3培養(yǎng)，分別測定BS168與BS168-ΔsinR在上述實驗中不同溫度、pH以及不同濃度的金屬離子(Mn2+、Fe2+、Ca2+)靜置培養(yǎng)72 h生物膜的胞外蛋白的含量。利用核酸定量儀進(jìn)行蛋白測量。

1.2.7 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法

配置葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(200 mg/L)，分別吸取標(biāo)準(zhǔn)液0、100、200、300、400、600、800、1 000 μL，置具塞試管中，每管分別加6%的苯酚溶液500 μL混勻，然后加入3 mL的硫酸溶液，再混勻，置沸水浴20 min，用冰水浴冷卻后于490 nm處測定各溶液的吸光度，得到標(biāo)準(zhǔn)方程為Y=1.503 8x-0.027 4，相關(guān)性系數(shù)R2=0.993，表明葡萄糖濃度與吸光度線性關(guān)系良好。

1.2.8 胞外多糖的檢測

菌株按1.2.3培養(yǎng)，將孔板中的菌液轉(zhuǎn)移至2 mL離心管中離心去上清液稱重，加入約3倍質(zhì)量的無水乙醇混勻，放入4 ℃冰箱過夜，離心棄上清液，再加入原質(zhì)量的純化水混勻，按上述方法測OD490nm的值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計算糖的質(zhì)量濃度[14]。

1.2.9 維生素K2標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

稱取恒重的維生素K2的標(biāo)準(zhǔn)品，用10 mL的流動相[V(甲醇)∶V(二氯甲烷)=1∶9]將標(biāo)品定溶于10 mL棕色容量瓶中，制成母液。再用流動相將母液稀釋成不同濃度梯度的維生素K2溶液，用高效液相色譜儀檢測峰面積。以248 nm處做維生素K2標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制和產(chǎn)量測定。得到標(biāo)準(zhǔn)方程為Y= 14 368x+1 272.3，相關(guān)系數(shù)R2= 0.999 6，表明維生素K2濃度與峰面積線性關(guān)系良好。

1.2.10 發(fā)酵液中維生素K2產(chǎn)量的測定

由于維生素K2是枯草芽胞桿菌發(fā)酵的后期產(chǎn)物，在這里我們對2株菌進(jìn)行了7 d的發(fā)酵。按照參考文獻(xiàn)[15]，將不同溫度、pH和金屬離子濃度的菌液置于相應(yīng)的培養(yǎng)條件中，用100 mL三角瓶靜置培養(yǎng)7 d后，將其混勻取2 mL發(fā)酵液到離心管中，加入其4倍體積的異丙醇與正己烷混合液(1∶2，體積比)，用漩渦混勻振蕩器混勻。避光靜置30 min后，離心取上層萃取液于5 mL離心管中，用0.22 μm有機(jī)濾膜進(jìn)行過濾，得到樣品，用HPLC進(jìn)行測量。將測量值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中計算維生素K2的含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。采用SPSS、Origin軟件對相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1BS168-ΔsinR菌株的構(gòu)建

按照1.1.2中設(shè)計的引物和實驗步驟，擴(kuò)增sinR基因的3個片段，再通過融合PCR的方法得到目的基因，瓊脂糖凝膠電泳驗證目的基因擴(kuò)增成功(圖1)。采用spizizen轉(zhuǎn)化法將融合PCR得到的目的基因轉(zhuǎn)化到枯草芽胞桿菌中(圖2)。再將得到的陽性克隆用抗性平板驗證，驗證成功后去除抗性。將得到的菌株經(jīng)過測序，用軟件snapgene比對，顯示sinR基因敲除成功。

M-5 000堿基DNA對照；泳道 1、2-sinR上游；泳道3、4-中間片段；泳道5、6：sinR下游圖1 目的基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 Agarose gel electrophoresis for testing PCR amplification of the target gene

