陳勝樂， 米盼盼**， 許雅芳， 史學(xué)雙， 樊國峰， 王一鳳， 賈俊玲

(1.河北中石油中心醫(yī)院 骨科， 河北 廊坊 065000； 2.河北中石油中心醫(yī)院 影像科， 河北 廊坊 065000； 3.河北中石油中心醫(yī)院 病案科， 河北 廊坊 065000)

健康人群中腰椎間盤突出癥(lumbar disc herniation，LDH)的高發(fā)年齡為30～40歲，50歲以后發(fā)病率可達(dá)90%[1]。LDH的主要臨床表現(xiàn)為復(fù)發(fā)性腰腿痛，伴有患肢麻木和肌無力，男性偶爾伴有腹股溝或睪丸疼痛，嚴(yán)重者壓迫馬尾神經(jīng)，引起下肢麻木、肛周疼痛、會陰麻木及括約肌麻痹等癥狀[2]。目前臨床上對LDH的發(fā)病機(jī)制尚未完全了解，但有學(xué)者支持的LDH病因病機(jī)主要有機(jī)械壓迫理論、炎癥反應(yīng)理論、自身免疫理論和生物力學(xué)改變理論[3]。核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)是一種廣泛存在于細(xì)胞質(zhì)中的核轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞刺激后的信號通路中發(fā)揮作用，它通過調(diào)節(jié)趨化因子、黏附分子、生長因子和多種酶的基因表達(dá)，在炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)和細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用[4-5]。近年來，通過動物實(shí)驗(yàn)觀察椎間盤退變模型和人椎間盤退變髓核細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)退變髓核細(xì)胞中NF-κB的陽性表達(dá)率較高，因此NF-κB信號通路通常被認(rèn)為與LDH有關(guān)[6]。miRNA是不編碼蛋白質(zhì)的單鏈RNA，miR-141-3p基因位于14號染色體，參與腫瘤的發(fā)生，其在不同腫瘤組織中的表達(dá)水平也不同[7-8]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)miR-141-3p參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長，對不同的腫瘤細(xì)胞有不同的作用[9]，miR-141-3p還可通過靶向作用于腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子5(tumor necrosis factor receptor-associated factor-5，TRAF5)和腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor-6，TRAF6)而對NF-κB的激活產(chǎn)生抑制作用，進(jìn)而抑制前列腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，提示miR-141-3p與NF-κB信號通路活化存在一定的關(guān)系[10]。本研究自體髓核回植法成功制備LDH大鼠模型，麻醉后取出大鼠髓核組織細(xì)胞培養(yǎng)，觀察miR-141-3p對髓核組織細(xì)胞的調(diào)控作用，探討NF-κB信號通路與LDH的相關(guān)性和miR-141-3p對LDH模型大鼠NF-κB信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 選取20只8周齡雄性SD大鼠，清潔級、3月齡、體質(zhì)量(198.68±7.55)g，由湖南省中醫(yī)藥研究院動物實(shí)驗(yàn)室購入，合格證號為SCXK(湘)2021-0318，自體髓核回植法[11]成功建立腰椎間盤突出大鼠模型18只。

1.1.2試劑與儀器 胎牛血清和RPMI 1640培養(yǎng)基(南京生航生物技術(shù)有限公司)，Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen)，miR-141-3p mimics及其對照(廣州市銳博生物科技有限公司)，Trizol試劑及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司)，四甲基偶氮唑藍(lán)試劑(MTT,美國Amresco)，蛋白提取和檢測試劑(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，NF-κB信號通路相關(guān)抗體(美國Cell Signaling Technology公司)；日立投射電子顯微鏡(型號H-7650，上海筑金分析儀器有限公司)，離心機(jī)(型號BT-1500，丹東百特儀器有限公司)。

1.2 研究方法

1.2.1模型制備[11]腹腔注射10%水合氯醛后，大鼠俯臥位固定，常規(guī)準(zhǔn)備背部和尾部手術(shù)區(qū)域，進(jìn)行備皮和消毒，先切開兩個尾盤，開放的椎間盤應(yīng)包含上下軟骨終板，刺破椎間盤上下板暴露髓核，用7號手術(shù)線將椎間盤包裹成“米”形待用；依次切開皮膚組織，使L5/L6椎間隙和L5神經(jīng)根暴露，將準(zhǔn)備好的橈側(cè)椎間盤置入左側(cè)L5神經(jīng)根，并縫合。術(shù)后3 d內(nèi)每日腹腔注射青霉素[80萬U/(kg·d)]。造模第3天，采用Siegal神經(jīng)功能六級評分法[12]評定大鼠神經(jīng)功能，評分>2級(>6分)為建模成功。

