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        制革固體廢棄物的熱-酶結(jié)合法制備明膠的研究

        2021-08-02 12:26:36高沛汝王力源
        關(guān)鍵詞:工藝

        鄭 翔,高沛汝,秦 夢(mèng),王力源

        (河北省微生物研究所,河北 保定 071000)

        明膠(Gelatin)呈白色或淡黃色,通常是由豬、牛等動(dòng)物的骨、皮、肌腱或膜等結(jié)締組織的膠原蛋白經(jīng)降解而成。明膠具有原料廣泛,環(huán)??山到獾戎T多優(yōu)點(diǎn),被譽(yù)為“工業(yè)味精”,在食品加工、醫(yī)藥、化妝品、化工等許多領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用[1-2]。

        傳統(tǒng)的明膠制備工藝主要包括酸法和堿法,通常使用硫酸、磷酸、石灰、氫氧化鈉或純堿等對(duì)明膠生產(chǎn)原料進(jìn)行預(yù)處理,然后在明膠提取和純化過(guò)程中需用到大量的水進(jìn)行清洗及溶出,然后再將水排除[3]。據(jù)統(tǒng)計(jì)每噸皮明膠傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝耗水可達(dá)300t,因此傳統(tǒng)的明膠生產(chǎn)工藝產(chǎn)生了大量的廢水污染[4]。與酸堿法相比,酶法具有周期短、用水少、污染小等優(yōu)點(diǎn),酶法即用酶處理使膠原溶解并經(jīng)過(guò)加熱變性而成為明膠的方法[5]。國(guó)內(nèi)外均開(kāi)展了酶法提取制備明膠的研究,如利用芽孢桿菌蛋白酶水解骨膠原制取明膠[6],利用谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶制備牛皮明膠[7]等。雖然對(duì)酶法制備明膠的研究進(jìn)行已久,由于酶具有特異性,在制取明膠的過(guò)程中酶的種類(lèi)篩選至關(guān)重要;且由于酶法產(chǎn)率較低、水解反應(yīng)程度較難控制等原因,酶法一直沒(méi)有得到大規(guī)模推廣[8]。

        本研究采用熱處理與酶水解相結(jié)合的方式處置制革皮廢料制備明膠[9-10],不僅能夠?qū)χ聘锕腆w廢棄物進(jìn)行清潔化處置,還可對(duì)其資源化利用制備明膠[11]。酶法利用廢棄物制備明膠工藝的建立,為制革工業(yè)的綠色發(fā)展提供了技術(shù)支撐。

        1 試驗(yàn)材料與設(shè)備

        1.1 試驗(yàn)材料

        牛皮廢料(制革鞣制工藝前裁剪的皮邊角廢料)來(lái)自無(wú)極景森皮革制品有限公司;胃蛋白酶(3000U/g)購(gòu)自北京博奧拓達(dá)科技有限公司;中性蛋白酶(5萬(wàn)U/g)、堿性蛋白酶(20萬(wàn)U/g)、酸性脂肪酶(4000U/g)、脂肪酶(4000U/g)、堿性脂肪酶(4000U/g)購(gòu)自滄州夏盛酶生物技術(shù)有限公司;蛋白Marker(40~300kDa)購(gòu)自北京聚合美生物科技有限公司;鹽酸、氫氧化鈉等購(gòu)自北京化工廠。

        1.2 試驗(yàn)設(shè)備

        蛋白電泳儀(君意公司);凝膠成像儀(天能公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠);數(shù)字粘度計(jì)(上海佑科儀器儀表有限公司);高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(北京市永光明醫(yī)療儀器廠);電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海齊欣科學(xué)儀器有限公司)。