M-5 000堿基DNA對照；泳道 1、2、3、4-敲除sinR圖2 菌落PCR的瓊脂糖凝膠電泳圖譜驗證Fig.2 Agarose gel electrophoresis of colony PCR

2.2 不同溫度、pH及Mn2+、Fe2+、Ca2+濃度對BS168與BS168-ΔsinR生物膜的外部形態(tài)及形成量的影響

由圖3可知，重組菌BS168-ΔsinR在不同的培養(yǎng)條件下，生物膜的生長狀態(tài)均優(yōu)于原始菌BS168。

由圖4-a可知，BS168-ΔsinR與BS168生物膜的形成量在37 ℃時無顯著性差異，在其他溫度條件下，BS168-ΔsinR生物膜形成量均要高于BS168(P<0.05)。在37和40 ℃BS168成膜能力強(qiáng)，表現(xiàn)出OD570nm值大，在20和45 ℃BS168幾乎不產(chǎn)生物膜。而BS168-ΔsinR僅在20 ℃時成膜能力弱，在其他溫度條件下均能形成生物膜，在40 ℃時菌株成膜能力最強(qiáng)，表現(xiàn)出OD570nm值最高。這與文獻(xiàn)報道相一致，低溫會抑制生物膜的形成[16-17]，主要由于菌在低溫條件下生長和代謝速率的降低有關(guān)。相比原始菌BS168，重組菌BS168-ΔsinR的成膜能力更強(qiáng)，尤其在高溫條件下形成生物膜的能力更突出。

圖3 培養(yǎng)72 h不同生長條件下的生物膜Fig.3 The morphologies of biofilm under different cultivated conditions of 72 h

圖4-b顯示，當(dāng)pH=8時，BS168與BS168-ΔsinR菌株形成生物膜的OD570nm值最大，且重組菌生物膜的形成量顯著高于出原始菌(P<0.05)。當(dāng)pH=5、9時BS168幾乎不產(chǎn)生物膜。而BS168-ΔsinR僅在pH值為5時，生物膜成膜能力弱，在其他pH條件下均能較好的形成生物膜。相比與BS168重組菌BS168-ΔsinR在弱酸和弱堿條件下形成生物膜的能力更強(qiáng)。

圖4-c顯示，重組菌BS168-ΔsinR與原始菌BS168生物膜的形成量在Mn2+為100 mmol/L時無顯著性差異，在其他濃度條件下，重組菌生物膜形成量均高于原始菌(P<0.05)，低濃度的Mn2+均能促進(jìn)BS168與BS168-ΔsinR生物膜的形成。在Mn2+為0.01 mmol/L時BS168形成生物膜的OD570nm最高，在其他濃度條件下，BS168幾乎不能形成生物膜。而BS168-ΔsinR僅在Mn2+為100 mmol/L時，生物膜的形成受到影響，在其他濃度下均能較好的形成生物膜。對于Mn2+對生物膜的作用機(jī)制尚不清楚，但已知它參與了細(xì)胞外主要聚合物質(zhì)的產(chǎn)生[18]，從而通過支持微生物細(xì)胞聚集在一起，來幫助生物膜的形成。

圖4-d顯示，重組菌BS168和原始菌BS168-ΔsinR添加不同濃度的Fe2+均能形成生物膜，重組菌生物膜的形成量要顯著高于原始菌(P<0.05)。在Fe2+為1 μmol/L 時，2株菌成膜能力強(qiáng)，表現(xiàn)出OD570nm值大。但不同濃度的Fe2+對BS168-ΔsinR生物膜的形態(tài)有比較明顯的影響，在Fe2+為1、10 μmol/L時，生物膜較光滑，F(xiàn)e2+為50、100 μmol/L時生物膜形成的褶皺較多。鐵是許多需氧微生物的必需元素，在電子轉(zhuǎn)移和許多其他酶反應(yīng)中是主要成分。其在生物膜的形成中發(fā)揮著重要的作用[19]，細(xì)胞內(nèi)的鐵是生物膜發(fā)育的信號分子[20]，適當(dāng)濃度的鐵會促進(jìn)生物膜的形成。