1.2.2分組及轉(zhuǎn)染 將18只大鼠處死后取出髓核組織分為miR-141-3p mimics轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染miR-141-3p陰性對照組及不進(jìn)行轉(zhuǎn)染正常對照組，每組6例；轉(zhuǎn)染組大鼠體質(zhì)量(201.68±6.49)g，陰性對照組大鼠體質(zhì)量(197.72±3.56)g，正常對照組大鼠體質(zhì)量(199.36±5.94)g。麻醉后處死大鼠，在解剖顯微鏡下用眼科手術(shù)器械去除大鼠背部皮膚和軟組織，取出椎間盤，去除環(huán)纖維和軟骨板，將提取的髓核組織置于含DMEM(0.1%小牛血清)1 mL的12孔板，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后，每1～2 d更換1次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞融合度>85%時，加入胰蛋白酶消化傳代，將對數(shù)型髓核細(xì)胞接種于6孔板上，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)到50%時，加入無血清培養(yǎng)基同步處理12 h，按說明書進(jìn)行Lipofectamine 2000試劑轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞均置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6 h后換用正常培養(yǎng)基，共培養(yǎng)48 h。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1細(xì)胞活力 采用MTT法測定，各組細(xì)胞均培養(yǎng)48 h，于每孔內(nèi)均加入MTT溶液20 μL，37 ℃孵育4 h， 加入DMSO 150 μL，搖動10 min，然后將樣品置于酶標(biāo)儀上，490 nm處檢測吸光度值，計算細(xì)胞活性，細(xì)胞活性(%)=轉(zhuǎn)染組或陰性對照組吸光度值/正常對照組吸光度值×100%。

1.3.2細(xì)胞侵襲能力 細(xì)胞濃度調(diào)整為2×107個/L，將細(xì)胞懸液接種于包被或不包被Matrigel膠的Transwell上室中，培養(yǎng)液添加到下室；培養(yǎng)24 h后，用4%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色，顯微鏡下觀察5個隨機(jī)視野內(nèi)結(jié)晶紫染色細(xì)胞數(shù)為細(xì)胞浸潤數(shù)。

1.3.3細(xì)胞凋亡率 采用流式細(xì)胞儀檢測，將5×105對數(shù)生長的髓核細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，收集懸浮和貼壁細(xì)胞，在Annexin V-FITC488和PI溶液中室溫避光孵育15 min，測定3次計算平均值。

1.3.4炎性指標(biāo) 培養(yǎng)48 h后，以ELISA法檢測髓核細(xì)胞中白細(xì)胞介素-1(interleukin-1，IL-1)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、紅細(xì)胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate，ESR)、C反應(yīng)蛋白(C-reactiveprotein，CRP)水平。將抗原使用包被稀釋液稀釋至適當(dāng)濃度，每孔加入抗原100 μL，置于37 ℃下反應(yīng)4 h，棄孔中液體；將5%小牛血清置于37 ℃下封閉40 min，結(jié)束后使用洗滌液洗滌3次、3 min/次；將1 ∶50稀釋的樣品加入酶標(biāo)反應(yīng)孔內(nèi)，確保每個樣本雙孔，100 μL /孔，置于37 ℃下反應(yīng)60 min，洗滌液洗滌3 min；加入酶標(biāo)抗體，置于37 ℃下反應(yīng)60 min，加洗滌液洗滌；加入底物液，置于37 ℃下避光放置5 min，加入終止液，加入顯色劑50 μL，震蕩均勻后于37 ℃下避光顯色15 min；每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)； 15 min后測定450 nm波長時各孔的吸光度值。

1.3.5NF-κB信號通路相關(guān)蛋白水平 采用Western blot法檢測，提取髓核細(xì)胞總蛋白，用二喹啉甲酸法測定蛋白質(zhì)濃度，對等量蛋白樣本進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移到二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)上，密封于5%脫脂奶粉中，用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBST)洗滌3次，加入核因子κB磷酸化65(nuclear factor kappa-B phosphorylation 65，NF-κB p65，1 ∶800)、IκB激酶α(IκB kinase-α，IKK-α)、磷酸化IκB激酶α(phosphorylation IκB kinase-α，p-IKK-α)、IκB激酶α抗體(IκB-kinase α antibody，IKB-α)、磷酸化IκB激酶α抗體(phosphorylation IκB-kinase α antibody，p-IKB-α，1 ∶1 000)相應(yīng)的一抗，在4 ℃培養(yǎng)過夜。PBST洗滌3次，加入二抗(1 ∶3 000)，室溫下孵育2 h，PBST洗滌3次，加入電化學(xué)發(fā)光試劑，以β-actin作為內(nèi)參，暗室內(nèi)凝膠成像系統(tǒng)拍照，使用Image J軟件分析條帶灰度值。