        2 試驗(yàn)方法

        2.1 不同制備明膠工藝的比較

        采用凱氏定氮法和索氏抽提法分別對(duì)牛皮廢料的主要成分進(jìn)行測(cè)定。

        皮廢料的預(yù)處理:取皮料100g,切成1×3cm2的小條,水洗數(shù)次備用。

        皮廢料的水解處理:酸法、堿法、酶法和熱-酶法水解廢料(表1)。其中復(fù)合酶解處理工藝溫度35℃,酶解8h,酶的添加量1020U/g(酶/皮重=1%)。

        表1 不同制備明膠工藝的比較

        皮廢料的后處理:在溶液初始pH 5、60℃的條件下提膠7h[12],之后過(guò)濾、濃縮、烘干制成明膠。其中酶處理的廢料在水解工藝后80℃水浴5min酶滅活處理。

        2.2 熱-酶結(jié)合法制備明膠的酶解工藝優(yōu)化

        將預(yù)處理后的皮廢料放置于燒杯中,加入2倍的蒸餾水,70℃水浴1h。冷卻至室溫備用。

        2.2.1 酶制劑種類(lèi)的篩選

        本研究采用的是蛋白酶與脂肪酶混合制成的復(fù)合酶制劑,其中蛋白酶與脂肪酶的酶活比例為50∶1。三種酶制劑組成分別為復(fù)合酶1:胃蛋白酶與酸性脂肪酶,最適pH為3;復(fù)合酶2:中性蛋白酶與脂肪酶,最適pH為7;復(fù)合酶3:堿性蛋白酶與堿性脂肪酶,最適pH為9。分別采用三種復(fù)合酶處置皮廢料,復(fù)合酶的添加量為1%,以產(chǎn)率及明膠粘度為評(píng)價(jià)指標(biāo),篩選出最佳復(fù)合酶。

        2.2.2 酶解工藝的單因素試驗(yàn)

        在篩選到最適的酶制劑種類(lèi)后,對(duì)酶解反應(yīng)過(guò)程中應(yīng)控制溫度、時(shí)間、加酶量等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,以便發(fā)揮酶的最佳催化活性,同時(shí)保證膠原適度降解。

        在酶解溫度35℃,酶解時(shí)間8h的條件下,探究不同加酶量0.5%、0.75%、1.00%、1.25%、1.5%對(duì)制備明膠的影響。

        在酶解時(shí)間8h,加酶量1.00%的條件下,探究不同酶解溫度30℃、35℃、40℃、45℃、50℃對(duì)制備明膠的影響。

        在酶解溫度35℃,加酶量1.00%的條件下,探究不同酶解時(shí)間4h、6h、8h、10h、12h對(duì)制備明膠的影響。

        2.2.3 酶解工藝的正交優(yōu)化

        在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以產(chǎn)率和粘度為評(píng)價(jià)指標(biāo),以酶解溫度、酶解時(shí)間、加酶量為影響因素,每個(gè)因素取三水平,選用L9(34)正交試驗(yàn)對(duì)酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化,正交試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表2。

        表2 酶解工藝正交試驗(yàn)因素水平表

        2.3 熱-酶法制備明膠的后處理

        將酶解工藝的皮廢料進(jìn)行酶滅活處理后,在pH 5、60℃的條件下提膠7h,將酶解所引起的化學(xué)變化顯示出來(lái),溶出膠原蛋白分子的三角螺旋結(jié)構(gòu)而成為明膠溶液。然后采用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)在真空度-0.1MPa,加熱溫度70℃,轉(zhuǎn)速80r/min的條件下濃縮明膠溶液。膠液濃縮后通過(guò)干燥、粉碎即可獲得明膠。

        2.4 明膠性狀的感官評(píng)價(jià)及成分測(cè)定

        產(chǎn)率的測(cè)定:明膠產(chǎn)率=(明膠干重/生皮質(zhì)量)×100%

        粘度測(cè)定:明膠的粘度是明膠應(yīng)用的重要指標(biāo),將配置成6.67%的溶液,在60℃條件下采用數(shù)字粘度計(jì)對(duì)明膠粘度進(jìn)行測(cè)定。