圖4 不同生長條件對生物膜形成的影響Fig.4 Effects of different cultivated conditions on biofilm formation注：圖中字母相同表示無顯著性差異(P<0.05),字母不同表示存在顯著性差異(P<0.05)(下同)

圖4-e顯示，低濃度的Ca2+可以促進(jìn)生物膜的形成，高濃度則會抑制生物膜的形成，不同濃度的Ca2+對BS168與BS168-ΔsinR形成生物膜的能力相接近。當(dāng)Ca2+為0.01 mmol/L時，2株菌形成生物膜的OD570nm值最高。當(dāng)Ca2+濃度為10 mmol/L時，2株菌幾乎不形成生物膜。鈣對生物膜影響是可以通過生理依耐性吸附過程和生物膜形成的信號分子來產(chǎn)生[21]。

2.3 不同溫度、pH及Mn2+、Fe2+、Ca2+濃度下BS168與BS168-ΔsinR生物膜胞外多糖、胞外蛋白的含量

由圖5、圖6可知，不同培養(yǎng)條件下BS168-ΔsinR胞外多糖與胞外蛋白的相對含量均要高于BS168。2株菌在不同培養(yǎng)條件下胞外多糖與胞外蛋白的含量趨勢相一致，并且在一定的培養(yǎng)條件下重組菌胞外多糖與胞外蛋白含量顯著高于原始菌(P<0.05)。在Mn2+為0.01 mmol/L，F(xiàn)e2+為1 μmol/L，Ca2+為0.01 mmol/L時BS168、BS168-ΔsinR分別在溫度為37 ℃、pH值為7和溫度為40 ℃、pH值為8的條件下糖和蛋白含量處于最高值，表現(xiàn)出OD490nm和OD280nm值最高。這與生物膜的形成量幾乎吻合。生物膜的主要成分是由胞外蛋白與胞外多糖等組成，因此生物膜的含量會影響胞外多糖與胞外蛋白的含量。

圖5 不同生長條件下生物膜胞外多糖含量Fig.5 Effects of different cultivated conditions on the concentration of exopolysaccharides

圖6 不同生長條件對生物膜胞外蛋白的影響Fig.6 Effects of different cultivated conditions on concentration of extracellular proteins

2.4 不同溫度、pH及Mn2+、Fe2+、Ca2+濃度下BS168與BS168-ΔsinR生物膜形成量與維生素K2生物合成量的比較

由圖7可知重組菌在相應(yīng)的溫度、pH、及Mn2+、Fe2+、Ca2+濃度下合成維生素K2的能力顯著高于出發(fā)菌株(P<0.05)。2株菌的維生素K2合成能力均與其生物膜的成膜能力密切相關(guān)。在生物膜成膜能力較強(qiáng)時，維生素K2的合成量也相對較高。

由圖7-a、圖7-b可知隨著溫度、pH的升高，2株菌生物膜的形成能力和維生素K2的合成能力均是先升后降，在溫度為37 ℃和40 ℃時菌株成膜能力佳，溫度為40 ℃時維生素K2的合成量達(dá)到最高，BS168維生素K2的合成量為56.5 mg/L，BS168-ΔsinR維生素K2的合成量為88.6 mg/L；在pH值為8.0，生物膜形成量與維生素K2合成量均處于較高值，其中BS168維生素K2的合成量為53.2 mg/L，BS168-ΔsinR維生素K2的合成量為97.3 mg/L。因此溫度為40 ℃、pH值為8.0是發(fā)酵過程中較為適合生物膜形成和維生素K2合成的條件。有趣的是BS168-ΔsinR在45 ℃ 時形成生物膜的OD570nm較高，但其維生素K2的合成量卻相對較低。我們發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵后期45 ℃培養(yǎng)條件下生物膜的溶解要早于其他的培養(yǎng)溫度，維生素K2是發(fā)酵后期的產(chǎn)物，所以生物膜的過早溶解可能會降低維生素K2的合成量。