1.3.6NF-κB信號通路相關(guān)mRNA水平 采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative reverse，qRT-PCR)檢測，從培養(yǎng)48 h的髓核細(xì)胞中提取RNA，并測定純度和濃度，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照熒光定量試劑盒的說明進(jìn)行PCR。NF-κBp65的上游引物為AGCGTAGCTTATCAGACTGATG，下游引物為TAGCTTATCAGACTGATGTTGA；IKK-α的上游引物為CAGTGCAATGATGAAAGGGCAT，下游引物為CAGTGCAATGATGAAAGGGCAC；IKB-α的上游引物為GTCGTATCCAGTGCAGGGTGAC，下游引物為CGCAGGGTCCGAGGTATTCTCG。95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)，60 ℃最后延長5 min，產(chǎn)物200 bp，以β-actin為內(nèi)標(biāo)，用2-△△Ct法計算相對表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞活力、侵襲及凋亡率比較

培養(yǎng)48 h時，轉(zhuǎn)染組髓核組織的細(xì)胞活力、細(xì)胞侵襲個數(shù)低于陰性對照組和正常對照組，凋亡率高于陰性對照組和正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1、圖1～3。

表1 各組髓核組織培養(yǎng)48 h時細(xì)胞活力、侵襲及凋亡率Tab.1 Cell viability, invasion, and apoptosis of nucleus pulposus tissue cultured for 48 h in each

注：A為轉(zhuǎn)染組，B為陰性對照組，C為正常對照組。圖1 各組髓核組織培養(yǎng)48 h時細(xì)胞活力Fig.1 Cell viability of nucleus pulposus tissue cultured for 48 h in each group

2.2 髓核組織IL-1、IL-10、TNF-α、ESR及CRP表達(dá)

結(jié)果顯示，3組髓核組織培養(yǎng)48 h時的IL-1、TNF-α、ESR、CRP水平比較，轉(zhuǎn)染組<陰性對照組<正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)； IL-10水平比較，轉(zhuǎn)染組>正常對照組>陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組髓核組織培養(yǎng)48 h時IL-1、IL-10、TNF-α、ESR及CRP水平Tab.2 Comparison of IL-1,IL-10,TNF-α,ESR, and CRP levels of nucleus pulposus tissue cultured for 48 h in each group

2.3 NF-κB信號通路相關(guān)因子水平

結(jié)果顯示，培養(yǎng)48 h時，轉(zhuǎn)染組NF-κB p65、IKK-α、p-IKK-α、IKB-α及p-IKB-α水平低于陰性對照組和正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖4和表3。

表3 各組髓核組織培養(yǎng)48 h時NF-κB信號通路相關(guān)因子水平Tab.3 The levels of NF-κB signaling pathway related factors in nucleus pulposus tissue culture for 48 h in each group

圖4 各組髓核組織培養(yǎng)48 h時NF-κB信號通路相關(guān)因子水平(Western blot)Fig.4 The levels of NF-κB signaling pathway related factors in nucleus pulposus tissues cultured for 48 h in each group (Western blot)

2.4 NF-κB信號通路相關(guān)因子mRNA水平

結(jié)果顯示，培養(yǎng)48 h時，轉(zhuǎn)染組NF-κBp65、IKK-α及IKB-αmRNA水平低于陰性對照組和正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 各組髓核組織培養(yǎng)48 h時NF-κB信號通路相關(guān)因子mRNA水平比較Tab.4 Comparison of mRNA levels of NF-κB signaling pathway related factors cultured for 48 h in each group

轉(zhuǎn)染組 陰性對照組 正常對照組圖2 各組髓核組織培養(yǎng)48 h時侵襲細(xì)胞個數(shù)(結(jié)晶紫染色，×200)Fig.2 Number of invasive cells in each group of nucleus pulposus tissue cultured for 48 h (crystal violet staining, ×200)

轉(zhuǎn)染組 陰性對照組 正常對照組圖3 各組髓核組織培養(yǎng)48 h時細(xì)胞凋亡率Fig.3 Apoptosis of nucleus pulposus tissue cultured for 48 h in each group