        分子量測(cè)定:配制成2%的明膠溶液用SDS-PAGE方法測(cè)量明膠分子量。

        依據(jù)GB 6783—2013《國(guó)家食品安全標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑 明膠》對(duì)明膠的性狀進(jìn)行評(píng)定,同時(shí)依據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)對(duì)明膠的水分和重金屬含量進(jìn)行測(cè)定。

        3 結(jié)果與分析

        對(duì)制革鞣制前的牛皮邊角廢料的成分進(jìn)行分析測(cè)定,發(fā)現(xiàn)其含有的主要成分為水、粗蛋白和粗脂肪,如表3所示。其中粗蛋白含量為20%-25%,是其最有價(jià)值的組分,后續(xù)對(duì)其蛋白組分進(jìn)行再利用。

        表3 牛皮原料中主要成分的含量

        3.1 不同制備方法對(duì)明膠的影響

        本試驗(yàn)分別采用酸法、堿法、酶法、熱—酶法制備明膠,比較所得明膠的產(chǎn)率及粘度結(jié)果如表4所示。使用酸法制備明膠,產(chǎn)率最高;使用堿法制備明膠,所得明膠粘度最大;而酶法制備明膠的產(chǎn)率最低,明膠粘度介于酸法和堿法之間。酶法制備明膠的產(chǎn)率較低是限制酶法推廣的重要原因。熱—酶法與酶法相比,明膠產(chǎn)率及粘度均有提高。因此,選用熱—酶法對(duì)制備明膠的工藝進(jìn)行優(yōu)化,以進(jìn)一步提高明膠的產(chǎn)率和粘度。

        表4 不同制備明膠方法的比較

        3.2 熱-酶法結(jié)合制備食用明膠工藝優(yōu)化結(jié)果

        3.2.1 酶種類(lèi)的篩選結(jié)果

        分別用三種復(fù)合酶按照酶解及后處理工藝制備明膠,所得明膠的產(chǎn)率和粘度如表5所示。復(fù)合酶3與復(fù)合酶1、2相比,在明膠產(chǎn)率和粘度上均最高。因此,選用復(fù)合酶3,即堿性蛋白酶與堿性脂肪酶應(yīng)用在明膠制備工藝中。

        表5 不同復(fù)合酶對(duì)制備明膠的影響

        3.2.2 加酶量對(duì)制備明膠的影響

        不同酶添加量對(duì)明膠的產(chǎn)率和粘度的影響結(jié)果見(jiàn)圖1,當(dāng)?shù)孜餄舛燃磁FU料的量在一定范圍內(nèi),酶解反應(yīng)速率和酶濃度成正比,在加酶量為1.25%時(shí),明膠的產(chǎn)率和粘度均達(dá)到最大值。

        圖1 加酶量對(duì)制備明膠質(zhì)量的影響

        3.2.3 酶解溫度對(duì)制備明膠的影響

        由圖2可知當(dāng)酶解溫度為45℃時(shí),明膠產(chǎn)率和粘度均最大。表明在此溫度下,復(fù)合酶對(duì)牛皮的降解效果最好。而溫度較高時(shí),酶容易將膠原降解為短鏈,酶解結(jié)束后被水洗掉,造成明膠產(chǎn)率和粘度的降低。

        圖2 酶解溫度對(duì)制備明膠的影響

        3.2.4 酶解時(shí)間對(duì)制備明膠的影響

        由圖3可知,當(dāng)酶解時(shí)間小于8h時(shí),明膠的產(chǎn)率隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,隨后明膠的產(chǎn)率逐漸降低。這主要是因?yàn)槊附夥磻?yīng)過(guò)長(zhǎng),膠原主鏈被降解,而斷裂的肽鍵在水洗時(shí)會(huì)流失,明膠粘度主要和分子鏈的長(zhǎng)短有關(guān),分子鏈越短,其溶液的粘度也就越低。