圖7 不同生長條件下維生素K2的測定Fig.7 Effects of different cultivated conditions on the concentration of formation of vitamin K2

由圖7-c可知,Mn2+為0.01 mmol/L時2株菌生物膜形成量最佳，在Mn2+為0.1 mmol/L時，維生素K2的合成量達(dá)到最高，BS168維生素K2的合成量為96.4 mg/L，BS168-ΔsinR維生素K2的合成量為110.8 mg/L；由圖7-d可知，F(xiàn)e2+為1 μmol/L時，2株菌成膜能力最強(qiáng)；在Fe2+為50 μmol/L時，維生素K2的合成能力最強(qiáng)，其中BS168維生素K2的合成量為94.4 mg/L，BS168-ΔsinR維生素K2的合成量為106.7 mg/L。由圖7-e可知，Ca2+為0.01 mmol/L時2株菌形成生物膜的OD570nm最高，在Ca2+為1 mmol/L 時，維生素K2的合成量最大，BS168維生素K2的合成量為85.3 mg/L，BS168-ΔsinR維生素K2的合成量為96.8 mg/L。在這3種金屬離子中添加Mn2+對于提高維生素K2產(chǎn)量最為明顯。其中BS168維生素K2的產(chǎn)量提高了73%。BS168-ΔsinR維生素K2的產(chǎn)量提高了44%。相比于BS168-ΔsinR，金屬離子的添加對BS168合成維生素K2的能力尤為明顯。相關(guān)文獻(xiàn)報道維生素K2的產(chǎn)量與生物膜的形成量有關(guān)，添加適當(dāng)?shù)慕饘匐x子可以促進(jìn)生物膜的形成，但本實驗中形成生物膜最佳的金屬離子濃度并不是合成維生素K2最高的金屬離子濃度。合成維生素K2最高的金屬離子濃度均要高于形成生物膜最佳時的金屬離子濃度。我們猜測金屬離子的添加可能會參與發(fā)酵后期相關(guān)代謝物的反應(yīng)，影響維生素K2合成的同時也影響了生物膜的形成。

3 結(jié)論

sinR是枯草芽胞桿菌生物膜形成的轉(zhuǎn)錄抑制因子，它編碼的SinR蛋白與DNA的結(jié)合導(dǎo)致epsA-O和tapA-sipW-tasA操縱子的抑制[22-24]，這2個操縱子都參與生物膜基質(zhì)多糖和蛋白質(zhì)的產(chǎn)生?？莶菅堪麠U菌BS168通過敲除生物膜形成的關(guān)鍵調(diào)控基因sinR，不僅增強(qiáng)了BS168-sinR菌株生物膜的形成能力，而且增強(qiáng)菌株在高溫和弱酸弱堿性環(huán)境的生長能力和在發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)物維生素K2的合成能力。

近年來，有關(guān)枯草芽胞桿菌生物膜的研究主要通過分析培養(yǎng)條件(溫度、pH、金屬離子、接觸面材料性質(zhì)等)和生物膜形成的相關(guān)基因?qū)ι锬ば纬傻挠绊戇M(jìn)行研究。對于提高維生素K2的產(chǎn)量，研究多集中在通過菌種誘變、培養(yǎng)基優(yōu)化以及代謝關(guān)鍵基因改造提高其產(chǎn)量[24-28]，對有關(guān)通過提高菌株生物膜的形成量來提高維生素K2的產(chǎn)量還未曾報道。因此本文通過培養(yǎng)條件和生物膜的關(guān)鍵調(diào)控基因與枯草芽胞桿菌BS168生物膜的形成作用進(jìn)行了分析，再進(jìn)一步比較其與維生素K2的生物合成量的關(guān)系。本研究結(jié)果為深入探究sinR基因參與枯草芽胞桿菌生物膜形成的機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)及提高維生素K2合成產(chǎn)量提供參考依據(jù)。