3 討論

臨床中已經(jīng)明確椎間盤退變是一系列脊柱退行性疾病發(fā)生的前提和基本病理過程，椎間盤退變是由細(xì)胞生物學(xué)、機(jī)械應(yīng)力、營養(yǎng)、免疫和年齡的變化引起的，相關(guān)的臨床癥狀包括LDH、頸椎和腰椎神經(jīng)根病、頸脊髓病和椎間盤源性腰痛，可導(dǎo)致脊柱損傷甚至殘疾，影響正常生活和工作，但其確切發(fā)生機(jī)制尚不清楚[13-14]。NF-κB是一種廣泛存在于真核細(xì)胞中的多向轉(zhuǎn)錄因子，最早從成熟的B淋巴細(xì)胞中提取，可與IgK輕鏈基因結(jié)合，以多種方式在細(xì)胞增殖、分化和凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用[15]。NF-κB的異常激活增強(qiáng)了其轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而觸發(fā)細(xì)胞間信號級聯(lián)，導(dǎo)致一系列疾病[16]。近年來的研究表明，NF-κB信號通路在椎間盤退變中起重要作用，抑制NF-κB信號通路可延緩椎間盤退變過程[17]，但NF-κB信號通路的激活途徑尚不清楚。

miRNA的長度約為15～25 bp，在人體組織中廣泛表達(dá)，參與了幾乎所有的生理過程，如胚胎發(fā)育和組織功能維持[18]。miRNA還參與心血管疾病、腫瘤和其他病理過程的調(diào)控，是一種與細(xì)胞生長和凋亡密切相關(guān)的調(diào)節(jié)因子，參與調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞和其他細(xì)胞的正常生理功能，在腫瘤組織中異常表達(dá)，可以作為腫瘤促進(jìn)劑或抑癌劑來調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長[19-20]。目前miR-141-3p在乳腺癌及其他腫瘤組織中已被發(fā)現(xiàn)過表達(dá)， miR-141-3p可能是一種抑癌基因，在腫瘤細(xì)胞的生長和凋亡中起重要作用，如miR-141-3p可抑制胃癌及其他腫瘤細(xì)胞的生長，促進(jìn)前列腺癌及其他腫瘤細(xì)胞的生長[21-22]。因此本研究分析了miR-141-3p對LDH模型大鼠NF-κB信號通路的影響，以為今后臨床治療提供參考。

本研究結(jié)果顯示，培養(yǎng)48 h后轉(zhuǎn)染組髓核組織的細(xì)胞活力、侵襲個數(shù)均低于陰性對照組和正常對照組，凋亡率高于陰性對照組和正常對照組，IL-1、TNF-α、ESR、CRP水平均低于陰性對照組和正常對照組，IL-10水平高于陰性對照組和正常對照組，且正常對照組高于陰性對照組，NF-κB p65、IKK-α、p-IKK-α、IKB-α、p-IKB-α蛋白及其mRNA水平均低于陰性對照組和正常對照組，說明miR-141-3p高表達(dá)能夠抑制NF-κB信號通路的激活，抑制髓核細(xì)胞活力和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，緩解炎癥反應(yīng)。這是由于正常狀態(tài)下激活NF-κB信號通路可誘導(dǎo)炎癥因子的表達(dá)，誘導(dǎo)腰椎間盤髓核細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)，促進(jìn)腰椎間盤退變，誘導(dǎo)LDH，直接刺激周圍神經(jīng)組織，產(chǎn)生癥狀[23]。且NF-κB信號通路激活后，NF-κB可誘導(dǎo)腰椎間盤髓核細(xì)胞大量凋亡，導(dǎo)致髓外基質(zhì)的合成，最終導(dǎo)致LDH的退行性病變，導(dǎo)致LDH[24-25]。因此本研究中miR-141-3p在髓核細(xì)胞中的過表達(dá)抑制了NF-κB p65、IKK-α和p-IKK-α等的表達(dá)，提示miR-141-3p可抑制NF-κB信號通路激活，聯(lián)系到臨床中已明確NF-κB在腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲中的作用，推測miR-141-3p在髓核細(xì)胞中的抗增殖和侵襲作用可能與抑制NF-κB信號通路相關(guān)，但具體的調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

綜上所述，miR-141-3p高表達(dá)能夠?qū)F-κB信號通路的激活產(chǎn)生抑制作用，進(jìn)而抑制髓核細(xì)胞活力和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，緩解炎癥反應(yīng)。