        圖3 酶解時(shí)間對(duì)制備明膠的影響

        3.2.5 酶解工藝的優(yōu)化結(jié)果

        在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以產(chǎn)率和粘度為評(píng)價(jià)指標(biāo),以酶解溫度、酶解時(shí)間、加酶量為影響因素,進(jìn)行正交試驗(yàn)對(duì)酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化。正交試驗(yàn)結(jié)果如表6所示。

        表6 酶解工藝的正交試驗(yàn)結(jié)果

        酶解時(shí)間、酶解溫度、加酶量均為影響明膠的重要因素。由極差分析結(jié)果可知,在酶解反應(yīng)過(guò)程中,3個(gè)因素對(duì)制備明膠影響的主次順序?yàn)椋好附鈺r(shí)間>加酶量>酶解溫度。最佳酶解反應(yīng)條件為A3B2C1,即酶解時(shí)間10 h、酶解溫度45℃、加酶量1.00%。

        3.2.6 后處理加工

        采用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去水分,濃縮膠液后再通過(guò)干燥、粉碎等步驟即可獲得明膠制品。

        圖4 明膠固體制品

        3.3 明膠的各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定

        3.3.1 明膠產(chǎn)率、粘度計(jì)分子量測(cè)定

        經(jīng)測(cè)定固體明膠與生皮質(zhì)量得出明膠產(chǎn)率為21.87%,明膠的粘度為3.65mPa·s。天然膠原由三條左手螺旋結(jié)構(gòu)的單肽鏈相互纏繞形成右手超螺旋結(jié)構(gòu),其中單鏈(α 鏈)的分子量大約為1.0×105g/mol。隨著動(dòng)物年齡的老化,膠原鏈間會(huì)發(fā)生交聯(lián),最終以 β 鏈(兩條交聯(lián)肽鏈)或 γ 鏈(三條交聯(lián)肽鏈),甚至分子量更高的組分形式存在。采用SDS-PAGE方法測(cè)量明膠分子量結(jié)果如圖5所示。在100kDa處有兩條明顯的條帶,說(shuō)明所制得明膠的 α 鏈含量較高;在180kDa和300kDa處,也有條帶存在但不明顯,說(shuō)明所制得明膠的 β 鏈、γ 鏈含量較低。

        圖5 明膠分子量分布情況

        3.3.2 明膠感官指標(biāo)評(píng)定和理化性質(zhì)測(cè)定

        依據(jù)《國(guó)家食品安全標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑 明膠》(GB 6783—2013)對(duì)明膠進(jìn)行感官評(píng)定同時(shí)對(duì)各項(xiàng)理化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。試驗(yàn)結(jié)果如表7、表8所示。

        表7 明膠的感官指標(biāo)

        表8 明膠的各項(xiàng)理化指標(biāo)

        4 結(jié)論

        通過(guò)對(duì)不同制備明膠方法的比較,選擇熱—酶法處置制革生皮邊角廢料制備明膠。此法屬于清潔化方法,而且與未經(jīng)熱處理的酶法相比,在明膠產(chǎn)率和粘度上均有提高。本試驗(yàn)得出制備明膠的最佳工藝為:牛皮邊角料70℃熱處理1h;添加1.00%的含有堿性蛋白酶與堿性脂肪酶的復(fù)合酶,在45℃的條件下酶解10h;之后在80℃的條件下酶滅活處理5min;提膠條件為在溶液初始pH 5、60℃的條件下提膠7h;最終經(jīng)分離、濃縮、干燥、粉碎等處理后制得明膠。經(jīng)測(cè)定明膠的粘度為3.65mPa·s,灰分含量為0.72%,含水量為12.20%,凝膠強(qiáng)度為86Bloom g,水不溶物含量為0.16%。熱-酶法處置制革固廢制備明膠工藝的建立,不僅能提升固廢的清潔化處理水平還能實(shí)現(xiàn)其資源化利用,有利于制革工藝的綠色發(fā)展。

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